Protocol
Постановка исследовательской этики: Все эксперименты с участием животных , описанные здесь, могут быть с правилами и положениями UNC комитета по уходу за животными и стандартам NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка и покрытие диссоциированных корковых нейронов
- Эвтаназии приуроченные-беременных самок СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков. Удалить весь мозг из черепов эмбриональных день 15,5 (E15.5) мышей и microdissect кортикальных из каждого полушария. Для получения подробных инструкций относительно микродиссекции эмбрионального мозга мыши смотрите , пожалуйста Viesselmann и др 8.
- Поместите не более 4 в 1 кору мл рассекающих сред в стерильном 1,6 мл микропробирок. Добавьте 120 мкл 10х трипсина и переверните трубку 3 - 5 раз перемешать.
- С помощью гемоцитометра, подсчет клеток семян культуры клеток блюда. Примечание: 1 корковое полушарие обеспечивает окoximately три миллиона клеток.
- Для SNARE комплекса биохимического анализа SDS-резистентных, плиты шесть миллионов клеток на 35 мм блюдо и использовать два блюда на каждый вариант. Примечание: Это упрощается при использовании 6-луночные планшеты при сравнении нескольких условий.
- Для разветвлений анализов, нейроны пластина на азотную кислоту промывают круговыми покровные при плотности 250000 клеток на 35 мм чашку для DIC визуализации аксона ветвления пластины при плотности 150000. Эти плотности избежать переполненности и упростить анализ.
- Для живых клеток TIRF микроскопии, ресуспендирования два миллиона нейронов за трансфекцией в nucleofection растворе при комнатной температуре.
- Добавляют 100 мкл суспензии клеток в микропробирки , содержащей 10 мкг плазмиды экспрессии и электропорации VAMP2-pHlourin с Nucleofector в соответствии с протоколом производителя 9.
- После того, как трансфекцию немедленно добавить 500 мкл трипсина закалкой сред, удалить суспензию из кювет и пластинчатых клеток в берлогеплотность 400000 клеток на 35 мм стеклянной PDL покрытием нижней тарелки.
- Тарелка все нейроны коры в 2 мл бессывороточной среды.
2. SNARE комплекс Формирование Пробирной
Примечание: SDS-стойкие SNARE комплексы были обработаны и проанализированы как первоначально описано 10 с изменениями , подробно описанных ниже. Для проверенных альтернативных антител к тем, которые используются здесь, в разделе материалов.
- Стимулируют E15.5 корковых нейронов 2 дня в пробирке (DIV) с 250 нг / мл Netrin-1 или мнимого управления в течение 1 ч до лизиса.
- До обработки проб, охлаждают центрифуге до 4 ° C, установленная температура и водяной бане до 37 ° С, и тепло блока до 100 ° С.
- Удалить клеточные блюда из инкубатора и место на льду.
- Вытяжку средств массовой информации из клеток, заменить ~ 2 мл охлажденного льдом фосфатно-солевой буфер (PBS) нежно 2 раза в течение 1 - 2 мин на каждую промывку.
- Для этого теста с помощью 2 скважин в кондition.
- Отберите PBS от первой скважины состояния и заменить 250 мкл буфера для гомогенизации. Оставьте на льду в течение 5 мин, а затем с помощью мобильного толкатель, гомогенизацию клеток на льду.
- Аспирируйте PBS из следующей скважины того же условия и добавьте недавно гомогенизированной смеси в скважину. Это приведет к увеличению концентрации белка. Повторите эти действия для всех условий.
- После завершения пипетку гомогенизируют раствор до предварительно охлажденный 1,6 мл микропробирок на льду и добавляют 20% Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% Тритон Х-100. Triturate смешать 10 раз с 1000 мкл пипетки при сведении к минимуму пузырьки.
- Инкубируйте пробирки на льду в течение 2 мин для солюбилизации белков. После инкубации Центрифуга в течение 10 мин при 6,010 RCF при 4 ° С до гранул, не солюбилизированный материал. Перемещение лизата супернатант в новую охлажденной 1,6 мл пробирку на льду.
