Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

Published: March 16, 2016 doi: 10.3791/53743
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

Protocol

بيان من أخلاقيات البحث: جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات بالتفصيل هنا ويخضع للقواعد والأنظمة المعمول بها في لجنة قيادة الأمم المتحدة في رعاية الحيوان ومعايير المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام حيوانات المختبر.

1. إعداد وطلاء من فصل العصبونات القشرية

  1. الموت ببطء توقيت الحامل الإناث من CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم. إزالة العقول كلها من جماجم الجنينية يوم 15.5 (E15.5) الفئران وmicrodissect القشور من كل نصف الكرة الغربي. للحصول على إرشادات مفصلة عن تسليخ مجهري من القشرة الماوس الجنينية يرجى الاطلاع Viesselmann آخرون 8.
  2. وضع لا يزيد عن 4 القشور في 1 مل من وسائل الاعلام تشريح في معقم 1.6 مل microtube. إضافة 120 ميكرولتر من 10X التربسين وعكس الأنبوب 3-5 مرات لخلط.
  3. باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا البذور أطباق زراعة الخلايا. ملاحظة: توفر 1 نصف الكرة القشرية approximately ثلاثة ملايين الخلايا.
    1. لمقاومة للSDS كمين فحص الكيمياء الحيوية المعقدة، لوحة ستة ملايين الخلايا في 35 طبق مم والاستفادة من طبقين لكل حالة. ملاحظة: يتم تبسيط هذه باستخدام 6 لوحات جيدا عند مقارنة شروط متعددة.
    2. لفحوصات المتفرعة، تغسل الخلايا العصبية لوحة على حمض النيتريك coverslips دائرية في مناطق ذات كثافة من 250000 خلية لكل 35 مم طبق، لمدينة دبي للإنترنت التصوير من محور عصبي المتفرعة لوحة في مناطق ذات كثافة من 150،000. هذه الكثافة تجنب الاكتظاظ وتبسيط التحليل.
  4. ليعيش المجهر خلية TIRF، و resuspend مليوني الخلايا العصبية في ترنسفكأيشن في nucleofection حل في RT.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من خلية إلى تعليق microtube تحتوي على 10 ميكروغرام من VAMP2-pHlourin التعبير البلازميد وelectroporate مع nucleofector وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 9.
    2. بعد تعداء إضافة على الفور 500 ميكرولتر من التربسين التبريد وسائل الإعلام، وإزالة تعليق من خلايا كفيت ولوحة في دنSITY من 400000 خلية لكل 35 مم الزجاج المطلي PDL طبق السفلي.
  5. لوحة جميع الخلايا العصبية القشرية في 2 مل من الإعلام الحر في الدم.

2. كمين تشكيل مجمع الفحص

ملاحظة: تم تجهيز المجمعات كمين المقاومة للSDS وتحليلها كما هو موضح في الأصل 10 مع التعديلات المفصلة أدناه. عن الأجسام المضادة بديلة التحقق من صحة لتلك المستخدمة هنا، راجع قسم المواد.

