Protocol
연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 규칙과 동물 관리에 UNC위원회의 규정과 관리 및 실험 동물의 사용을위한 NIH 기준이 적용됩니다.
1. 준비 및 해리 두피 뉴런의 도금
- CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 초과 임신 여성을 안락사. 각 반구에서 배아 일 15.5 (E15.5) 마우스 및 microdissect 피질의 두개골에서 전체 뇌를 제거합니다. Viesselmann 등의 알 (8)를 참조하십시오 배아 마우스 피질의 미세 절제에 관한 자세한 지침.
- 멸균 1.6 ml의 마이크로 튜브에 해부 미디어 1 ㎖에는 4 개 이상의 피질을 배치합니다. 10 배 트립신의 120 μl를 추가하고 관 3 반전 - 혼합 5 회.
- 혈구를 사용하여, 세포는 세포 배양 접시를 시드 계산합니다. 주 : 1 피질 반구가 제공하는 approximately 삼백만 세포.
- SDS 방지 SNARE 복잡한 생화학 분석의 경우, 35mm 접시 당 육백만 세포를 판과 상태에 따라 두 가지 요리를 이용한다. 주 :이 여러 조건을 비교하면 6 웰 플레이트를 사용함으로써 단순화된다.
- 분지 분석 들어 질산 접시 뉴런 150,000의 밀도로 축삭 분지 판 DIC 이미징, 35mm 접시 당 250,000 세포의 밀도로 순환 된 커버 세척 하였다. 이 밀도는 인구 과잉을 방지하고 분석을 단순화합니다.
- 라이브 셀 TIRF 현미경의 경우, 실온에서 nucleofection 솔루션에 형질 전환 당 이백 만 신경을 재현 탁.
- 제조 업체 프로토콜 (9)에 따라 nucleofector와 VAMP2 - pHlourin 발현 플라스미드 및 electroporate 10 μg의 포함 된 마이크로 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 추가합니다.
- 형질 즉시 트립신 담금질 매체의 500 μl를 추가 한 후, 서재에서 큐벳 및 플레이트 세포 현탁액을 제거35mm PDL 코팅 유리 바닥 접시 당 400,000 세포의 SITY.
- 플레이트 혈청이없는 배지 2 ㎖의 모든 대뇌 피질의 뉴런.
2. SNARE 복합체 형성의 분석
참고 : SDS 방지 SNARE 복합체 처리 원래 아래에 자세히 설명 수정과 (10)를 기술 된 바와 같이 분석 하였다. 여기에 사용 된 것과 검증 된 대안 항체를 들어, 자료 섹션을 참조하십시오.
- 이전의 용해에 1 시간 동안 250 NG / ㎖ netrin-1 또는 가짜 제어 시험 관내 (DIV)에 E15.5 대뇌 피질의 뉴런 2 일 자극한다.
- 처리 샘플, 37 ° C 4 ° C로 냉각 원심 분리기 및 설정 수조 온도 100 ° C의 열 블록에 이전.
- 인큐베이터에서 세포 요리를 제거하고 얼음에 배치합니다.
- 세척 당 2 분 - 세포에서 대기음 매체는 2 ~와 ml의 얼음 추위 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 부드럽게 2 번 교체합니다.
- 이 분석을 위해, 콘드 당이 우물을 사용ition.
- 조건의 첫 번째 우물에서 대기음 PBS와 250 μl의 균질화 버퍼로 교체합니다. 얼음에 세포를 균질화, 5 분간 얼음에두고, 다음 셀 리프터를 사용.
- 동일한 조건의 다음 잘에서 PBS를 기음과 우물에 최근 균질 혼합물을 추가합니다. 이 단백질의 농도를 증가시킬 것이다. 모든 조건에 대해 반복합니다.
- 완료되면, 피펫 얼음에 미리 냉각 된 1.6 ml의 마이크로 튜브에 균질 액을 1 % 트리톤-100의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤-100을 추가한다. 거품을 최소화하면서 1000 μL 피펫으로 10 시간 혼합 씹다.
- 2 분 단백질을 가용화하는 얼음 튜브 부화. 4 ° C에서 6010 RCF에서 10 분 동안 배양, 원심 분리기에 이어 비 가용성 물질을 펠렛합니다. 얼음에 새로운 냉장 1.6 ML 튜브에 해물 뜨는 이동합니다.