- Выполнить анализ концентрации белка с использованием Бредфорда 11 и разбавленные образцы в FINAл концентрация белка в 3 - 5 мг / мл с оставшимся гомогенизацию буфера с добавлением 1% Тритон Х-100 и 5X буфера для образцов, дополненной B-Mercaptethanol (BME).
- Разделите каждый опытный образец равномерно в 2 пробирки. Выдержите один образец при температуре 37 ° С в течение 30 мин (SNARE комплексы), а другой при температуре 100 ° С в течение 30 мин (SNARE мономеров). Обратить трубки с перерывами, чтобы сохранить образцы в растворе.
- Замораживание образцов при -20 ° С до готовности разделить с помощью SDS-PAGE. Перед запуском образцов с помощью электрофореза с использованием стандартных методик, Reboil ранее вареных образцов в течение 5 мин при 100 ° С, но оттаивают 37 ° С образцов при комнатной температуре.
- Запуск дубликатами образцов (30 - 40 мкг белка на образец) на обоих 8% и 15% геле; 8% обеспечивает идеальное разделение комплекса, в то время как 15% используют для количественного определения SNARE белковых мономеров (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, синтаксин-1 ~ 35kDa). Поддерживать источник питания на 70 V, пока линия красителя через НТККкороль геля и повышение напряжения до 90V. Запуск гели, пока краска не стекает.
- Чтобы сохранить мономеры, переносить белки на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм на льду с использованием буфера передачи холода с добавлением 20% -ного метанола (MeOH), при 70 В в течение 45 мин.
- Сухая мембрана в закрытой чашке в течение 2 ч до O / N при комнатной температуре (O / N обеспечивает лучшие результаты).
- Блок SNARE сложных мембран в 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Подготовка первичных антител (распознающие специфические компоненты SNARE комплекс) в разведении 1: 1000 и зонда O / N при 4 ° С на ротационном шейкере.
- Промыть блотов в Трис буферным раствором плюс 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 раза в течение 5 минут каждый.
- Готовят флуоресцентные растворы вторичными антителами в разведении 1: 20000 в 1% БСА в TBS-T и зонд в течение 1 ч, охватываемого при комнатной температуре. Повторите шаг 2.12.1 после 1 ч.
- Изображение кляксы на флуоресцентной сканирования машины оснащены программным пакетом и количественно оцениваются как SNARE белка COmplex (иммунореактивных полос выше 40 кДа) и мономерных полосы (иммунореактивного полосы при 25 кДа, 18 кДа, 35 кДа для SNAP-25, VAMP2 и синтаксин-1, соответственно), используя инструкции производителя для рисования прямоугольных трансформирования.
3. Exocytic визуализации событий с помощью TIRF микроскопии
Примечание: Этот протокол требует специальной микроскопии оборудования , включая климатическую камеру для поддержания температуры, влажности и CO 2, инвертированный TIRF микроскоп , снабженный эпифлуоресцентной подсветкой, / высокой числовой апертурой (NA) TIRF цели высокого увеличения, автоматизированной стадии XYZ, и чувствительный прибор с зарядовой связью (CCD) детектор. Этот протокол использует полностью автоматизированный инвертированный микроскоп, снабженный 100x 1.49NA TIRF объективного твердого состояния 491 нм лазера и электронного умножителя CCD (EM-CCD). Все оборудование управляется с помощью получения изображения и управления лазером программного обеспечения. До начала питания протокол формирования изображения на Environmental камера, сцена, лампа, компьютер и фотоаппарат.
- Выберите цель в ПО для обработки изображений. После того, как цель находится в месте, закрепить объективный нагреватель вокруг воротника.
- Убедитесь, что цель полностью опущенной до обеспечения стадии инкубатора в пазу стадии. Залить дистиллированную воду в стадии инкубатора входные отверстия равномерно для предотвращения разлива.
- Включите систему инкубации. Откройте клапан в CO 2 бака и убедитесь , что давление соответствует системе , в соответствии с инструкциями изготовителя. Дайте камере из некоторое время , чтобы достичь 5% CO 2 и 37 ° C. Перед тем как добавить блюдо изображения, поместить пустое блюдо в инкубаторе, чтобы избежать конденсации воды на цели.