  1. تحفيز الخلايا العصبية القشرية E15.5 2 أيام في المختبر (DIV) مع 250 نانوغرام مل netrin-1 أو صورية التحكم / لمدة 1 ساعة قبل تحلل.
  2. قبل تجهيز العينات، الطرد المركزي بارد إلى 4 درجات مئوية، وضبط درجة الحرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية، وكتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
  3. إزالة الأطباق خلية من الحاضنة ومكان على الجليد.
    1. وسائل الإعلام نضح من الخلايا، تحل محل مع ~ 2 مل الجليد الفوسفات الباردة مخزنة المالحة (PBS) بلطف 2 مرات عن 1-2 دقائق لكل يغسل.
    2. لهذا الاختبار، استخدام 2 آبار في كوندition.
    3. نضح في برنامج تلفزيوني من البئر الأول من شرط واستبدالها مع 250 العازلة التجانس ميكرولتر. ترك على الجليد لمدة 5 دقائق، ثم باستخدام رافع الخلية، والتجانس الخلايا على الجليد.
    4. نضح في برنامج تلفزيوني من البئر المقبل للحالة نفسها وإضافة الخليط المتجانس في الآونة الأخيرة إلى البئر. سيؤدي هذا إلى زيادة تركيزات البروتين. أكرر لجميع الظروف.
    5. عند الانتهاء، ماصة يتجانس الخليط حل لتبرد قبل 1.6 مل microtube على الجليد وإضافة 20٪ TritonX-100 من أجل التوصل إلى تركيز النهائي من 1٪ TritonX-100. يسحن خلط 10 مرات مع 1000 ميكرولتر ماصة مع التقليل من الفقاعات.
  4. احتضان أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة لإذابة البروتينات. بعد الحضانة، الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6010 إطار التعاون الإقليمي في 4 درجات مئوية لتكوير المواد غير بالفاعلات. نقل طاف المحللة في المبرد أنبوب 1.6 مل جديد على الجليد.
  5. لتحليل تركيز البروتين باستخدام برادفورد فحص 11 وتمييع عينات إلى الاتحاد الدولي للسباحةلتر تركيز البروتين من 3-5 ملغ / مل مع العازلة التجانس تستكمل مع 1٪ TritonX-100 وعينة العازلة 5X تستكمل مع B-Mercaptethanol (BME) المتبقية.
  6. تقسيم كل عينة تجريبية بالتساوي في 2 الأنابيب. احتضان عينة واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (المجمعات الفخ)، والآخر في 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (أحادية الفخ). عكس الأنابيب بشكل متقطع للحفاظ على عينات في الحل.
  7. تجميد العينات عند -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لفصل عبر SDS-PAGE. قبل تشغيل عينات عن طريق الكهربائي باستخدام تقنيات القياسية، reboil عينات المغلي سابقا لمدة 5 دقائق في 100 درجة مئوية، ولكن ذوبان الجليد 37 ° C عينات في RT.
  8. التكرارات تشغيل العينات (30 - 40 ميكروغرام من البروتين لكل عينة) على كل من 8٪ ومادة هلامية بنسبة 15٪. توفر 8٪ الفصل المثالي للمجمع، في حين يتم استخدام 15٪ لتحديد أحادية البروتين الفخ (SNAP-25 ~ 25kDa، VAMP2 ~ 18kDa، syntaxin-1 ~ 35kDa). الحفاظ على مصدر الطاقة في 70 V حتى خط صبغ هو من خلال STACالملك جل وزيادة الجهد 90V. تشغيل المواد الهلامية حتى يعمل صبغ خارج.
  9. للحفاظ على أحادية، ونقل البروتينات إلى 0.2 ميكرومتر غشاء النيتروسليلوز على الجليد باستخدام عازلة نقل البارد مع 20٪ ميثانول (MeOH) وأضاف، في 70 V لمدة 45 دقيقة.
  10. غشاء الجافة في طبق مغطى لمدة 2 ساعة إلى O / N في RT (O / N يوفر أفضل النتائج).
  11. كتلة كمين الأغشية المعقدة في 10٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لمدة 1 ساعة على RT.
  12. إعداد الأجسام المضادة الأولية (الاعتراف مكونات محددة كمين مجمع) في التخفيف من 1: 1000 والتحقيق O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر دوارة.
    1. شطف البقع في تريس مخزنة المالحة بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 (TBS-T) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  13. إعداد حلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في التخفيف من 1: 20،000 في 1٪ BSA في TBS-T والتحقيق لمدة 1 ساعة، وغطت في RT. كرر 2.12.1 الخطوة بعد 1 ساعة.
  14. البقع الصورة على جهاز المسح الفلورسنت مجهزة برمجيات وتحديد كل من شارك البروتين الفخmplex (عصابات مناعيا فوق 40kDa) وشرائح مونومر (عصابات مناعيا في 25 كيلو دالتون، 18 كيلو دالتون، 35 كيلو دالتون لSNAP-25، VAMP2 وsyntaxin-1، على التوالي) باستخدام تعليمات الشركة الصانعة لرسم رويس مستطيلة.