- 브래드 포드 분석 (11)를 사용하여 단백질 농도 분석을 수행하고 FINA에 샘플을 희석B-Mercaptethanol (BME)으로 보충 된 1 % 트리톤 -100 5 배 샘플 버퍼가 보충 균질화 완충액 남은가 5mg / ml - 3 L의 단백질 농도.
- 이 튜브에 균등하게 각 실험 샘플을 나눈다. 30 분 (SNARE 복합체), 30 분 (SNARE 단량체) 100 ° C에서 다른 37 ° C에서 하나의 샘플을 인큐베이션. 용액의 샘플을 유지하기 위해 간헐적 튜브 전환.
- SDS-PAGE로 분리 할 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 동결 된 샘플. 100 ° C에서 5 분 동안 끓인 이전 샘플 재비 표준 기술을 사용하여 전기 영동을 통해 샘플을 실행하지만, RT에서 37 ° C 샘플을 해동 종래.
- 샘플의 실행 중복 (30 - 샘플 당 단백질 40 μg의) 8 %와 15 % 겔 모두; 15 %의 SNARE 단백질 단량체 (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, 신택-1 ~ 35kDa)을 정량화하는 데 사용되는 반면, 8 %는 단지의 이상적인 분리를 제공합니다. 염료 라인이 STAC 통해까지 70 V에서 전원을 유지90V에 왕 젤 증가 전압. 염료 전원이 소모 될 때까지 젤을 실행합니다.
- 단량체을 유지하려면 45 분 70 V에서 20 % 메탄올 (메탄올)을 첨가하여 차가운 전송 버퍼를 사용하여 얼음에 0.2 μm의 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송합니다.
- O 2 시간 동안 덮여 접시에 건조 막 / RT에서 N (O / N이 최상의 결과를 제공한다).
- 블록은 RT에서 1 시간 동안 10 %의 소 혈청 알부민 (BSA)의 복합 막을 스네어.
- 회전 진탕 기에서 4 ° C에서 1,000 프로브 O / N : 1의 희석 (특정 SNARE 복합체 구성 요소 인식) 일차 항체를 준비합니다.
- 트리스 완충 식염수 플러스 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 5 분마다 3 번에 말을 씻어.
- 1의 희석에 형광 차 항체 솔루션을 준비 : 20,000 1 %의 TBS-T에서 BSA와 프로브를 RT로 덮여 1 시간에 대해. 1 시간 후 단계를 반복 2.12.1.
- 형광 스캐닝 시스템의 이미지도 말은 소프트웨어 스위트를 장착하고 SNARE 단백질의 공동 모두 정량화직사각형의 ROI를 그리기위한 제조업체의 지침을 사용하여 (각각 25 kDa의 18 kDa의, SNAP-25, VAMP2 35 kDa의에서 면역 밴드와 신택-1) mplex (40kDa 위의 면역 밴드)와 단량체 밴드.
TIRF 현미경을 통해 3 이미징 Exocytic 이벤트
이 프로토콜은 온도, 습도, CO (2), epifluorescent 조명하는 고배율 / 높은 개구 수 (NA) TIRF 목적 자동화 된 XYZ 스테이지를 구비 한 반전 TIRF 현미경을 유지하는 환경 챔버를 포함 특수 현미경 장비를 필요로하고, 참고 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 검출기. 이 프로토콜은 100 배 1.49NA TIRF 목표 고체 491 nm의 레이저 및 전자 배가 CCD (EM-CCD)를 장착 한 완전 자동화 된 거꾸로 현미경을 사용합니다. 모든 장비는 이미징과 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어된다. envir 이전에 처음으로 촬상 프로토콜 전력onmental 실, 무대, 조명, 컴퓨터, 카메라.
- 이미징 소프트웨어 내에서 선택의 목적. 대물가 제자리에 있으면, 칼라 주위 대물 히터를 고정.
- 그 목적은 단 슬롯에 무대 인큐베이터을 확보하기 전에 완전히 내려 확인합니다. 유출을 방지하기 위해 균등 단계 인큐베이터 입구에 증류수를 붓는다.
- 배양 시스템을 켭니다. 이산화탄소 탱크 밸브를 열어 압력이 제조업체의 지침에 따라 시스템에 적합한 확인합니다. 실을 5 % CO 2, 37 °의 C에 도달하는 시간을 허용합니다. 촬상 접시를 첨가하기 전에, 대물 물 응축을 피하기 위해 인큐베이터에서 빈 접시를 배치했다.
- 레이저 소스의 전원을 켭니다.
