Utnytte Kombinert Metoder for å definere rollen til plasmamembranen Levering Under Axon Forgrening og neuronal morphogenesis

Protocol

Erklæringen om forskningsetikk: Alle forsøk med dyr er beskrevet her, er underlagt de regler og forskrifter i UNC Committee on Animal Care og til NIH standarder for omsorg og bruk av forsøksdyr.

1. Forberedelse og plating av Spaltet kortikale nevroner

1. Avlive timet-gravid hunner av CO ₂ innånding fulgt ved halshugging. Fjern hele hjernen fra skallen på embryonale dag 15,5 (E15.5) mus og microdissect cortices fra hver halvkule. For detaljerte instruksjoner om mikrodisseksjon av embryonale mus cortex se Viesselmann et al ^8.
2. Plasser ikke mer enn 4 ekser i 1 ml av dissekere media i et sterilt 1,6 ml mikrorør. Legg 120 mL av 10x trypsin og Snu røret 3 - 5 ganger for å blande.
3. Ved hjelp av en hemocytometer, telle celler til frø cellekultur retter. Merk: 1 kortikale halvkule gir ca.oximately tre millioner celler.
   1. For SDS-resistente SNARE kompleks biokjemi analysen, plate seks millioner celler per 35 mm tallerken og utnytte to retter per tilstand. Merk: Denne forenkles ved hjelp av 6 brønners plater når man sammenligner flere forhold.
   2. For forgrening assays, plate neuroner for salpetersyre vasket sirkulære dekkglass ved en tetthet på 250.000 celler pr 35 mm skål, for DIC avbildning av axon forgrening plate ved en tetthet på 150.000. Disse tettheter unngå overbefolkning og forenkle analysen.
4. For levende celle TIRF mikroskopi, suspendere to millioner nevroner per transfeksjon i nucleofection løsning ved RT.
   1. Tilsett 100 ul cellesuspensjon til mikrorør inneholdende 10 ug VAMP2-pHlourin ekspresjonsplasmid og electroporate med en Nucleofector i overensstemmelse med fabrikantens protokoll ^9.
   2. Etter transfections straks legge 500 mL av trypsin slukke media, fjerne suspensjon fra kuverten og plateceller i et hitetet i 400.000 celler per 35 mm PDL-belagt glassbunn fatet.
5. Plate alle kortikale nevroner i 2 ml serum frie medier.

2. SNARE Complex Formation analysen

Merk: SDS-resistente snare komplekser ble behandlet og analysert som opprinnelig beskrevet ¹⁰ med de endringer som er beskrevet nedenfor. For validerte alternative antistoffer mot de som brukes her, se materialer delen.