3. التصوير Exocytic الأحداث عبر TIRF المجهري

ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب معدات المجهر المتخصصة بما في ذلك غرفة البيئية للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2، مجهر TIRF المقلوب مجهزة الإضاءة epifluorescent، وارتفاع التكبير / ارتفاع الفتحة العددية (NA) هدف TIRF، مرحلة XYZ الآلي، و حساس تهمة جانب جهاز (CCD) كاشف. يستخدم هذا البروتوكول المجهر المقلوب مؤتمتة بالكامل مجهزة 100X 1.49NA TIRF الموضوعي الحالة الصلبة 491 نانومتر ليزر والكترون ضرب اتفاقية مكافحة التصحر (EM-CCD). ويسيطر على كل المعدات من قبل التصوير والمراقبة ليزر البرمجيات. قبل بداية قوة بروتوكول التصوير على عضو هيئة الجائزة مديرonmental غرفة، المرحلة، مصباح، والكمبيوتر، وكاميرا.

  1. حدد الهدف في برامج التصوير. وبمجرد أن الهدف من ذلك هو في مكان، وربط سخان موضوعية حول العنق.
  2. تأكيد يخفض هذا الهدف تماما قبل تأمين حاضنة مرحلة في فتحة المرحلة. صب الماء المقطر في مداخل مرحلة حاضنة بالتساوي لمنع التسرب.
  3. تشغيل نظام الحضانة. فتح صمام خزان CO 2 والتأكد من الضغط المناسب لنظام فقا لتعليمات الشركة الصانعة. السماح للغرفة بعض الوقت ليصل إلى 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. قبل إضافة الطبق التصوير، ووضع صحن فارغ في الحاضنة لتجنب تكثيف الماء على الهدف.
  4. الطاقة على مصدر الليزر.
  5. فتح حاضنة المرحلة، وإضافة زيت الغمر للعدسة. وضع العينة في الحاضنة واستقرار مع الأسلحة الاستقرار أو وزن الطبق. رفع الهدف حتى يجعل النفط اتصال مع الجزء السفلي من العينة. Switcساعة إلى الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن طريق والعثور على طائرة الوصل العصبية من خلال oculars.
  6. بدء برنامج الليزر والاتصال إلى برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر. تعيين الإضاءة إلى widefield وتحديد الهدف تستخدم (ينصح 100X 1.49 NA TIRF). تعيين معامل الانكسار من العينة (خلايا ~ 1.38). ضبط كثافة الليزر عن طريق إلغاء "TTL" ليزر 491 نانومتر. ضبط شريط التمرير إلى 100 ثم جعله يتراجع إلى قيمة تتراوح بين 20 - 40٪. إعادة فحص "TTL".
  7. التركيز على عينة مرة أخرى في الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن طريق. الذهاب إلى برامج التصوير واختيار إضاءة ليزر 491 نانومتر، ومصراع مفتوحة. غرامة ضبط بؤرة ليزر على السقف ومركز نقطة إلى مركز الحجاب الحاجز الحقل مغلقة مع المكثف إزالتها. وضع مكثف رأسا على عقب على مقاعد البدلاء البصرية، حتى لا عدسة الصفر.
  8. استبدال المكثف والذهاب إلى البرنامج TIRF وتحديد عمق الاختراق (PD) إلى 110 نانومتر. التحول من الإضاءة widefield إلى ILLUM TIRFوضع ination للتصوير.
