Protocol
Dichiarazione di etica della ricerca: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali descritti nel presente documento sono soggetti alle norme e ai regolamenti del Comitato UNC sulla cura degli animali e agli standard NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione e placcatura di dissociato neuroni corticali
- Euthanize femmine tempestivi incinta di CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale. Rimuovere cervelli interi dai teschi dei embrionali giorno 15,5 (E15.5) topi e microdissect cortecce da ciascun emisfero. Per le istruzioni dettagliate per quanto riguarda la microdissezione della corteccia embrionali di topo vedere Viesselmann et al 8.
- Mettere non più di 4 cortecce in 1 ml di media sezionare in una sterile 1,6 ml provetta. Aggiungere 120 ml di 10x tripsina e capovolgere il tubo 3 - 5 volte per mescolare.
- Utilizzando un emocitometro, contano le cellule alle sementi piatti di coltura cellulare. Nota: 1 emisfero corticale fornisce approximately tre milioni di cellule.
- Per il saggio biochimico complesso SNARE SDS-resistente, piatto sei milioni di cellule per piastra da 35 mm e di utilizzare due piatti per ogni condizione. Nota: Questo è semplificata utilizzando 6 pozzetti quando si confrontano più condizioni.
- Per i saggi di ramificazione, neuroni piastra di acido nitrico lavati coprioggetto circolare ad una densità di 250.000 cellule per piastra da 35 mm, DIC imaging piastra assone ramificazione ad una densità di 150.000. Questi densità di evitare il sovraffollamento e semplificano l'analisi.
- Per vivere la microscopia TIRF cellulare, risospendere due milioni di neuroni per trasfezione in nucleofection soluzione a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare per provetta contenente 10 mg di VAMP2-pHlourin plasmide di espressione e l'elettroporazione con un Nucleofector secondo il fornitore protocollo 9.
- Dopo trasfezioni aggiungere immediatamente 500 ml di mezzi tripsina tempra, rimuovere la sospensione dalle cellule cuvetta e piastra in un covosità di 400.000 cellule per 35 millimetri piatto fondo di vetro PDL rivestite.
- Piastra tutti i neuroni corticali in 2 ml di media liberi siero.
2. SNARE complesso formazione Assay
Nota: i complessi SNARE SDS-resistenti sono stati elaborati ed analizzati come originariamente descritto 10 con le modifiche descritte di seguito. Per gli anticorpi alternativi convalidati a quelli usati qui, vedere la sezione materiali.
- Stimolare i neuroni corticali E15.5 2 giorni in vitro (DIV) con 250 / ml netrina-1 o sham controllo ng per 1 ora prima di lisi.
- Prima di trattare campioni, centrifuga raffreddare a 4 ° C, e impostare la temperatura bagnomaria a 37 ° C, e blocco termico a 100 ° C.
- Rimuovere piatti cellule da incubatore e disporli sul ghiaccio.
- Aspirare il terreno dalle cellule, sostituirli con ~ 2 ml di ghiaccio freddo fosfato salina tamponata (PBS) delicatamente 2 volte per 1 - 2 min a lavaggio.
- Per questo test, utilizzare 2 pozzi per condition.
- Aspirare PBS dal primo pozzo di una condizione e sostituire con 250 microlitri tampone di omogeneizzazione. Lasciare in ghiaccio per 5 minuti, e quindi utilizzando un sollevatore cellulare, omogeneizzare le cellule in ghiaccio.
- Aspirare il PBS dal pozzo successivo della stessa condizione e aggiungere la miscela recentemente omogeneizzato al pozzo. Ciò consentirà di aumentare le concentrazioni di proteine. Ripetere l'operazione per tutte le condizioni.
- Al termine, pipetta omogeneizzata soluzione di un pre-raffreddata 1.6 ml provetta su ghiaccio e aggiungere 20% TritonX-100 per ottenere una concentrazione finale di 1% TritonX-100. Triturare mescolare 10 volte con 1.000 ml pipetta, riducendo al minimo le bolle.