1. Stimulere E15.5 kortikale nevroner 2 dager in vitro (DIV) med 250 ng / ml netrin-en eller sham kontroll for en time før lyse.
2. Før behandlingen prøver, kul sentrifuge til 4 ° C, og setter vann badtemperaturen til 37 ° C, og varmeblokk til 100 ° C.
3. Fjern celle retter fra inkubatoren og legg på is.
   1. Sug media fra celler, erstatte med ~ 2 ml iskald Phosphate saltvann (PBS) forsiktig 2 ganger i 1 - 2 minutter per vask.
   2. For denne analysen, bruke 2 brønner per dirigentition.
   3. Aspirer PBS fra den første brønnen av en tilstand og erstatte med 250 mL homogenisering buffer. La på is i 5 min, og deretter ved hjelp av en celle løfter, homogenisere cellene på is.
   4. Aspirer PBS fra den neste brønn i samme tilstand og tilsett nylig homogenisert blandingen til brønnen. Dette vil øke proteinkonsentrasjoner. Gjenta for alle forhold.
   5. Ved fullførelse pipette homogenisert løsning til en på forhånd avkjølt 1,6 ml mikrorør på is og tilsett 20% TritonX-100 for å nå en sluttkonsentrasjon på 1% TritonX-100. Triturate blande 10 ganger med 1000 mL pipette mens bobler minimeres.
4. Inkuber rørene på is i 2 min for å solubilisere proteiner. Etter inkubering, sentrifuger i 10 minutter ved 6010 RCF ved 4 ° C for å pelletere ikke-oppløseliggjort materiale. Flytt lysat supernatanten til nye kjølt 1,6 ml tube på is.
5. Utfør proteinkonsentrasjonen analyse ved hjelp av Bradford assay ¹¹ og fortynne prøvene til et final proteinkonsentrasjon på 3 - 5 mg / ml med resterende homogenisering buffer supplementert med 1% TritonX-100 og 5 x prøvebuffer supplert med B-Mercaptethanol (BME).
6. Del hver eksperimentell prøve jevnt i 2 rør. Inkuber en prøve ved 37 ° C i 30 minutter (Snare komplekser), og den andre ved 100 ° C i 30 min (Snare monomerer). Invertere rør periodisk for å holde prøver i oppløsning.
7. Fryse prøvene ved -20 ° C inntil de er klare for å separere via SDS-PAGE. Før innkjøring prøver via elektroforese ved bruk av standard teknikker, koking tidligere kokte prøver i 5 minutter ved 100 ° C, men tine 37 ° C prøvene ved RT.
8. Kjør duplikater av prøver (30 - 40 mikrogram protein per prøve) på både en 8% og 15% gel; 8% gir ideell separasjon av komplekset, mens 15% er brukt til å kvantifisere SNARE protein monomerer (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa). Oppretthold strømkilde på 70 V til fargestoff linjen er gjennom stackonge gel og øke spenningen til 90V. Kjør gels til fargestoff renner av.
9. For å bevare monomerer, overføre proteiner til 0,2 pm nitrocellulosemembran på is ved hjelp av kald overføringsbuffer med 20% metanol (MeOH) ble tilsatt ved 70 V i 45 minutter.
10. Dry membran i en tildekket skål for 2 timer til O / N på RT (O / N gir de beste resultatene).
11. Blokk Snare sammensatte membraner i 10% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved RT.
12. Fremstille primære antistoff (som gjenkjenner spesifikke SNARE komplekse komponenter) ved en fortynning på 1: 1000 og probe O / N ved 4 ° C på en rotasjonsrister.
    1. Skyll blot i Tris-bufret saltvann plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 ganger i 5 minutter hver.
13. Forbered fluorescerende sekundært antistoff løsninger ved en fortynning på 1: 20000 i 1% BSA i TBS-T og sonde i 1 time, dekket ved RT. Gjenta trinn 2.12.1 etter en time.
14. Bilde blotter på en fluorescerende skanning maskin utstyrt med programvarepakke og kvantifisere både SNARE protein complex (immunreaktive bånd over 40 kDa) og monomer band (immunoreaktive band på 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa for SNAP-25, VAMP2 og syntaxin-1, henholdsvis) ved hjelp av produsentens instruksjoner for å tegne rektangulære ROIs.

3. Imaging Exocytic Hendelser via TIRF Mikroskopi

Merk: Denne protokoll krever spesialmikroskop utstyr inkludert et miljøkammer for å opprettholde temperatur, fuktighet og _CO2, en invertert TIRF mikroskop utstyrt med en epifluorescent belysning, en høy forstørrelse / høy numerisk apertur (NA) TIRF objektiv, et automatisert XYZ trinn, og en følsom Charge Coupled Device (CCD) detektor. Denne protokollen bruker en helautomatisk invertert mikroskop utstyrt med en 100x 1.49NA TIRF objektiv en solid state 491 nm laser og en Electron multiplisere CCD (EM-CCD). Alt utstyr er kontrollert av bildebehandling og laser kontroll programvare. Før begynnelsen bilde protokollen strømmen på environmental kammer, scene, lampe, datamaskin og kamera.