- Питание от источника лазерного излучения.
- Открытая сцена инкубатора и добавить масло погружения в объектив. Поместите образец в инкубатор и стабилизации с оружием стабильности или веса тарелки. Повысить цель, пока масло не вступает в контакт с нижней части образца. печ к проходящего света освещения и найти нейронную фокальной плоскости, проходящей через окуляры.
- Запустите лазерное программное обеспечение и подключить к программному обеспечению управления лазером. Установить подсветку Widefield и выбрать цель используется (100X 1,49 NA TIRF рекомендуется). Установка показателя преломления образца (клетки ~ 1,38). Регулировка интенсивности лазерного излучения, отключив "TTL" на 491 нм лазер. Установите ползунок 100 затем вернуть его обратно вниз до значения между 20 - 40%. Перепроверьте "TTL".
- Фокус на образце снова в проходящем свете освещения. Перейти к ПО для обработки изображений и выберите 491 нм лазерного излучения и открытого затвора. Точная настройка точки фокусировки лазера на потолке и в центре точки в центре замкнутого поля диафрагмы с конденсатором удалены. Поместите конденсатор вверх дном на оптической скамье, чтобы не поцарапать линзы.
- Заменить конденсатор и перейти к TIRF и настройка программного обеспечения глубины проникновения (PD) до 110 нм. Переход от Widefield освещения до TIRF IllumРежим минации для работы с изображениями.
- Найти VAMP2-phluorin, выражающую клетки через окуляры с использованием эпифлуоресцентной с широким полем зрения источника света эпифлуоресцентной.
- Настройте параметры изображения (время экспозиции, усиления и мощности лазера), чтобы максимально увеличить соотношение сигнал-шум и динамический диапазон, используя минимальное время экспозиции и интенсивность лазерного излучения, чтобы уменьшить фотообесцвечивания и фототоксичности (например: экспозиции между 50 - 100 мс, с 15 - 30 получить на 30% максимум мощности лазера).
- Установка непрерывной автоматической фокусировки на одну ячейку. Приобретают интервальной съемки изображение, установленное с приобретением происходит каждые 0,5 сек в течение 5 мин. Для вынужденного состояния Netrin-1, добавить 500 нг / мл Netrin-1 блюдо из клеток в ламинарный и вернуть блюдо в инкубаторе в течение 1 ч до визуализации.
- Для количественной оценки частоты exocytic событий , нормированные на единицу площади и времени ячейки, открытые стеки изображений в ImageJ путем перетаскивания файла в окно или перейдите в меню Файл> Открыть> Имя файла (рис0; 2А врезке 1).
- Для удаления устойчивых сигналов флуоресцентные, которые не представляют слияние пузырьков события, создают среднюю г проекцию всего стека с помощью Image> Стопка> Z-Project> Тип проекции: Средняя интенсивность. Вычтите это среднее изображение от каждого изображения в интервальной съемки с помощью процесса> Calculator Image> image1: ваш стек Операция: Вычтите image2 вновь созданный средняя проекция г. Это подчеркивает exocytic события (рис 2A Врезка 2 - 3).
- Граф exocytic слитые события на глаз. Exocytic события определяются как появление сигнала флуоресценции дифракционной расходимостью , который быстро диффундирует в качестве VAMP2-phluorin диффундирует в плазматической мембране (рис 2А Inset 6).
- С помощью команды Threshold для выделения первого изображения с помощью Image> Adjust> Threshold> отрегулируйте ползунок , пока вся ячейка не является порог выделенный (рисунок 2A Inset 7 - 8).
- Под Anaлизировать, выберите SetMeasurements и проверить область и метку дисплея. Выберите порогами сотовой области с помощью инструмента отслеживания палочки и нажмите на кнопку "М" для измерения (рис 2A Inset 7 - 8).
- Передача , как отсчитывать exocytic слитые события, измерения площади ячейки, а также время , прошедшее изображения в электронную таблицу для подсчета количества exocytic событий / мм 2 / времени (рис 2A Inset 9).