- Incubare le provette in ghiaccio per 2 minuti per solubilizzare le proteine. Dopo l'incubazione, centrifugare per 10 minuti a 6.010 rcf a 4 ° C a pellet materiale non solubilizzata. Spostare il surnatante lisato nella nuova raffreddata provetta 1.6 ml su ghiaccio.
- Eseguire l'analisi concentrazione di proteine usando Bradford test 11 e diluire campioni ad un finaconcentrazione proteica l da 3 - 5 mg / ml con tampone di omogeneizzazione restante supplementato con 1% TritonX-100 e tampone 5x supplementato con B-Mercaptethanol (BME).
- Dividere ogni campione sperimentale in modo uniforme in 2 tubi. Incubare un campione a 37 ° C per 30 min (SNARE complessi), e l'altro a 100 ° C per 30 min (monomeri SNARE). Capovolgere i tubi in modo intermittente per mantenere i campioni in soluzione.
- Congelare i campioni a -20 ° C fino al momento di separare tramite SDS-PAGE. Prima di eseguire campioni tramite elettroforesi utilizzando tecniche standard, ribollitura campioni precedentemente bolliti per 5 minuti a 100 ° C, ma scongelare 37 ° C campioni a temperatura ambiente.
- duplicati Run di campioni (30 - 40 mg di proteine per campione) sia un 8% e un gel 15%; l'8% prevede la separazione ideale del complesso, mentre il 15% viene utilizzato per quantificare monomeri di proteine SNARE (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa). Mantenere fonte di alimentazione a 70 V fino a quando la linea di tintura è attraverso il stacre gel e tensione di aumento a 90V. Eseguire gel fino a quando il colorante corre via.
- Per conservare monomeri, trasferire proteine a 0,2 micron membrana di nitrocellulosa sul ghiaccio con tampone di trasferimento a freddo con il 20% di metanolo (MeOH) aggiunto, a 70 V per 45 min.
- Membrana secco in un piatto coperto per 2 ore a O / N a RT (O / N fornisce i risultati migliori).
- Block SNARE membrane complessi a 10% di sieroalbumina bovina (BSA) per 1 ora a RT.
- Preparare anticorpi primari (che riconoscono specifici componenti complessi militare) alla diluizione di 1: 1.000 e sonda O / N a 4 ° C in un agitatore rotativo.
- Risciacquare macchie in Tris Buffered Saline più 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Preparare soluzioni fluorescenti anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 20.000 in 1% BSA in TBS-T e sonda per 1 ora, coperta a RT. Ripetere il punto 2.12.1 dopo 1 ora.
- Immagine Macchie su una macchina di scansione a fluorescenza dotato di suite di software e quantificare sia il co proteina SNAREmplex (bande immunoreattive sopra 40kDa) e fasce monomero (bande immunoreattive a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa per SNAP-25, VAMP2 e syntaxin-1, rispettivamente) utilizzando le istruzioni del produttore per il disegno ROI rettangolari.
3. Imaging esocitica Eventi tramite microscopia TIRF
Nota: Questo protocollo richiede attrezzature microscopia specializzata compresa una camera ambientale per mantenere la temperatura, l'umidità e CO 2, un microscopio TIRF invertito equipaggiato con un'illuminazione epifluorescente, a / alta apertura numerica (NA) dell'obiettivo TIRF alto ingrandimento, una fase automatizzata XYZ, e un sensibile Charge Coupled Device (CCD) rivelatore. Questo protocollo utilizza un microscopio rovesciato completamente automatizzato dotato di un obiettivo di un Solid State 491 nm laser 100x 1.49NA TIRF e un Moltiplicando CCD Electron (EM-CCD). Tutta l'apparecchiatura è controllata da imaging e controllo laser software. Prima dell'inizio della potenza protocollo di imaging sul envirambientali sotto camera, palcoscenico, lampada, computer e macchina fotografica.
- Selezionare obiettivo all'interno del software di imaging. Una volta che l'obiettivo è in posizione, fissare il riscaldatore obiettivo intorno al collare.
- Verificare che l'obiettivo è abbassato completamente prima di fissare l'incubatrice fase nello slot fase. Versare l'acqua distillata nelle insenature fase di incubazione in modo uniforme per evitare fuoriuscita.