- 오픈 스테이지 인큐베이터와 렌즈에 침지 기름을 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에서 샘플을 놓고 안정성 무기 또는 접시의 무게와 안정. 오일 샘플의 바닥에 닿을 때까지 대물을 올린다. Switc투과광 조명에 시간과 접안를 통해 신경 세포의 초점면을 찾을 수 있습니다.
- 레이저 소프트웨어를 시작하고 레이저 제어 소프트웨어에 연결합니다. 위드와 목적이 사용되는 선택 조명을 설정 (100X 1.49 NA TIRF 권장). 샘플의 설정 굴절률 (셀 ~ 1.38). 491 nm의 레이저에 대해 "TTL"를 취소하여 레이저 강도를 조정합니다. 40 % - 다음 20 사이의 값으로 다시 아래로 가져 (100) 슬라이더를 조정합니다. "TTL"을 다시 확인.
- 투과광 조명에 다시 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 이미징 소프트웨어로 이동하여 491 nm의 레이저 조명 및 오픈 셔터를 선택합니다. 미세 천장에 레이저의 초점을 조절하고 제거 응축기와 닫힌 필드 다이어프램의 중앙 지점을 중심. 그래서하지 스크래치 렌즈에 거꾸로 광학 벤치에 콘덴서를 배치합니다.
- 콘덴서를 교체하고 110 nm의 TIRF 소프트웨어 및 설정 침투 깊이 (PD)로 이동합니다. TIRF의 ILLUM에 위드 조명에서 전환이미징을위한 ination 모드.
- epifluorescent 광원으로 위드 표면 형광을 사용하여 접안을 통해 발현 세포 VAMP2-phluorin를 찾을 수 있습니다.
- 촬상 파라미터 (노출 시간, 게인 및 레이저 파워) (예 photobleaching에 및 광독성 줄이는 최소 노출 시간 및 레이저의 강도를 사용하여 노이즈 비율과 동적 범위의 신호를 최대화하도록 조정 : 50 ~ 노광 - 100 밀리 초, 15로 - 30 30 % 최대 레이저 파워)에서 얻을 수 있습니다.
- 셀 당 설정 연속 자동 초점. 인수는 5 분 동안 매 0.5 초마다 발생으로 설정 timelapse에 이미지를 획득. netrin 1 자극 조건, 층류 후드에서 세포의 접시-1 NG netrin 500 / ㎖를 추가로 촬상 전에 1 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환한다.
- , ImageJ에 오픈 이미지 스택> 열기> 파일 이름 (그림 창에 파일을 드래그하거나 파일로 이동하여 셀 영역 및 시간 당 정상화 exocytic 이벤트의 빈도를 정량화하기0; 2A 인셋 1).
- 평균 강도 : 소포 융합 이벤트를 나타내지 않는 안정된 형광 신호를 제거하려면 이미지> 스택> Z-프로젝트> 프로젝션 유형을 사용하여 전체 스택의 평균 Z 투영을 만듭니다. > 프로세스를 사용하여 timelapse에> 이미지 계산기 각 이미지에서 이미지 1을이 평균 이미지를 빼기 : 스택 작업 : 이미지 2를 새롭게 생성 된 평균 Z 투영을 뺍니다. 이 exocytic 이벤트 (- 3 그림 2A 삽입 된 2)를 강조한다.
- 눈으로 exocytic 융합 이벤트를 계산합니다. Exocytic 이벤트 급속 VAMP2-phluorin 플라즈마 막 (도 2A 인셋 6) 내에 확산으로 확산 회절 제한된 형광 신호의 모양으로서 정의된다.
- > 이미지를 사용하여 첫 번째 이미지를 강조 조정> 임계 값> 전체 셀이 임계 값 (- 8 그림 2A 삽입 된 7)를 강조 표시 될 때까지 슬라이더를 조정 임계 값 명령을 사용하십시오.
- 아나에서lyze, SetMeasurements을 선택하고 영역 표시 라벨을 확인합니다. (- 8 그림 2A 삽입 된 7)을 측정하기 위해 지팡이 추적 도구를 눌러 'm'을 사용하여 역치 휴대 영역을 선택합니다.
- 모두 exocytic 융합 이벤트 카운트 환승, 스프레드 시트 셀 면적을 측정하고, 경과 촬상 시간 exocytic 이벤트 / 2 mm / 시간의 수 (도 2A 인셋 9)를 산출한다.