1. Velg mål innenfor bildebehandling. Når målet er på plass, festes det formål varmeren rundt kragen.
2. Bekreft at målet er senket helt før du fester scenen inkubator i den fasen sporet. Hell destillert vann inn i scenen inkubator viker jevnt for å unngå søl.
3. Slå på inkubasjon system. Åpne ventilen til CO ₂ tank og bekreft trykket er hensiktsmessig for systemet i henhold til produsentens instruksjoner. Tillat kammer litt tid å nå 5% CO ₂ og 37 ° C. Før tilsetting bilde fatet, plassere en tom tallerken i kuvøse for å unngå vannkondens på målet.
4. Kraft på laserkilden.
5. Åpen scene inkubator og legge immersjonsolje på objektivet. Plasser prøven i kuvøse og stabil med stabilitet armer eller en tallerken vekt. Hev objektiv inntil oljen kommer i kontakt med bunnen av prøven. switct til overført lys belysning og finne nevronale fokusplanet gjennom okularene.
6. Begynn laser programvare og koble til laserkontroll. Sett belysning til Widefield og velge objektiv som brukes (100X 1,49 NA TIRF anbefales). Sett brytningsindeks av prøven (celler ~ 1,38). Juster laser intensitet ved å fjerne "TTL" for 491 nm laser. Juster glidebryteren til 100 så ta det ned igjen til en verdi mellom 20 - 40%. Kontroller "TTL".
7. Fokus på prøve igjen i overført lys belysning. Gå til bildebehandlingsprogrammer og velg 491 nm laser belysning og åpne lukkeren. Fin justere navet i laser på taket og sentrere punktet til midten av den lukkede feltblenderen med kondensatoren fjernet. Plasser kondensator opp ned på den optiske benken, for ikke å ripe linsen.
8. Bytt kondensator og gå til TIRF programvare og sette inntrengningsdybde (PD) til 110 nm. Bytt fra Widefield belysning til TIRF Illumination modus for bildebehandling.
9. Finn VAMP2-phluorin uttrykke celler gjennom okulars hjelp vidfelt epifluorescence med epifluorescent lyskilde.
   1. Juster bildeparametre (eksponeringstid, gevinst og laser makt) for å maksimere signal til støyforhold og dynamisk område med minimal eksponering tid og laser intensitet for å redusere fotobleking og fototoksisitet (for eksempel: eksponering mellom 50-100 msek, med en 15-30 få 30% maksimal laser makt).
   2. Sett kontinuerlig autofokus per celle. Erverve en timelapse bildesett med oppkjøpet oppstår hvert 0,5 sek i 5 min. For netrin-en stimulert tilstand, legge til 500 ng / ml netrin-en til rett av celler i en laminær hette og returnere parabolen til inkubatoren for en time før bildebehandling.
10. For å kvantifisere hvor ofte exocytic hendelser normalisert per celle området og tid, åpne bilde stabler i ImageJ ved å dra filen inn i vinduet eller gå til Fil> Åpne> Filnavn (figur0; 2A Inset 1).
    1. For å fjerne stabile fluorescerende signaler som ikke representerer vesikkelfusjon hendelser, skape en gjennomsnittlig z projeksjon av hele stabelen ved hjelp av Image> Stack> Z-Project> Projection Type: Normal Intensitet. Trekk fra dette at bildet fra hvert bilde i timelapse hjelp Process> Bilde Kalkulator> Bilde1: stabelen Operation: Trekk Image2 nyopprettede gjennomsnittlig z projeksjon. Dette understreker exocytic hendelser (Figur 2A Innfelte 2-3).
    2. Count exocytic fusjonsbegivenheter av øyet. Exocytic hendelser er definert som utseendet av en diffraksjons-begrenset fluorescens-signal, som raskt diffunderer som VAMP2-phluorin diffunderer inne i plasmamembranen (figur 2A Innfelt 6).
    3. Bruk Threshold kommandoen for å markere det første bildet ved hjelp av Image> Adjust> Terskel> justere glidebryteren til hele cellen er terskelen markert (Figur 2A Inset 7-8).
    4. Under AnaLyze, velger SetMeasurements og sjekke området og vise etiketten. Velg terskel cellulære området ved hjelp av tryllestaven sporing verktøyet og trykk 'm' for å måle (figur 2A Inset 7-8).
    5. Transfer både exocytic fusjonsbegivenheter telle, til celle arealmålinger, og forløpt bildebehandling tid til et regneark beregne antall exocytic hendelser / mm ² / tid (Figur 2A Inset 9).