- Accendere il sistema di incubazione. Aprire la valvola al serbatoio di CO 2 e confermare la pressione è appropriato per il sistema secondo le istruzioni del produttore. Consentire camera di un certo tempo per raggiungere il 5% di CO 2 e 37 ° C. Prima di aggiungere il piatto di imaging, collocare un piatto vuoto in incubatrice per evitare la condensazione dell'acqua sull'obiettivo.
- Accendere la sorgente laser.
- Aprire fase incubatore e aggiungere olio per immersione alla lente. Collocare il campione in incubatrice e stabilizzare con le armi di stabilità o un peso piatto. Sollevare l'obiettivo finché l'olio entra in contatto con il fondo del campione. switch di illuminazione a luce trasmessa e trovare piano focale neuronale attraverso gli oculari.
- Avviare il software laser e connettersi al software di controllo del laser. Impostare l'illuminazione a widefield e selezionare l'obiettivo utilizzato (100X 1.49 NA TIRF è raccomandato). Impostare indice di rifrazione del campione (cellule ~ 1.38). Regolare l'intensità del laser deselezionando "TTL" per il laser 491 nm. Regolare il cursore per 100 poi riportarlo verso il basso per un valore compreso tra 20 - 40%. Ricontrollare "TTL".
- Focus sul nuovo campione nell'illuminazione luce trasmessa. Vai a software di imaging e selezionare l'illuminazione laser 491 nm e otturatore aperto. Belle regolare il punto focale del laser sul soffitto e centrare il punto al centro del diaframma di campo chiuso con il condensatore rimosso. Mettere a condensatore a testa in giù sul banco ottico, in modo da non dell'obiettivo zero.
- Sostituire condensatore e andare a software TIRF e impostare la profondità di penetrazione (PD) a 110 nm. Passare dalla illuminazione widefield a TIRF illumModalità inazione per l'imaging.
- Trova VAMP2-pHluorin cellule che esprimono attraverso gli oculari usando epifluorescenza widefield con sorgente luminosa epifluorescente.
- Regolare parametri di imaging (tempo di esposizione, il guadagno e la potenza laser) per massimizzare il rapporto segnale-rumore e gamma dinamica utilizzando il tempo di esposizione minima e intensità del laser per ridurre photobleaching e fototossicità (ad esempio: esposizione tra 50 - 100 msec, con un 15 - 30 guadagnare al 30% della potenza massima laser).
- Impostare autofocus continuo per cella. Acquisire un'immagine timelapse insieme con l'acquisizione che si verificano ogni 0,5 secondi per 5 min. Per la condizione stimolata netrina-1, aggiungere 500 ng netrina-1 / ml al piatto di cellule in una cappa a flusso laminare e restituire il piatto per l'incubatore per 1 ora prima di imaging.
- Per quantificare la frequenza degli eventi esocitosi normalizzati per area delle cellule e il tempo, pile di immagini aperte in ImageJ trascinando il file nella finestra o andare su File> Apri> Nome file (Figura0; 2A Riquadro 1).
- Per rimuovere i segnali fluorescenti stabili che non rappresentano eventi di fusione delle vescicole, creare una proiezione media z dell'intero stack con Immagine> Pila> Z-Project> tipo di proiezione: intensità media. Sottrarre questa immagine media da ogni immagine in timelapse usando il processo> Calcolatrice Immagine> Image1: lo stack di funzionamento: Sottrarre Image2 appena creato proiezione media z. Questo sottolinea eventi esocitosi (Figura 2A Inset 2 - 3).
- Conte eventi di fusione esocitosi di occhio. Eventi esocitica sono definiti come la comparsa di un segnale di fluorescenza diffrazione limitata, che diffonde rapidamente VAMP2-pHluorin diffonde all'interno della membrana plasmatica (Figura 2A Inset 6).
- Utilizzare il comando Soglia per evidenziare la prima immagine utilizzando Immagine> Regola> Soglia> regolare scorrimento fino a quando l'intera cella è evidenziata soglia (Figura 2A Riquadro 7-8).
- sotto AnaLyze, scegliere SetMeasurements e controllare la regione e l'etichetta di visualizzazione. Selezionare l'area cellulare thresholded utilizzando lo strumento bacchetta rintracciamento e premere 'm' per misurare (Figura 2A Riquadro 7-8).