4. 미분 간섭 대비 (DIC) 축삭 분기의 Timelapse입니다 현미경
참고 : DIC 이미징에 대한 일반적인 접근 방식에 대한 전체 프로토콜 및 데모 (12)을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 DIC를 이용하지만, 다른 투과광 현미경 법 (예 : 위상차)를 동일한 목적으로 사용될 수있다.
- 2 DIV에서, 사전 예열 환경 챔버에 형질 감염되지 않은 신경 세포를 포함하는 장소의 유리 바닥 이미징 요리는 습기 ENV를 유지하기 위해5 % CO 2, 37 ° C로 ironment. 최고의 이미지 품질과 해상도를 A A 60X 계획 - 고차 색지움 장착 현미경, 1.4 NA DIC 대물 렌즈와 높은 NA 콘덴서를 사용한다.
- 투과광 조명을 사용하여 접안을 통해 신경 세포를 찾기 위해 초점면을 조정합니다.
- 이미징 소프트웨어의 다중 영역 취득 기능을 이용하여 검색 및 적어도 106 세포의 XYZ 위치를 저장한다. 무대를 위치 있도록 최상의 결과를 위해 시야 내에서이자 맞는 뉴런.
- 250 NG로 자극 / ㎖ netrin-1를 눌러 '다중 영역 획득을 시작'. 순차적으로 필요에 따라 수집 및 재 초점을 일시 중지, 24 시간 동안 각각의 위치에서 매 20 초 영상을 획득.
- 다중 차원 데이터> 열린 파일 이름을 검토> 앱을 사용하여 이미징 소프트웨어에서 이미지를 검토합니다. 안정적인 축삭 분기 (20 μm의 길이) 이미징 세션 동안 그 형태를 확인합니다. stableaxon의 branc을 측정하기 위해 선 그리기 도구를 사용하여끝으로 축삭의 기지에서 시간은 20 μm의 길이 자격이 충족되어 있는지 확인합니다.
- 막 돌기 초기 지점의 길이가 20 ㎛의 지점에 도달하면 이후뿐만 아니라 netrin 자극 후의 프레임 번호 형성 영역에서 시작할 때 스프레드 시트, netrin 자극 후에 프레임 번호를 기록한다.
- 브랜치마다의 형성 시간을 계산하기 위해 20 초만큼 돌출 형성 분기 간의 프레임 수를 곱한다.
5. 독소 노는 및 고정 세포 면역 형광
- 2 DIV에서 250 NG와 실험 조건에서 신경 세포를 치료 / ㎖-netrin 1 및 / 또는 10 nM의 보툴리눔 효과적으로 / ㎖ netrin- ng를 SNARE 매개 세포 외 유출 (13), 플러스 (250)을 억제 절단 스네어 단백질 SNAP25 및 독소 (BoNTA) 1. 제어 조건으로 처리되지 않은 뉴런의 한 세트를 남겨주세요.
주의 : 준비하고 사용하는 경우 BoNTA는 눈과 호흡기 보호의 사용을 필요로솔루션을 제공합니다. 가능한 한 빨리 생물학적 물질 및 오토 클레이브 등 모든 오염 물질을 유지한다. - 3 DIV (24 시간 후 처리) 흡인 미디어, 즉시 PHEM 수정 (자세한 내용은 표 1 참조) 중 적어도 1 ml의 교체에서 37 ° C로 예열. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어.
- (4 ° C에서 파라 필름 및 저장과 향후 사용 인감을위한) PBS로 3 배를 씻어.
- 장소 어두운, 가습 염색 실 커버 슬립과 (10 % 트리톤-100 재고에서 만든) PBS에서 갓 희석 0.2 % 트리톤-100에서 10 분 동안 세포막을 Permeabilize 하시려면.
- permeabilization 솔루션을 제거하고 PBS와 1X의 50 μl를 씻어. 30 분 동안 블록 ~ PBS (BSA-PBS)에 10 % 소 혈청 알부민의 50 μl의 10 %가 RT에서 PBS에 당나귀 혈청 삶은.
- 다시 1X PBS로 씻어. 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 : (신경 세포의 신원을 확인하기 위해 1000 βIII의 tubulin의 1) 차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 어두운 데에서.
- PBS로 3 배 5 분 세척을 수행합니다. 튜 불린 (1 : 400)에 대한 스펙트럼-별개의 이차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 형광 팔로이 딘 (여기에 따라 다릅니다 : 100 일에서 488 팔로이 딘 : 400, 647 팔로이 딘 1에서) 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 .