  9. البحث VAMP2-phluorin معربا عن الخلايا خلال oculars باستخدام epifluorescence widefield مع مصدر الضوء epifluorescent.
    1. ضبط المعلمات التصوير (زمن التعرض، وزيادة وقوة الليزر) لتعظيم إشارة إلى نسبة الضوضاء والنطاق الديناميكي باستخدام وقت التعرض الحد الأدنى من وحدة ليزر للحد من photobleaching من والضيائية (على سبيل المثال: التعرض بين 50-100 ميللي ثانية، مع 15-30 الحصول على 30٪ أقصى قوة الليزر).
    2. تعيين أوتوفوكس المستمر لكل خلية. الحصول على صورة لقطات متتابعة مع مجموعة اكتساب يحدث كل 0.5 ثانية لمدة 5 دقائق. للشرط netrin-1 حفز، إضافة 500 نانوغرام netrin-1 / مل على طبق من الخلايا في غطاء تدفق الصفحي وإعادة الإناء إلى الحاضنة لمدة 1 ساعة قبل التصوير.
  10. لتحديد وتيرة الأحداث exocytic تطبيع في مجال الخلايا والوقت، وفتح مداخن صورة في ImageJ عن طريق سحب الملف إلى نافذة أو الذهاب إلى ملف> فتح> اسم الملف (الشكل0؛ 2A أقحم 1).
    1. لإزالة إشارات فلوري المستقرة التي لا تمثل الأحداث حويصلة الانصهار، إنشاء متوسط ​​ض الإسقاط من كومة بأكمله باستخدام صورة> المكدس> Z-مشروع> نوع الإسقاط: متوسط ​​الكثافة. طرح هذا يعني صورة من كل صورة في لقطات متتابعة باستخدام عملية> صورة حاسبة> Image1 و: عملية الكدسة: طرح Image2 تم إنشاؤها حديثا متوسط ​​ض الإسقاط. وهذا يؤكد الأحداث exocytic (الشكل 2A أقحم 2-3).
    2. عدد الأحداث الانصهار exocytic بالعين. يتم تعريف الأحداث Exocytic مثل ظهور إشارة مضان محدودة الحيود، الذي ينشر بسرعة كما ينشر VAMP2-phluorin داخل غشاء البلازما (الشكل 2A أقحم 6).
    3. استخدام الأمر عتبة لتسليط الضوء على الصورة الأولى باستخدام صورة> ضبط> العتبة> ضبط المنزلق حتى الخلية كلها أبرزت عتبة (الشكل 2A أقحم 7-8).
    4. تحت آناينحل، اختر SetMeasurements وتحقق من المنطقة والتسمية العرض. حدد منطقة الخلوية thresholded باستخدام أداة العصا تتبع واضغط على "م" لقياس (الشكل 2A أقحم 7-8).
    5. نقل كل من أحداث الانصهار exocytic الفرز، القياسات مساحة الخلية، ووقت التصوير المنقضي إلى جدول بيانات لحساب عدد من exocytic الأحداث / مم 2 / الساعة (الشكل 2A أقحم 9).

4. التفاضلية التدخل التباين (DIC) لقطات متتابعة المجهر من أكسون التشعب

ملاحظة: بروتوكول كامل ومظاهرة للنهج عام لتصوير مدينة دبي للإنترنت متاح 12. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم مدينة دبي للإنترنت، ويمكن استخدام أساليب المجهر الخفيفة التي تنتقل عن طريق أخرى لنفس الأغراض (على سبيل المثال: النقيض من المرحلة).