4. Дифференциальная интерференционного контраста (DIC) Timelapse микроскопия Axon ветвящихся
Примечание: Полный протокол и демонстрация для общего подхода к визуализации DIC доступно 12. Хотя этот протокол использует DIC, другие проходящем свете методы микроскопии могут быть использованы для тех же целей (например, фазовый контраст).
- На 2 DIV, место со стеклянным дном тарелки формирования изображения, содержащего нетрансфецированные нейроны в подогретого экологической камере для поддержания влажного окрironment с 5% CO 2 и 37 ° С. Использование микроскопа, оснащенного 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC объектива и высокой конденсатор NA для лучшего качества изображения и разрешение.
- Регулировка фокальной плоскости, чтобы найти нейроны через окуляры с использованием проходящего света освещения.
- Использование функции мультимиллионера приобретения область на ПО для обработки изображений, найти и сохранить места XYZ, по крайней мере, 6 ячеек. Расположите стадию так, что нейроны, представляющие интерес вписываются в поле зрения для достижения наилучших результатов.
- Стимулируют с 250 нг / мл Netrin-1 и нажмите кнопку 'начать мульти приобретения области. Последовательно получать изображения в каждой позиции через каждые 20 секунд в течение 24 часов, делая паузу приобретение и переориентацию по мере необходимости.
- Обзор изображений в ПО для обработки изображений с помощью Программы> Обзор многомерные данных> имя файла открытого. Определить стабильные аксонов ветви (20 мкм в длину), которые образуются во время сеанса визуализации. С помощью инструмента Линия вытяжки для измерения stableaxon Brancч от основания на аксона к наконечнику, чтобы обеспечить 20 мкм длина квалификации удовлетворяется.
- В таблице, запишите номер кадра после Netrin стимуляции, когда мембранные выступы инициируют в тех областях, где ветви позже форме, а также номер кадра после Netrin стимуляции, когда нарождающиеся ветви достигают 20 мкм в длину.
- Умножьте количество кадров между протрузии и формирования ветви на 20 сек, чтобы вычислить время формирования каждой ветви.
5. токсинного Манипуляции и фиксированной ячейки Immunofluoresence
- На 2 DIV, лечить нейроны в условиях эксперимента с 250 нг / мл Нетрин-1 и / или 10 нМ ботулинический токсин А (ботулотоксина А ), который расщепляет силки белка SNAP-25 и эффективно ингибирует опосредованную SNARE экзоцитоза 13, плюс 250 нг / мл netrin- 1. Оставьте один набор необработанных нейронов в качестве контрольной группы.
ВНИМАНИЕ: ботулотоксина требует использования глаз и средств защиты органов дыхания при подготовке и использованиирешения. Поддерживать все загрязненные материалы, как и биологически опасными материалами автоклава как можно скорее. - В 3 -х DIV (24 ч после обработки) аспирата средств массовой информации, и немедленно заменить, по меньшей мере , 1 мл ФЭУ FIX (см таблицу 1 для деталей) нагревали до 37 ° С. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза с PBS (для будущего использования печати с парафином и хранить при температуре 4 ° С).
- Место покровные в темном, увлажненной камере окрашивания и проницаемыми клеточные мембраны в течение 10 мин в свеже разбавленного 0,2% Тритон Х-100 в PBS (получен с 10% Тритон Х-100 штока).
- Удалить пермеабилизирующего раствор и промыть 50 мкл 1x с PBS. Блок в течение 30 мин в ~ 50 мкл 10% бычьим сывороточным альбумином в PBS (BSA-PBS), или 10% Вареный Donkey сыворотки в PBS при комнатной температуре.
- Полоскание с 1x PBS снова. Инкубируйте покровные в 50 мкл первичного антитела (1: 1000 βIII тубулина, чтобы подтвердить идентичность нейронную) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч при комнатной температуре, во тьме.