4. Differential interferens kontrast (DIC) Timelapse Mikroskopi av Axon Forgrening

Merk: En komplett protokoll og demonstrasjon for en generell tilnærming til DIC bildebehandling er tilgjengelig ^12. Mens denne protokollen benytter DIC, kan andre overført lys mikroskopi metoder brukes til samme formål (for eksempel: fasekontrast).

1. På 2 DIV, til sted glassbunn bildebehandling fatet inneholder utransfekterte nevroner i forvarmet miljøkammer opprettholde et fuktig environment med 5% CO ₂ og 37 ° C. Utnytte et mikroskop utstyrt med en 60x Plan-Apochromat, 1,4 NA DIC objektiv og høy NA kondensator for best mulig bildekvalitet og oppløsning.
2. Juster fokusplanet for å finne nevroner gjennom okulars bruker overført lys belysning.
3. Bruke fler området oppkjøpet funksjonen på bildebehandlingsprogrammer, finne og lagre XYZ steder på minst 6 celler. Plasser scenen slik at nerveceller i området passer innenfor synsfeltet for best resultat.
   1. Stimulere med 250 ng / ml netrin-en og trykk på "start multi oppkjøpet området". Sekvensielt hente bilder på hver posisjon hvert 20. sekund i 24 timer, stanse oppkjøp og omstilling som nødvendig.
4. Gjennomgå bilder i bildebehandlingsprogrammer som bruker Apps> Gjennomgå Multi Dimensional data> åpne filnavn. Identifisere stabile axon grener (20 mikrometer lang) som dannes ved bildebehandling økten. Bruk linjetegneverktøyet for å måle en stableaxon branch fra basen på aksonet til spissen for å sikre 20 mikrometer lengde kvalifisering er oppfylt.
   1. I et regneark, spille inn rammenummeret etter netrin stimulering når membran utstikkere starte i områder hvor grenene senere danner samt rammenummeret etter netrin stimulering når begynnende grener nå 20 mikrometer i lengde.
   2. Multipliser antall rammer mellom protrusion og grenen formasjon ved 20 sek å beregne dannelsen gang per gren.