  1. في 2 DIV، مكان الزجاج طبق التصوير السفلي تحتوي على الخلايا العصبية untransfected في غرفة البيئية قبل تحسنت للحفاظ على الحياة الفطرية الرطبةironment مع 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. استخدام المجهر مجهزة 60X خطة-امزيغ، 1.4 NA مدينة دبي للإنترنت عدسة موضوعية وارتفاع المكثف NA حصول على أفضل جودة الصورة والقرار.
  2. ضبط البؤري للعثور على الخلايا العصبية من خلال oculars باستخدام تنتقل الإضاءة الخفيفة.
  3. باستخدام وظيفة اكتساب منطقة متعددة في برامج التصوير، والعثور على وحفظ المواقع XYZ لا يقل عن 6 خلايا. ضع مرحلة بحيث الخلايا العصبية من صالح المصالح داخل مجال الرؤية حصول على أفضل النتائج.
    1. حفز مع 250 نانوغرام / مل netrin-1 ثم اضغط على "بدء اكتساب منطقة متعددة. بالتتابع الحصول على صور في كل موقف كل 20 ثانية لمدة 24 ساعة، والتوقف الاستحواذ وإعادة تركيز عند الضرورة.
  4. استعراض الصور في برامج التصوير باستخدام تطبيقات> مراجعة متعدد الأبعاد البيانات> اسم الملف المفتوح. تحديد فروع محور عصبي مستقرة (20 ميكرون طويل) هذا الشكل خلال الدورة التصوير. استخدام أداة التعادل خط لقياس الفروع الخارجية stableaxonح من القاعدة في محور عصبي إلى طرف لضمان أن يتحقق طول تأهيل 20 ميكرون.
    1. في جدول بيانات، تسجيل رقم الإطار بعد التحفيز netrin عند الشروع نتوءات غشاء في المناطق التي تشكل فروع في وقت لاحق وكذلك رقم الإطار بعد التحفيز netrin عندما تصل فروع الوليدة 20 ميكرون في الطول.
    2. ضرب عدد من الإطارات بين بروز وتشكيل فرع بنسبة 20 ثانية لحساب الوقت تشكيل لكل فرع.

5. التلاعب السمية والثابتة Immunofluoresence خلية

  1. في 2 DIV، علاج الخلايا العصبية في ظروف تجريبية مع 250 نانوغرام / مل netrin-1 و / أو 10 نانومتر البوتولينوم توكسين (BONTA)، الذي يشق على SNAP25 البروتين الفخ ويمنع بشكل فعال كمين بوساطة إيماس 13، بالإضافة إلى 250 نانوغرام / مل netrin- 1. ترك مجموعة واحدة من الخلايا العصبية غير المعالجة كشرط السيطرة.
    تنبيه: BONTA يتطلب استخدام العين وحماية الجهاز التنفسي عند إعداد واستخدامالحلول. الحفاظ على جميع المواد الملوثة والمواد biohazardous والأوتوكلاف في أقرب وقت ممكن.
  2. في 3 DIV (24 ساعة بعد العلاج) وسائل الاعلام نضح، واستبدال مباشرة مع 1 مل على الأقل من الإصلاح PHEM (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل) تحسنت إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في RT.
  3. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني (لختم استخدامها في المستقبل مع بارافيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية).
  4. مكان coverslips في الظلام، غرفة تلطيخ مرطب وpermeabilize أغشية الخلايا لمدة 10 دقيقة في المخفف الطازج بنسبة 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني (مصنوعة من 10٪ الأسهم TritonX-100).
  5. إزالة حل permeabilization وشطف مع 50 ميكرولتر من 1X مع برنامج تلفزيوني. كتلة لمدة 30 دقيقة في ~ 50 ميكرولتر من 10٪ الأبقار مصل الزلال في برنامج تلفزيوني (BSA-PBS) أو 10٪ المغلي حمار المصل في برنامج تلفزيوني في RT.
  6. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X مرة أخرى. احتضان coverslips في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 βIII تويولين، لتأكيد هوية الخلايا العصبية) في 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT، في الظلام.
  7. أداء 3X 5 يغسل دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان coverslips في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية طيفيا-مميز للتويولين (1: 400)، وphalloidin فلوري (يختلف حسب الإثارة: 488 phalloidin في 1: 400، 647 phalloidin في 1: 100) في 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة .
  8. غسل 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X وجبل coverslips على الشرائح في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
  9. فراغ زيادة وسائل الإعلام متزايدة من حواف ساترة وختم مع طلاء الأظافر واضحة.
  10. جمع الصور epifluorescence widefield على مجهر مقلوب مع هدف 40X 1.4NA، وقدرات epifluorescent وEM-CCD.
    1. تحليل يدويا المتفرعة باستخدام يماغيج. مداخن صورة مفتوحة في ImageJ عن طريق سحب الملف إلى نافذة أو الذهاب إلى ملف> فتح> اسم الملف (الشكل 4A أقحم 1).
    2. باستخدام خط> خط مجزأة، وتتبع محور عصبي، الذي يعرف بأنه أطول محوار تمتد من سوما (الشكل 4A أقحم 2-3).
    3. عن طريق تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار، وتوفير محور عصبي تتبع كمنطقة ذات الاهتمام. تعقب وحفظ كل فرع محور عصبي، الذي يعرف بأنه محوار ≥20 ميكرون في الطول. تشمل فروع فقط الابتدائية (الامتداد تنتشر مباشرة من محور عصبي) في التحليل (الشكل 4A أقحم 3-4).
    4. اضغط على "م" لقياس المناطق المحفوظة في المصالح، ونقل أطوال بالبكسل إلى جدول بيانات لحساب طول في ميكرون.
    5. تقسيم عدد من فروع محور عصبي ≥20 ميكرون في الطول، بسبب طول محور عصبي في ميكرون مقسوما على 100 للحصول على عدد من فروع محور عصبي في 100 طول ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام في المختبر التقنيات الحيوية لفحص كمية من المجمعات كمين المقاومة للSDS في عدد السكان من الخلايا العصبية. ويبين الشكل (1) ومما أدى لطخة غربية في أعقاب الانتهاء من الفخ فحص معقد مقاومة للSDS بحثها عن SNAP-25، syntaxin1A وVAMP2.