- Выполните 3x 5 мин промывок в PBS. Инкубируйте покровные в 50 мкл спектрально-различных вторичных антител для тубулина (1: 400) и флуоресцентного фаллоидином (варьируется в зависимости от возбуждения: 488 фаллоидином в соотношении 1: 400, 647 фаллоидином в соотношении 1: 100) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч ,
- Вымойте 3x 5 мин в 1x PBS и смонтировать покровные на слайды в монтажных средах.
- Вакуумный избыток монтажа средств массовой информации от краев покровного и печатью с прозрачным лаком для ногтей.
- Сбор Widefield изображения эпифлуоресцентной на инвертированный микроскоп с объективом 40X 1.4NA, эпифлуоресцентной возможностей и EM-CCD.
- Вручную анализировать ветвления с помощью ImageJ. Открытые стеки изображений в ImageJ путем перетаскивания файла в окно или перейдите в меню Файл> Открыть> Имя файла (рис 4A Врезка 1).
- Используя линию> сегментированный линию, проследить аксона, определяемый как самый длинный нейритов , простирающейся от сомы (рис 4A врезке 2 - 3).
- Использование Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI, сохранить аксона трассировку в интересующей области. Трассировка и сохранить каждую ветвь аксона, определяемой как аксонов ≥20 мкм в длину. Только основные ветви (наросты непосредственно отростков аксона) в анализе (рис 4A врезке 3 - 4).
- Нажмите 'M' для измерения сохраненных областей, представляющих интерес, и передавать длину в пикселях в электронную таблицу для расчета длины в мкм.
- Разделить количество аксонов ветвей ≥20 мкм в длину, по длине аксона в мкм, деленный на 100, чтобы получить число аксонов ответвлений на длине 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование в пробирке биохимических методов для анализа количества SDS-устойчивых комплексов SNARE в популяции нейронов. На рисунке 1 показан результат Вестерн - блот после завершения SDS-стойкого SNARE комплекса анализа зондировали SNAP-25, syntaxin1A и VAMP2.
TIRF микроскопия на мембране базальных клеток обеспечивает высокое разрешение изображения отдельных exocytic слитых событий в одиночных камерах. Рисунок 2А демонстрирует методику анализа изображения для идентификации VAMP2-phluorin опосредованных exocytic события. На врезке показан один exocytic событие как слияние пузырьков происходит и в качестве VAMP2-phluorin диффундирует в плазматической мембране. На фиг.2В показан пример exocytic событием , произошедшим в течение долгого времени ( в секундах) в корковом нейроне. ZOOMED вставках обозначают Сома, ответвлением аксонов и аксонов конус роста, показывающий spatiAl полезности данного анализа. Круги обозначают единичные exocytic слитые события, которые можно увидеть с помощью TIRF микроскопии.
Timelapse DIC визуализации Netrin стимулировали аксона ветвление раскрывает сроки формирования Аксон ветви. На рисунке 3 показана формирование аксонов ветви в режиме реального времени следующие Netrin стимуляции. Белые наконечники стрел обозначают начальный выступ от ветви сайта. Черные размерные стрелки обозначают полностью сформированную, стабильную ветвь, по меньшей мере, 20 мкм для измерения от главного аксона до кончика ветви. Netrin зависимых увеличивается в аксона ветвления происходит после Netrin зависимых увеличение exocytic слияния.
Фиксированная клетка иммуноцитохимия в сочетании с фармакологической ингибирование SNARE активности показывает , что SNARE опосредованной экзоцитоза является необходимым условием для кортикальной аксона ветвления. Рисунок 4A, описывает шаг за шагом процесс ветвления обводка PERFO rmed в ImageJ. На рисунке 4В показаны репрезентативные образы корковых нейронов в 3DIV. Условия следующие: необработанный, стимулировали 250 нг / мл Netrin, или обрабатывают с ботулиническим токсином и 250 нг / мл Netrin в течение 24 часов.