- 1X PBS로 3 배 5 분 세척하고 설치 미디어의 슬라이드 위에 커버 슬립을 탑재합니다.
- 명확한 매니큐어로 커버 슬립과 씰의 가장자리에서 진공 초과 장착 매체.
- 40 배 1.4NA의 목적, epifluorescent 기능과 EM-CCD와 거꾸로 현미경에 위드 표면 형광 이미지를 수집합니다.
- 수동 ImageJ에를 사용하여 분기 분석 할 수 있습니다. 창에 파일을 드래그하거나> 열기> 파일 이름 (그림 4A 인세 1에게) 파일로 이동하여 ImageJ에있는 이미지 열기 스택.
- 라인> 분할 줄을 사용하여, 소마 (- 3도 4a 인세 2)에서 연장이 가장 긴 신경 돌기로 정의 축삭을 추적.
- 분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하여 관심 영역으로 추적 축삭을 저장합니다. 추적 및 길이에 신경 돌기 ≥20 μm의 정의 각 축삭 지점을 저장합니다. 분석 (- 4도 4a의 삽입 3)에서 (직접 축삭에서 돋의 outgrowths) 만 주요 지점을 포함합니다.
- 를 눌러 'm'은 관심의 저장 영역을 측정하고 μm의 길이를 계산하기 위해 스프레드 시트로 픽셀 단위로 길이를 전송합니다.
- 100 μm의 길이 엑손 당 분기 수를 얻기 위하여 100 μm의 분할에서 엑손의 길이만큼 길이가 ≥20 ㎛의 축삭 분기 수를 나눈다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
시험관 내 생화학 적 기법을 활용하는 것은. 뉴런의 인구 SDS 방지 SNARE 복합체의 양을 분석 그림 1 SNAP-25, syntaxin1A 및 VAMP2에 대한 프로브 SDS 방지 SNARE 복잡한 분석의 결과 웨스턴 블롯 다음 완료를 보여줍니다.
기저 세포막에서 TIRF 현미경 단셀의 개체 exocytic 융합 이벤트의 높은 해상도 이미지를 제공한다.도 2a-VAMP2 phluorin 매개 exocytic 이벤트를 식별하기위한 이미지 분석 방법을 보여주고있다. 소포 융합이 발생 VAMP2-phluorin은 세포막 내에서 확산되고있다.도 2b는 대뇌 피질 신경 세포에서 (초)의 시간에 걸쳐 발생하는 exocytic 이벤트의 예를 도시하고, 상기 삽입 한 번의 exocytic 이벤트를 나타낸다. 확대 된 세트는 소마, 축삭 분기 및 spati을 나타내는 축삭의 성장 콘을 표시이 분석의 알 유틸리티입니다. 원은 TIRF 현미경을 통해 볼 수있는 단일 exocytic 융합 이벤트를 나타낸다.
netrin의 timelapse에 DIC 영상은 축삭 분기는 축삭 지점 형성의 타이밍을 보여준다 자극. 3 netrin 자극 다음 실시간으로 축삭 지점의 형성을 보여줍니다. 화이트 화살촉은 분기 사이트에서 초기 돌출부를 나타낸다. 블랙 화살촉 가지 팁을 주 축삭에서 측정 적어도 20 ㎛의 완전히 형성, 안정적인 분기를 나타낸다. 축삭 분기에 Netrin 따라 증가 exocytic 융합 netrin 따라 증가에 따라 발생합니다.
SNARE 활동의 약리 저해와 결합 고정 된 세포의 면역 세포는 SNARE 매개 세포 외 유출이 대뇌 피질의 축삭은 분기위한 필수임을 보여줍니다. 그림 4a는, 분기 트레이싱이 PERFO의 단계 프로세스에 의해 단계를 설명 에 rmed ImageJ에.도 4b는 3DIV에서 대뇌 피질의 뉴런의 대표 이미지를 보여줍니다. 다음과 같은 조건은 다음과 같습니다 치료, 250 NG / ㎖ netrin 자극, 또는 BoNTA 24 시간 동안 250 NG / ㎖ netrin 처리 하였다.