5. toksin manipulasjoner og Fast Cell Immunofluoresence

1. På 2 DIV, behandle nevroner i eksperimentelle forhold med 250 ng / ml netrin-en og / eller 10 nM Botulinum A toksin (Bonta), som spalter SNARE protein SNAP25 og effektivt hemmer SNARE mediert eksocytose ^13, pluss 250 ng / ml netrin- 1. La ett sett av ubehandlede neuroner som kontroll tilstand.
   FORSIKTIG: BONTA krever bruk av øyne og åndedrettsvern ved tilberedning og brukløsninger. Opprettholde alle forurenset materiale som biologisk materiale og autoklav så snart som mulig.
2. Ved 3 DIV (24 timer etter behandling) aspirer media, og umiddelbart erstatte med minst 1 ml cefem fix (se tabell 1 for detaljer) varmet opp til 37 ° C. Inkuber i 20 minutter i mørket ved romtemperatur.
3. Skyll 3x med PBS (for fremtidig bruk tetning med parafilm og oppbevares ved 4 ° C).
4. Plasser Dekk i mørket, fuktet flekker kammer og permeabilize cellemembranene i 10 minutter i friskt fortynnet 0,2% TritonX-100 i PBS (laget av 10% TritonX-100 lager).
5. Fjern permeabilization løsning og skyll med 50 ul 1x med PBS. Blokk i 30 minutter i ~ 50 ul 10% bovint serumalbumin i PBS (BSA-PBS) eller 10% Kokt Esel serum i PBS ved romtemperatur.
6. Skyll med 1x PBS igjen. Inkuber Dekk i 50 ul primære antistoff (1: 1000 SIII tubulin, for å bekrefte identiteten neuronal) i 1% BSA-PBS i 1 time ved romtemperatur, i mørket.
7. Utfør 3x 5 min vasker i PBS. Inkuber Dekk i 50 ul spektralt-distinkt sekundært antistoff for tubulin (1: 400), og fluorescerende phalloidin (varierer etter eksitasjon: 488 phalloidin på 1: 400, 647 phalloidin på 1: 100) i 1% BSA-PBS i 1 time .
8. Vask 3x 5 min i 1x PBS og montere Dekk bort på lysbilder i monterings media.
9. Vakuum overflødig montering media fra kantene av dekkglass og tetning med klar neglelakk.
10. Samle Widefield epifluorescence bilder på en invertert mikroskop med en 40X 1.4NA objektiv, epifluorescent evner og EM-CCD.
    1. Manuelt analysere forgrening hjelp ImageJ. Åpne bildestakker i ImageJ ved å dra filen inn i vinduet eller gå til Fil> Åpne> Filnavn (figur innfelt 4A 1).
    2. Ved hjelp av line> segmentert linje, spor axon, definert som den lengste neurite som strekker seg fra soma (figur 4A innfelt 2 - 3).
    3. Bruke Analyser> Verktøy> ROI Manager lagre axon sporing som en region av interesse. Trace og lagre hver axon gren, definert som en neurite ≥20 mikrometer i lengde. Ta bare primære grener (utvekster direkte spire fra aksonet) i analysen (Figur innfelt 4A 3-4).
    4. Trykk på 'm' for å måle de lagrede regioner av interesse, og overføre lengder i piksler til et regneark til å beregne lengden i mikrometer.
    5. Del antall axon grener ≥20 um i lengde, ved lengden av axon i um dividert med 100 for å få antallet axon grener pr 100 um lengde.

Representative Results

Utnytte in vitro biokjemiske teknikker for å analysere mengden av SDS-resistente snare komplekser i en populasjon av nerveceller. Figur 1 viser den resulterende western blot etter gjennomføringen av SDS-resistente SNARE kompleks analyse undersøkt for SNAP-25, syntaxin1A og VAMP2.

TIRF mikroskopi på basalcellemembran gir høyoppløselige bilder av individuelle exocytic fusion hendelser i enkeltceller. Figur 2A viser bildeanalysemetodikk for å identifisere VAMP2-phluorin medierte exocytic hendelser. Det innfelte viser en enkelt exocytic hendelse som vesikkelfusjon oppstår og som VAMP2-phluorin diffunderer innen plasmamembranen. Figur 2B viser et eksempel på en exocytic hendelse inntreffer over tid (sekunder) i en kortikale nevroner. Zoomet innfellinger betegne soma, et akson gren og en aksonal vekst kjegle som viser spatial nytten av denne analysen. Circles betegne enkelt exocytic fusjonsbegivenheter, som kan sees via TIRF mikroskopi.

Timelapse DIC avbildning av netrin stimulert axon forgrening viser tidspunktene for axon gren formasjonen. Figur 3 viser dannelsen av en axon gren i sann tid etter netrin stimulering. Hvite pilspisser betegne den opprinnelige utspring fra en gren nettsted. Svart pilespisser betegne et fullt dannet, stabil gren av minst 20 pm måling fra hoved axon til grenen spissen. Netrin avhengige økninger i axon forgrening oppstår etter netrin avhengige økninger i exocytic fusjon.

Fast celle immunocytochemistry kombinert med farmakologisk hemming av SNARE aktivitet viser at SNARE mediert eksocytose er en forutsetning for cortical axon forgrening. 4A, skisserer en trinnvis prosess avdelings tracings PERFO RMED i ImageJ. 4B viser representative bilder av kortikale nevroner på 3DIV. Betingelser er som følger: ubehandlet, stimulert med 250 ng / ml netrin, eller behandlet med BONTA og 250 ng / ml netrin i 24 timer.