- Trasferire entrambi contano gli eventi di fusione esocitosi, le misure della superficie delle cellule, e il tempo di imaging trascorso ad un foglio di calcolo per calcolare il numero di eventi esocitica / mm 2 / ora (Figura 2A Inset 9).
4. interferenza differenziale contrasto (DIC) Timelapse Microscopia di Axon Branching
Nota: Un protocollo completa e la dimostrazione di un approccio generale per l'imaging DIC è disponibile 12. Mentre questo protocollo utilizza DIC, altri metodi di microscopia a luce trasmessa possono essere utilizzati per gli stessi scopi (per esempio: contrasto di fase).
- A 2 DIV, posto fondo di vetro piatto di imaging che contiene neuroni untransfected in camera ambientale pre-riscaldato a mantenere un ENV umidoironment con il 5% di CO 2 e 37 ° C. Utilizzare un microscopio dotato di 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC lente dell'obiettivo e alta condensatore NA per la migliore qualità e la risoluzione dell'immagine.
- Regolare il piano focale per trovare i neuroni attraverso gli oculari che utilizzano illuminazione a luce trasmessa.
- Utilizzando la funzione Multi acquisizione dell'area su software di imaging, trovare e salvare le posizioni XYZ di almeno 6 celle. Posizionare il palco in modo che i neuroni di interesse in forma all'interno del campo visivo per i migliori risultati.
- Stimolare con 250 ng / ml netrina-1 e premere il tasto 'start acquisizione più zona'. Sequenziale acquisire immagini in ogni posizione ogni 20 sec per 24 ore, fermandosi acquisizione e rifocalizzazione, se necessario.
- Rivedere le immagini nel software di imaging che utilizzano Applicazioni> Commenta Multi Dimensional dati> nome del file aperto. Identificare rami stabili assone (20 micron di lunghezza) che si formano durante la sessione di imaging. Utilizzare lo strumento draw line per misurare un branc stableaxonh dalla base presso l'assone fino alla punta per garantire la durata di qualifica di 20 micron è soddisfatta.
- In un foglio di calcolo, registrare il numero di telaio dopo stimolazione netrina quando sporgenze membrana iniziano in aree in cui i rami più tardi si formano così come il numero di fotogramma dopo stimolazione netrina quando rami nascenti raggiungono i 20 micron di lunghezza.
- Moltiplicare il numero di fotogrammi tra protrusione e la formazione ramo da 20 secondi per calcolare il tempo di formazione per ogni ramo.
5. Manipolazioni tossina fisso immunofluorescenza cellulare
- A 2 DIV, il trattamento di neuroni in condizioni sperimentali con 250 ng / ml netrina-1 e / o 10 nM botulinica una tossina (BoNTA), che scinde il SNAP25 proteine SNARE e inibisce efficacemente SNARE esocitosi mediata 13, oltre a 250 ng / ml netrin- 1. Lasciare una serie di neuroni non trattati come condizione di controllo.
ATTENZIONE: BoNTA richiede l'uso di occhi e protezione respiratoria durante la preparazione e l'usosoluzioni. Mantenere tutti i materiali contaminati come materiali biologicamente pericolosi e autoclave nel più breve tempo possibile. - Alle 3 DIV (trattamento post 24 ore) i media aspirato, e sostituire immediatamente con almeno 1 ml di soluzione PHEM (vedi Tabella 1 per i dettagli) riscaldato a 37 ° C. Incubare per 20 minuti al buio a temperatura ambiente.
- Sciacquare 3x con PBS (per la futura tenuta l'uso con parafilm e conservare a 4 ° C).
- Luogo coprioggetto in scuro, camera di colorazione umidificata e permeabilize le membrane cellulari per 10 min a fresco diluito 0,2% TritonX-100 in PBS (fatta dal 10% TritonX-100 magazzino).
- Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e sciacquare con 50 ml di 1x con PBS. Blocco per 30 min a ~ 50 ml di 10% di sieroalbumina bovina in PBS (BSA-PBS) o il 10% Bollito Donkey siero in PBS a temperatura ambiente.