체외에서 정량 지표 SNARE의 형성으로 SNARE 단지의 SDS 저항을 사용하여 그림 1. SNARE 복잡한 회원 VAMP2, Syntaxin1A과 SNAP-25 및 로딩 제어 BIII의 튜 불린에 대한 프로브 대표 웨스턴 블롯. 모두 복잡하고 식별 단량체의 단백질이 표시됩니다 올무. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PG "/>
그림 2. 라이브 셀 이미징 및 exocytic 소포 융합 이미지 분석의 단계 개요에 의해 두피 뉴런의 Exocytic 소포 퓨전 이벤트의 정량화. (A) 단계 수동 ImageJ에를 사용하여 수행되었다있다. 이 시간이 지남에 따라 발생하는 바와 같이 (B) 삽입 된 패널은 하나의 VAMP2-pHlourin 소포 융합의 이벤트를 나타낸다. 2DIV에 VAMP2 - pHlourin을 표현하는 전체 대뇌 피질의 신경 세포의 TIRF 현미경 이미지를 갖춘 두 번째 패널. 소마, 축삭 분기 및 축삭의 성장 원추 : 아래 그림과 같이 점선 박스는 관심의 영역을 나타낸다. 관심 지역과 원은 하나의 소포의 융합 이벤트를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 장기 라이브 셀 DIC 이미징 netrin 자극에 응답 축삭 분지의 형성을 도시하는 피질 뉴런 Netrin 1 분기 종속 축삭. DIC 생균 화상의 타이밍을 보여준다. 화이트 화살촉은 이전의 길이는 20 μm의에 도달하는 신경 돌기에 초기 돌출 점을 나타낸다. 블랙 화살촉은 진실한 가지 (길이 ≥20 μm의)를 나타낸다. 시간 시간으로 표시 :. 분 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포 외 유출의 독소 억제와 결합 그림 4. 고정 세포 면역 형광은 세포 외 유출을 위해 필요하다는 것을 알 수 Netrin-1 의존 축삭 분기. (A)는 netrin에서 분기 축삭의 정량화에 대한 추적 및 분석 단계의 개요가 3DIV에서 대뇌 피질의 신경 세포를 자극. (B) 각 실험 조건의 3DIV에서 대뇌 피질의 뉴런의 대표 이미지 : 치료, 250 NG / ML의 netrin, 또는 10 nM의 BoNTA 독소 플러스 250 NG / ㎖ netrin 치료를 자극. 녹색은 F-액틴 (팔로이 딘은), 빨간색 βIIItubulin입니다. 화살표가 축삭 가지의 길이 ≥20 μm의 포인트를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 해결책 | 조리법 |
| 균질화 버퍼 | 10 mM의 HEPES-NaOH로 pH를 7.4,150 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 EGTA. 세포의 종류에 따라 달라 플러스 필요한 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제 |
| 배 샘플 버퍼 | 60 mM 트리스 - HCl을 pH가 6.75, 5 % (V / V) FI 머 캅토 에탄올, 2 % (w / v)의 SDS, 10 % (w / v)의 글리세롤, 0.007 % (w /v)의 브로 모 페놀 블루 |
| PHEM 정착액 | 60 mM의 파이프 pH가 7.0 25mm의 HEPES pH를 7.0, 10 mM이의 EGTA의 pH 8.0, 2 mM의의 MgCl 2, 0.12 M 자당, 4 % PFA |
| 설치 미디어 | 20 mM 트리스 pH를 8.0, 0.5 % n- 프로필 갈 레이트, 90 % 고품질 글리세롤, MilliQ를 H 2 O |
| 버퍼를 실행 10X SDS | 트리스베이스의 30.0 g, 글리신 144.0 g, 및 H 2 O의 1,000 ml의 pH가 8.3 SDS의 10.0 g을 녹여. 1 배 희석. |
| 10X 전송 버퍼 | 250 mM의 30.3 g의 트리스 1 LH 2 O에서 1.92 M 솔루션 144.1 g의 글리신을 용해; (1 L에 대한 1X 버퍼 200 ML의 메탄올 700 ml의 차가운 DI의 H 2 O를 100ml의 10 배 솔루션을 추가) |
| 혈청 무료 미디어 (SFM) | 50 ㎖ : 0.5 ml의 L 글루타민, 1 ML의 B27, 48.5 ml의로 Neurobasal 미디어 |
| 트립신 담금질 미디어 (TQM) | 50 ㎖ : 0.5 ml의 L 글루타민, 2.5 ML의 FBS, 47 ml의 NeurobASAL 미디어 |
| TRIS 완충 식염수 | 50 mM 트리스 - CL, 산도 7.5, 1 LH 2 O 150 mM의 NaCl을; (TBS-T의 경우 1 ㎖의 트윈 20을 추가) |
표 1. 솔루션
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
RO1 - GM108970 (SLG)와 F31-NS087837 (CW) :이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