المجهر TIRF في غشاء الخلية القاعدية يوفر صور عالية الدقة من الأحداث الانصهار exocytic الفردية في الخلايا وحيدة الشكل 2A يدل على منهجية تحليل الصور لتحديد VAMP2-phluorin بوساطة الأحداث exocytic. يظهر أقحم حدث exocytic واحد كما يحدث حويصلة الانصهار وكما ينشر VAMP2-phluorin داخل غشاء البلازما. ويبين الشكل 2B مثالا حدث exocytic التي تحدث على مر الزمن (ثانية) في الخلايا العصبية القشرية. إدراجات مكبرة للدلالة على سوما، فرع محور عصبي ومخروط نمو محور عصبي تبين spatiآل فائدة هذا الاختبار. الدوائر تدل الأحداث الانصهار exocytic واحدة، وهو ما يمكن ملاحظته من خلال TIRF المجهري.

لقطات متتابعة مدينة دبي للإنترنت التصوير netrin تحفيز محور عصبي المتفرعة يكشف عن توقيت تشكيل فرع محور عصبي الشكل 3 يصور تشكيل فرع محور عصبي في الوقت الحقيقي بعد التحفيز netrin. السهام البيضاء للدلالة على نتوء الأولي من موقع الفرع. السهام السوداء دلالة على فرع مستقر تشكيلها بالكامل من 20μm على الأقل قياس من المحور الرئيسي للطرف فرع. Netrin الزيادات تعتمد في المتفرعة محور عصبي يحدث في أعقاب الزيادات تعتمد netrin في الانصهار exocytic.

ثابت مناعية الخلايا جنبا إلى جنب مع تثبيط الدوائية النشاط كمين يظهر أن الفخ بوساطة إيماس ضروري لمحور عصبي القشرية المتفرعة. الشكل 4A، الخطوط العريضة لخطوة خطوة عملية لاقتفاء أثر فرع PERFO rmed في ImageJ. ويبين الشكل 4B صور تمثيلية من العصبونات القشرية في 3DIV. الشروط هي على النحو التالي: غير المعالجة، وحفز مع 250 نانوغرام / مل netrin، أو تعامل مع BONTA و 250 نانوغرام / مل netrin لمدة 24 ساعة.