Figur 1. Bruk SDS Resistance of SNARE komplekser som en kvantifiserbar Metric av SNARE Formation in vitro. En representant western blot undersøkt for snare komplekse medlemmer VAMP2, Syntaxin1A og SNAP-25 og lasting kontroll BIII tubulin. Både Snare proteiner i komplekse og identifiserbare monomerer vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

pg "/>
Figur 2. Levende Cell Imaging og Kvantifisering av Exocytic vesikkelfusjon Begivenheter i kortikale nevroner. (A) Trinnvis omrisset av exocytic vesikkelfusjon bildeanalyse som det ble manuelt utført ved hjelp av ImageJ. (B) Innfelte panelene viser en enkelt VAMP2-pHlourin vesikkelfusjon hendelse som det skjer over tid. Den andre panel med en TIRF mikroskopi bilde av en hel kortikale nervecellen uttrykker VAMP2-pHlourin på 2DIV. Stiplet linje boksene betegne regioner av interesse som vist nedenfor: soma, axon gren, og en aksonal vekst kjegle. Sirkler med regioner av interesse betegne enkelt vesikkelfusjon hendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Long Term Live-Cell DIC Imaging avslører Tidspunkt for Netrin-1 Dependent Axon forgrening. DIC levende celle bilder av en kortikale nervecellen som viser dannelsen av axon grener som svar på netrin stimulering. Hvite pilspisser betegne interessante innledende utvekst før neurite nå 20 mikrometer i lengde. Svart pilspisser betegne bonafide grener (lengde ≥20 mikrometer). Tid betegnet som time. Min Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Fast Cell immunfluorescens Sammen med giftstoffer Hemming av eksocytose Viser at eksocytose er nødvendig for Netrin-en Dependent Axon forgrening. (A) Oversikt over sporing og analyse trinn for kvantifisering av axon forgreninger i en netrin stimulert kortikale nervecellen på 3DIV. (B) Representative bilder av kortikale nevroner ved 3DIV av hver eksperimentell betingelse: ubehandlet, stimulert med 250 ng / ml netrin, eller behandlet med 10 nM BONTA toksin pluss 250 ng / ml netrin. Green er F-Actin (phalloidin), er rød βIIItubulin. Piler betegne poeng av axon grener ≥20 mikrometer i lengde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsning	Oppskrift
homogeniseringsbufferen	10 mM HEPES-NaOH pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. Plus nødvendige protease og fosfatase-hemmere er avhengige av celletype
2x Sample buffer	60 mM Tris-HCl pH 6,75, 5% (v / v) fI-merkaptoetanol, 2% (vekt / volum) SDS, 10% (w / v) glycerol, 0,007% (w /v) bromfenol blå
cefem fiksativ	60 mM PIPES pH 7,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM EGTA, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 0,12 M sukrose, 4% PFA
montering Media	20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% N-propyl-gallat, 90% høy kvalitet glycerol, MilliQ H2O
10X SDS Running Buffer	Løs opp 30,0 g Tris base, 144,0 g glysin, og 10,0 g av SDS i 1000 ml H 2 O, pH 8,3. Fortynn til 1x.
10X Transfer Buffer	Løs opp 30,3 g Tris for 250 mM og 144,1 g Glysin for 1,92 M løsning i en LH 2 O; (i 1 L 1 x buffer legge til 100 ml 10x løsning til 200 ml MeOH og 700 ml kald DI H 2 O)
Serum Free Media (SFM)	50 ml: 0,5 ml L-glutamin, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal Media
Trypsin Quenching Media (TQM)	50 ml: 0,5 ml L-glutamin, 2,5 ml FBS, 47 ml Neurobasal Media
TRIS Buffered Saline	50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl i en LH-2 O; (For TBS-T tilsett 1 ml Tween-20)

Tabell 1. Solutions

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011