- Risciacquare con PBS 1x di nuovo. Incubare coprioggetto in 50 ml di anticorpo primario (1: 1.000 βIII tubulina, per confermare l'identità neuronale) in 1% BSA-PBS per 1 ora a RT, nell'oscurità.
- Eseguire 3x 5 min lavaggi in PBS. Incubare vetrini in 50 ml di anticorpo secondario spettralmente-distinta per tubulina (1: 400), e falloidina fluorescenti (a seconda del eccitazione: 488 falloidina a 1: 400, 647 falloidina a 1: 100) in 1% BSA-PBS per 1 ora .
- Lavare 3x 5 min in PBS 1x e montare su vetrini coprioggetto nei mezzi di montaggio.
- Vacuum eccesso mezzo di montaggio dai bordi del coprioggetto e sigillare con smalto trasparente.
- Raccogliere le immagini epifluorescenza grandangolari su un microscopio invertito con un obiettivo 40X 1.4NA, capacità epifluorescente e EM-CCD.
- analizzare manualmente ramificazione utilizzando ImageJ. Aperte pile di immagini in ImageJ trascinando il file nella finestra o andare su File> Apri> Nome file (Figura 4A inserto 1).
- Utilizzando la linea> linea segmentato, tracciare l'assone, definito come la neurite più lungo che si estende dal soma (Figura 4A inserto 2 - 3).
- Utilizzando Analizza> Strumenti> ROI Manager, salvare l'assone tracciando come una regione di interesse. Tracciare e salvare ogni ramo assone, definita come una neurite ≥20 micron di lunghezza. Includi rami solo primari (escrescenze che spuntano direttamente dal assone) per l'analisi (Figura 4A inserto 3 - 4).
- Premere 'm' per misurare le regioni salvati di interesse, e trasferire le lunghezze in pixel di un foglio di calcolo per calcolare la lunghezza di micron.
- Dividere il numero di rami assoni ≥20 micron di lunghezza, per la lunghezza dell'assone in micron diviso per 100 per ottenere il numero di rami assoni per 100 micron di lunghezza.
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Representative Results
Utilizzando tecniche biochimiche in vitro per saggiare la quantità di SDS-resistenti complessi SNARE in una popolazione di neuroni. La figura 1 mostra la conseguente Western Blot a seguito del completamento del SDS-resistente SNARE saggio complesso sondato per SNAP-25, syntaxin1A e VAMP2.
TIRF Microscopia a livello della membrana delle cellule basali fornisce immagini ad alta risoluzione di singoli eventi di fusione esocitosi in singole cellule. Figura 2a mostra la metodologia di analisi delle immagini per identificare VAMP2-pHluorin mediate eventi esocitosi. L'inserto mostra un singolo evento esocitica si verifica la fusione delle vescicole e come VAMP2-pHluorin diffonde all'interno della membrana plasmatica. La Figura 2B mostra un esempio di un evento esocitica verificano nel tempo (secondi) in un neurone corticale. inserti ingrandite indicano il soma, un ramo assone e un cono di crescita assonale che mostra le Spätil'utilità al di questo test. Circles denotano eventi di fusione esocitica singoli, che possono essere visti tramite microscopia TIRF.
Timelapse DIC imaging netrin stimolato assone ramificazione rivela i tempi di formazione ramo dell'assone. La Figura 3 illustra la formazione di un ramo assone in tempo reale dopo stimolazione netrin. frecce bianche indicano la sporgenza iniziale da un sito della filiale. frecce nere indicano un ramo stabile completamente formata di almeno 20μm misura dalla assone principale alla punta ramo. Netrina aumenta dipendenti in assone ramificazione si verifica a seguito netrina aumenta dipendenti in fusione di esocitica.
Immunocitochimica delle cellule fissa combinata con l'inibizione farmacologica dell'attività SNARE mostra che SNARE mediata esocitosi è un requisito per assone corticale ramificazione. 4A, delinea un processo graduale di tracciati filiali Perfo confermate in ImageJ. figura 4B mostra immagini rappresentative di neuroni corticali in 3DIV. Le condizioni sono le seguenti: non trattato, stimolate con 250 ng netrina / ml, o trattato con BoNTA e 250 netrin ml / ng per 24 ore.