Рисунок 1. Использование SDS Сопротивление SNARE комплексов как Количественное метрика SNARE формирования In Vitro. Представитель вестерн - блот зондируют для SNARE сложных членов VAMP2, Syntaxin1A и SNAP-25 и контроль загрузки BIII тубулина. Оба SNARE белков в сложных и идентифицируемых мономеров показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
пг "/>
Рисунок 2. живых изображений сотовый и Количественное Exocytic везикул Fusion События в корковых нейронах. (A) Шаг за шагом контура exocytic анализа везикулы слияния изображений , как это было вручную выполняется с помощью ImageJ. (Б) панелями , показать одну VAMP2-pHlourin везикул слитого событие , как это происходит с течением времени. Вторая панель показывая TIRF микроскопии изображение всей корковой нейроне, выражающей VAMP2-pHlourin на 2DIV. Пунктирные коробки линии обозначают регионы, представляющие интерес, как показано ниже: сомы, аксона ветви, и аксонов конуса роста. Круги с регионами интерес обозначают единичные везикулы слитые события. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Долговременная Живая сотовый Д.И.C визуализации Показывает сроки проведения Netrin-1 зависимых живых клеток изображений Axon Ветвление. DIC кортикального нейроне , показывающий формирование аксонов ветвей в ответ на стимуляцию Netrin. Белые наконечники стрел обозначают точки первоначального выступа до нейритов, достигающего в длину 20 мкм. Черные наконечники стрел обозначают Bonafide ветви (длина ≥20 мкм). Время обозначается как час: мин . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Fixed Cell Иммунофлуоресценции В сочетании с токсином ингибирование экзоцитоза показывает , что Экзоцитоз требуется для Netrin-1 Зависимая Axon Ветвление. (A) План шагов трассировки и анализа для количественного определения аксона ветвящихся в Netrin стимулируется корковой нейрон в 3DIV, (B) Типичные изображения корковых нейронов при 3DIV каждого условия эксперимента: необработанной, стимулированных 250 нг / мл Netrin, или обрабатывают 10 нМ Bonta токсина плюс 250 нг / мл Netrin. Зеленый цвет F-актин (фаллоидином), красный βIIItubulin. Стрелки обозначают точки аксона ветвей ≥20 мкм в длину. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Решение | Рецепт |
| Гомогенизация буфер | 10 мМ HEPES-NaOH, рН 7.4,150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA. Плюс необходимые ингибиторы протеазы и фосфатазы, зависящие от типа клеток |
| 2x Образец буфера | 60 мМ Трис-HCl, рН 6,75, 5% (об / об) с ФИ-меркаптоэтанола, 2% (вес / объем) SDS, 10% (вес / объем) глицерин, 0,007% (вес /v) бромфеноловый синий |
| ФЭУ закрепляющий | 60 мМ PIPES рН 7,0, 25 мМ HEPES , рН 7,0, 10 мМ EGTA рН 8,0, 2 мМ MgCl 2, 0,12 М сахарозе, 4% PFA |
| Монтаж Медиа | 20 мМ Трис , рН 8,0, 0,5% N-пропилгаллат, 90% глицерина высокого качества, MilliQ H 2 O |
| 10X SDS Запуск буфера | Растворить 30,0 г Трис основания, 144,0 г глицина и 10,0 г SDS в 1000 мл H 2 O, рН 8,3. Разбавить до 1 раза. |
| Буфер Transfer 10X | Растворить 30,3 г Трис на 250 мм и 144,1 г Глицин для 1,92 М раствора в 1 LH 2 O; (за 1 л 1x буфера добавляют 100 мл раствора 10x 200 мл метанола и 700 мл холодной ДИ H 2 O) |
| Бессывороточной среды (SFM) | 50 мл: 0,5 мл L-глутамина, B27 1 мл, 48,5 мл Neurobasal Медиа |
| Трипсин Тушение Медиа (TQM) | 50 мл: 0,5 мл L-глутамина, 2,5 мл FBS, 47 мл NeurobASAL Медиа |
| ТРИС-солевом буферном растворе | 50 мМ Трис-Cl, рН 7,5, 150 мМ NaCl , в 1 LH 2 O; (Для TBS-T добавляют 1 мл твин-20) |
Таблица 1. Решения
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья: RO1-GM108970 (SLG) и F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