الشكل 1
الشكل 1. عن طريق المقاومة SDS من كمين مجمعات باعتبارها قابلة للقياس متري من فخ تشكيل في المختبر. وصمة عار الغربية تمثيلية سبر لأعضاء كمين معقد VAMP2، Syntaxin1A وSNAP-25 والسيطرة تحميل BIII تويولين. كلا كمين ترد البروتينات في أحادية معقدة ومحددة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خريج "/>
الشكل 2. التصوير الخلية الحية والكمي لExocytic الحويصلة فيوجن الأحداث في العصبونات القشرية. (A) خطوة بخطوة الخطوط العريضة للتحليل الصور حويصلة الانصهار exocytic كما تم تنفيذ يدويا باستخدام يماغيج. لوحات (ب) أقحم تظهر VAMP2-pHlourin الحدث حويصلة الانصهار واحد كما يحدث مع مرور الوقت. الفريق الثاني يضم صورة TIRF المجهري الخلايا العصبية القشرية كلها تعبر عن VAMP2-pHlourin في 2DIV. صناديق خط منقط للدلالة على المناطق ذات الاهتمام كما هو مبين أدناه: سوما، فرع محور عصبي، ومخروط نمو محور عصبي. الدوائر مع المناطق ذات الاهتمام تدل الأحداث حويصلة الانصهار واحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. على المدى الطويل DI الخلية الحيةC التصوير يكشف توقيت Netrin-1 التابعة أكسون التشعب. DIC الصور الخلية الحية من الخلايا العصبية القشرية تظهر تشكيل فروع محور عصبي ردا على التحفيز netrin. السهام البيضاء تدل على نقاط نتوء الأولي قبل محوار تصل إلى 20 ميكرون في الطول. السهام السوداء للدلالة فروع المخلصين (طول ≥20 ميكرون). الساعة يرمز لها ساعة: دقيقة من فضلك انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. الثابتة المناعي خلية إلى جانب تثبيط السمية من إيماس يبين أن إيماس هو مطلوب لNetrin-1 التابع أكسون التشعب. (A) لمحة عامة عن عملية تعقب وتحليل الخطوات لالكمي من محور عصبي المتفرعة في netrin تحفيز الخلايا العصبية القشرية في 3DIV. (ب) صور الممثل من الخلايا العصبية القشرية في 3DIV كل حالة تجريبية: غير المعالجة، وحفز مع 250 نانوغرام / مل netrin، أو تعامل مع 10 نانومتر BONTA السم بالإضافة إلى 250 نانوغرام / مل netrin. الأخضر هو F-أكتين (phalloidin)، الأحمر هو βIIItubulin. سهام دلالة نقاط من فروع محور عصبي ≥20 ميكرون في الطول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل وصفة
عازلة التجانس 10 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.4،150 ملي ناجي، 1 ملي EGTA. بالإضافة اللازمة البروتيني والفوسفاتيز مثبطات تعتمد على نوع من الخلايا
عازلة عينة 2X 60 ملي تريس، HCI درجة الحموضة 6.75، 5٪ (ت / ت) فاي المركابتويثانول، 2٪ (ث / ت) SDS، 10٪ (ث / ت) الجلسرين، 0.007٪ (وزن /ت) الأزرق برموفينول
PHEM تثبيتي 60 أنابيب ملي 7.0 درجة الحموضة، 25MM HEPES 7.0 درجة الحموضة، ودرجة الحموضة 8.0 10MM، 2 مم MgCl 2، 0.12 M السكروز EGTA، 4٪ PFA
تركيب وسائل الإعلام 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، و 0.5٪ N-بروبيل-غالاتي، و 90٪ جودة عالية الجلسرين، MilliQ H 2 O
10X SDS تشغيل العازلة حل 30.0 غرام من قاعدة تريس، 144.0 غرام من الجلايسين، و 10.0 غرام من SDS في 1000 مل من H 2 O، ودرجة الحموضة 8.3. تمييع ل1x أخرى.
الواق نقل 10X حل 30.3 غرام تريس 250 ملم و144.1 ز جليكاين عن 1.92 م حل في 1 LH 2 O؛ (لمدة 1 L عازلة 1X إضافة 100ML 10X الحل إلى 200 مل MeOH و 700 مل DI البارد H 2 O)
المصل وسائل الإعلام الحرة (SFM) 50 مل: 0.5 مل L-الجلوتامين، 1 مل B27، 48.5 مل Neurobasal وسائل الإعلام
التربسين تسقيه وسائل الإعلام (إدارة الجودة الشاملة) 50 مل: 0.5 مل L-الجلوتامين، 2.5 مل FBS، 47 مل Neurobالعسل وسائل الإعلام
تريس مخزنة المالحة 50 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم في 1 LH 2 O؛ (للTBS-T إضافة 1 مل توين-20)