Figura 1. Utilizzando la Resistenza SDS di SNARE Complessi come quantificabile metrico di SNARE Formazione in vitro. Una macchia rappresentante occidentale sondato per SNARE membri complesse VAMP2, Syntaxin1A e SNAP-25 ed il controllo di carico BIII tubulina. Entrambi SNARE proteine in monomeri complesse e identificabili sono mostrati. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Imaging cellulare dal vivo e la quantificazione dei esocitica fusione della vescicola Eventi a neuroni corticali. (A) Passo dopo passo contorno della esocitica analisi delle immagini fusione delle vescicole come è stata eseguita manualmente utilizzando ImageJ. Pannelli (B) Inset mostrano un unico VAMP2-pHlourin evento fusione delle vescicole, come si verifica nel corso del tempo. Il secondo pannello con un'immagine TIRF microscopio di un intero neurone corticale esprimere VAMP2-pHlourin a 2DIV. scatole linea tratteggiata indicano le regioni di interesse come illustrato di seguito: soma, ramo assone, e un cono di crescita assonale. Cerchi con le regioni di interesse denotano singoli eventi di fusione delle vescicole. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Lungo Termine Live Cell DIC Imaging rivela Timing netrina-1 immagini dal vivo di cellule dipendenti Axon Branching. DIC di un neurone corticale che mostra la formazione di rami degli assoni in risposta alla stimolazione netrin. frecce bianche indicano punti di protrusione iniziale prima della neurite raggiungendo 20 micron di lunghezza. frecce nere indicano rami buona fede (lunghezza ≥20 micron). Il tempo indicato come ora: min. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Fissa immunofluorescenza cellulare Accoppiato con tossina inibizione di Esocitosi Indica che Esocitosi è necessario per Netrin-1 dipendenti Axon Branching. (A) Schema delle fasi di tracciamento e di analisi per la quantificazione di assoni ramificano in un netrina stimolato neurone corticale a 3DIV. (B) Immagini rappresentative della neuroni corticali in 3DIV di ogni condizione sperimentale: non trattata, stimolati con 250 ng / mL netrina, o trattato con 10 nM BoNTA tossina più 250 ng netrina / ml. Il verde è F-Actina (falloidina), il rosso è βIIItubulin. Le frecce indicano i punti di rami degli assoni ≥20 micron di lunghezza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Ricetta |
| buffer di omogeneizzazione | 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. Più necessarie proteasi e fosfatasi inibitori dipende dal tipo di cella |
| tampone campione 2x | 60 mM Tris-HCI pH 6,75, 5% (v / v) fI-mercaptoetanolo, 2% (w / v) di SDS, 10% (w / v) di glicerolo, 0,007% (w /v) blu di bromofenolo |
| PHEM fissativo | 60 TUBI mM pH 7,0, 25mM HEPES pH 7,0, 10mM EGTA pH 8,0, 2 mM MgCl 2, 0.12 M saccarosio, 4% PFA |
| supporti di montaggio | 20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% N-propil gallato, 90% glicerolo alta qualità, MilliQ H 2 O |
| 10X SDS tampone di corsa | Sciogliere 30.0 g di Tris base, 144,0 g di glicina, e 10,0 g di SDS in 1000 ml di H 2 O, pH 8,3. Diluire a 1x. |
| 10X buffer di trasferimento | Sciogliere 30,3 g di Tris per 250 mm e 144,1 g Glycine per 1,92 M soluzione in 1 LH 2 O; (per 1 L 1x tampone inserirlo 100ml soluzione 10x a 200 ml MeOH e 700 ml DI freddo H 2 O) |
| Siero Free Media (SFM) | 50 ml: 0,5 ml di L-glutammina, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal media |
| Tripsina Quenching media (TQM) | 50 ml: 0,5 ml di L-glutammina, 2,5 ml di FBS, 47 ml NeurobAsal media |
| TRIS Buffered Saline | 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl in 1 LH 2 O; (Per TBS-T aggiungere 1 ml di Tween-20) |
Tabella 1. Soluzioni
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health: RO1-GM108970 (SLG) e F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
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