الجدول 1. حلول

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة: ​​RO1-GM108970 (SLG) وF31-NS087837 (CW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture treated plates Olympus Plastics 25-105
glass coverslips Fisher scientific 12-545-81 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution Lonza VPG-1001 100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator Lonza program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes Matek Corporation p356-1.5-14-C must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope Olympus
Lambda LS xenon lamp Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective Olympus
Andor iXon EM-CCD Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System LI-COR Odyssey CL-X Used for scanning blots
Image studio software suite LI-COR Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus Molecular devices, LLC version 7.7.6.0 Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software Olympus Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J) NIH ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective Olympus
Neurobasal media GIBCO 21103-049 Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27 GIBCO 17504-044 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine 35050-061 1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin Bio Basic Incorporated 9048-46-8 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin Sigma 59427C
HEPES CELLGRO 25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg Corning 21-030-cm
Fetal bovine serum Corning/CELLGRO 35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning/CELLGRO 20-021-CV
NaCl Fisher scientific BP358-10
EGTA Fisher scientific CAS67-42-5
MgCl2 Fisher scientific BP214-500
TRIS HCl Sigma T5941-500
TRIS base Fisher scientific BP152-5
N-Propyl Gallate MP Biomedicals 102747
Glycerol Photometric grade Acros Organics 18469-5000
Glycerol (non optics grade) Fisher scientific CAS56-81-5
B-mercaptoethonal Fisher scientific BP176-100
SDS Fisher scientific BP166-500
Distilled Water  GIBCO 152340-147
Poly-D-Lysine Sigma p-7886 Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA List Biological Laboratories 128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2 Cell signaling 11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A Santa Cruz Biotechnology sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25 Santa Cruz Biotechnology sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin  Covance MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies LI-COR P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane Biorad 9004-70-0
Tween-20 Fisher scientific BP337-500
Methanol Fisher scientific S25426A
Bromphenol Blue Sigma B5525-5G
Sucrose Fisher scientific S6-212
Paraformaldehyde Fisher scientific O-4042-500
Triton-X100 Fisher scientific BP151-500
TEMED Fisher scientific BP150-20
40% Bis-Acrylimide Fisher scientific BP1408-1
Name Company Catalog Number Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone Sigma Aldrich S0664
 Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) Synaptic Systems 104-211
Mouse Monoclonal SNAP25 Synaptic Systems 111-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
  4. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  5. Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
  6. Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
  7. Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
  8. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).

Tags

علم الأعصاب، العدد 109، TIRF المجهري، مدينة دبي للإنترنت، لقطات متتابعة، إيماس، أكسون التشعب، سيتولوجية مناعية، البوتولينوم
الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkle, C. C., Hanlin, C. C.,… More

Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (109), e53743, doi:10.3791/53743 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter