Protocol
Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento están sujetos a las reglas y regulaciones del Comité de Cuidado de Animales UNC y con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Preparación y revestimiento del disociada de las neuronas corticales
- La eutanasia a las mujeres embarazadas oportunas por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical. Retire todo el cerebro de los cráneos de embriones día 15.5 (E15.5) ratones y microdissect cortezas de cada hemisferio. Para obtener instrucciones detalladas relativas a la microdisección de la corteza de embriones de ratón consulte Viesselmann et al 8.
- Colocar no más de 4 cortezas en 1 ml de medio de disección estéril en un microtubo de 1,6 ml. Añadir 120 l de 10x tripsina y se invierte el tubo de 3 - 5 veces para mezclar.
- El uso de un hemocitómetro, contar las células para sembrar placas de cultivo celular. Nota: 1 hemisferio cortical proporciona aproximately tres millones de células.
- Para el ensayo de la bioquímica complejo SNARE SDS-resistente, placa de seis millones de células por placa de 35 mm y utilizar dos platos por condición. Nota: Esto se simplifica mediante el uso de placas de 6 pocillos al comparar varias condiciones.
- Para los ensayos de ramificación, las neuronas de placas en ácido nítrico lavaron los cubreobjetos circulares a una densidad de 250.000 células por placa de 35 mm, por DIC imágenes de axón de ramificación placa a una densidad de 150.000. Estas densidades de evitar el hacinamiento y simplificar el análisis.
- Para la microscopía TIRF vivo de células, volver a suspender dos millones de neuronas por transfección en nucleofection solución a temperatura ambiente.
- Añadir 100 l de suspensión celular a microtubo que contiene 10 g de VAMP2-pHlourin plásmido de expresión y electroporación con un nucleofector acuerdo con el protocolo del fabricante 9.
- Después de transfecciones añadir inmediatamente 500 l de tripsina temple medios, anular la suspensión de células cubetas y placas en una cuevasidad de 400.000 células por 35 mm de vidrio recubierta con PDL plato inferior.
- Plate todas las neuronas corticales en 2 ml de medio libre de suero.
2. SNARE Ensayo de Formación de complejos
Nota: los complejos SNARE SDS-resistentes fueron procesados y analizados como se describe originalmente 10 con las modificaciones que se detallan a continuación. Para los anticuerpos validados alternativos a los que se usan aquí, consulte la sección de materiales.
- Estimular las neuronas corticales E15.5 2 días in vitro (DIV) con 250 netrina-1 o simulada de control ng / ml durante 1 hora antes de la lisis.
- Antes de procesamiento de muestras, centrífuga fría a 4 ° C, y ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C, y el bloque de calor a 100 ° C.
- Sacar los recipientes de células de la incubadora y colocar en hielo.
- Aspirar los medios de comunicación a partir de células, reemplazan solución salina tamponada con ~ 2 ml de hielo frío de fosfato (PBS) suavemente 2 veces para 1 - 2 min por lavado.
- Para este ensayo, utilizar 2 pocillos por condition.
- Aspirar PBS desde el primer pocillo de una condición y reemplazar con 250 l tampón de homogeneización. Deja en hielo durante 5 min, y a continuación, utilizando un elevador de células, homogeneizar las células en hielo.
- Aspirar el PBS del siguiente pozo de la misma condición y añadir la mezcla homogeneizada recientemente al pozo. Esto aumentará las concentraciones de proteína. Repita este procedimiento para todas las condiciones.
- Al finalizar, la pipeta solución a un pre-enfriado 1,6 ml microtubo homogeneizó en hielo y añadir 20% Triton X-100 para llegar a una concentración final de 1% Triton X-100. Se tritura la mezcla 10 veces con una pipeta 1.000 l minimizando al mismo tiempo las burbujas.
- Incubar los tubos en hielo durante 2 min para solubilizar proteínas. Después de la incubación, se centrifuga durante 10 min a 6010 RCF a 4 ° C para sedimentar el material no solubilizado. Mueva sobrenadante lisado en un nuevo tubo de 1,6 ml enfriado en hielo.
- Realizar un análisis de la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford 11 y diluir las muestras a una final concentración de proteína de 3-5 mg / ml con tampón de homogeneización suplementado con 1% Triton X-100 y 5x tampón de muestra suplementado con B-Mercaptethanol (BME) restante.
- Divide cada muestra experimental uniformemente en 2 tubos. Incubar una muestra a 37 ° C durante 30 min (complejos SNARE), y el otro a 100 ° C durante 30 min (monómeros SNARE). Invertir los tubos de forma intermitente para mantener las muestras en solución.
- Congelar las muestras a -20 ° C hasta el momento de separar por medio de SDS-PAGE. Antes de ejecutar muestras mediante electroforesis usando técnicas estándar, re-ebullición muestras previamente hervida durante 5 minutos a 100 ° C, pero descongelar 37 ° C las muestras a temperatura ambiente.
- duplicados serie de muestras (30 - 40 g de proteína por muestra) tanto en un 8% y un 15% en gel; el 8% proporciona la separación ideal del complejo, mientras que el 15% se utiliza para cuantificar monómeros de proteínas SNARE (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, sintaxina-1 ~ 35 kDa). Mantener la fuente de alimentación a 70 V hasta que la línea de tinte es a través del STACgel de rey y aumento de tensión a 90V. Correr geles hasta que el colorante se escapa.
- Para preservar monómeros, transferir las proteínas a 0,2 micras membrana de nitrocelulosa en hielo usando tampón de transferencia en frío con 20% de metanol (MeOH) añadido, a 70 V durante 45 min.
- membrana seca en un recipiente cubierto durante 2 horas a O / N a TA (O / N proporciona los mejores resultados).
- Bloquear SNARE membranas complejos en 10% albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hora a RT.
- Preparar anticuerpos primarios (que reconocen componentes específicos complejos SNARE) a una dilución de 1: 1000 y la sonda de O / N a 4 ° C en un agitador rotatorio.
- Enjuague borrones en Tris Buffered Saline más 0,1% de Tween-20 (TBS-T) 3 veces durante 5 min cada uno.
- Preparar soluciones de anticuerpos secundarios fluorescentes a una dilución de 1: 20.000 en 1% de BSA en TBS-T y la sonda para 1 hr, cubierto a TA. Repita el paso 2.12.1 Después de 1 hora.
- Las transferencias de imagen en una máquina de escaneo fluorescente equipados con la suite de software y cuantificar tanto la co proteínas SNAREmplex (bandas inmunorreactivas por encima de 40 kDa) y bandas de monómero (bandas inmunorreactivas a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa para la SNAP-25, VAMP2 y sintaxina-1, respectivamente) utilizando las instrucciones del fabricante para la elaboración de ROI rectangular.
3. Imaging exocytic eventos mediante microscopía TIRF
Nota: Este protocolo requiere un equipo de microscopía especializado incluyendo una cámara ambiental para mantener la temperatura, la humedad y CO 2, un microscopio TIRF invertido equipado con una iluminación epifluorescente, una gran ampliación / alta apertura numérica (NA) objetivo TIRF, una etapa XYZ automatizado, y un detector sensible dispositivo de carga acoplada (CCD). Este protocolo utiliza un microscopio invertido totalmente automatizado equipado con un objetivo de un sólido de estado 491 nm láser 100x 1.49NA TIRF y un CCD multiplicador de electrones (EM-CCD). Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser. Antes del comienzo del poder protocolo de formación de imágenes en el medio amben materia de medio de cámara, el escenario, la lámpara, el ordenador y la cámara.
- Elija un objetivo en el software de imágenes. Una vez que el objetivo está en su lugar, fijar el calentador objetivo alrededor del collar.
- Confirmar que el objetivo es bajado por completo antes de asegurar la incubadora etapa en la ranura etapa. Vierta agua destilada en las entradas de la etapa de la incubadora de manera uniforme para evitar derrames.
- Encienda el sistema de incubación. Abrir la válvula al depósito de CO 2 y confirme la presión es adecuado para el sistema según las instrucciones del fabricante. Permitir cámara de un cierto tiempo para alcanzar el 5% de CO2 y 37 ° C. Antes de añadir el plato de imagen, coloque un plato vacío en la incubadora para evitar la condensación de agua en el objetivo.
- Energía de la fuente de láser.
- incubadora de carga abierta y añadir aceite de inmersión de la lente. Coloque la muestra en la incubadora y estabilizar con los brazos de estabilidad o un peso plato. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la parte inferior de la muestra. switch de iluminación de luz transmitida y encontrar plano focal neuronal a través de los oculares.
- Iniciar el software de láser y conectar con el software de control de láser. iluminación de campo amplio y seleccionar el objetivo que se usa set (100X 1.49 NA TIRF se recomienda). Cambiar el índice de refracción de la muestra (células ~ 1,38). Ajustar la intensidad del láser desmarcando "TTL" para el láser de 491 nm. Ajuste el control deslizante a 100 y luego traerlo de vuelta a un valor entre 20 - 40%. Vuelva a revisar "TTL".
- Centrarse en la muestra de nuevo en la iluminación de luz transmitida. Ir al software de imagen y seleccione iluminación láser 491 nm y obturador abierto. Fine ajustar el punto focal del láser en el techo y centrar el punto al centro del diafragma campo cerrado con el condensador eliminado. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico, de manera que no lente de cero.
- Reemplazar el condensador y vaya al software TIRF y establecer la profundidad de penetración (PD) a 110 nm. Interruptor de la iluminación de campo amplio de Illum TIRFmodo minación para formación de imágenes.
- Encuentra VAMP2-pHluorin las células que expresan a través de los oculares de campo amplio uso de epifluorescencia con fuente de luz de epifluorescencia.
- Ajustar los parámetros de imagen (tiempo de exposición, la ganancia y la potencia del láser) para maximizar la relación señal-ruido y rango dinámico utilizando el tiempo de exposición mínima y la intensidad del láser para reducir photobleaching y fototoxicidad (por ejemplo: una exposición de entre 50 - 100 ms, con un 15 - 30 obtener al 30% como máximo la potencia del láser).
- Ajuste de enfoque automático continuo por célula. Adquirir una imagen de conjunto con Timelapse de adquisición se produce cada 0,5 segundos durante 5 minutos. Para la condición de netrina-1 estimulada, añadir 500 netrina-1 ng / ml a placa de células en una campana de flujo laminar y devolver el plato a la incubadora durante 1 h antes de la formación de imágenes.
- Para cuantificar la frecuencia de eventos exocytic normalizados por área de la celda y el tiempo, las pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo> Abrir> Nombre de archivo (Figura0; 2A recuadro 1).
- Para eliminar las señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, cree una proyección promedio z de toda la pila usando Imagen> Pila> Z-Proyecto> Tipo de proyección: Intensidad Media. Restar esta imagen media de cada imagen en el timelapse usando procesos> Calculadora de imágenes> Imagen1: Operación su pila: restar Image2 proyección z promedio de nueva creación. Esto pone de relieve los acontecimientos exocytic (Figura 2A de la inserción 2 - 3).
- Contar los eventos de fusión exocytic por ojo. Eventos exocytic se definen como la aparición de una señal de fluorescencia de difracción limitada, que se difunde rápidamente como VAMP2-pHluorin se difunde dentro de la membrana plasmática (Figura 2A recuadro 6).
- Utilice el comando Umbral para resaltar la primera imagen usando Imagen> Ajustar> Umbral> ajustar el control deslizante hasta que toda la célula es resaltada umbral (Figura 2A Recuadro 7 - 8).
- bajo Analizar, seleccionar y comprobar SetMeasurements área y etiqueta de visualización. Seleccione el área celular de umbral utilizando la herramienta varita rastreo y presione 'm' para medir (Figura 2A Recuadro 7 - 8).
- Mezclar las dos cuentan los eventos de fusión exocytic, las mediciones de área celular, y el tiempo transcurrido de imágenes a una hoja de cálculo para calcular el número de eventos exocytic / mm2 / hora (Figura 2A recuadro 9).
4. contraste de interferencia diferencial (DIC) Timelapse Microscopía de Axon ramificación
Nota: Un protocolo completo y demostración de un enfoque general de formación de imágenes DIC está disponible 12. Mientras que este protocolo utiliza DIC, otros métodos de microscopía de luz transmitida pueden utilizarse para los mismos fines (por ejemplo: de contraste de fase).
- A las 2 DIV, el plato de cristal lugar de imágenes de fondo que contiene las neuronas transfectadas en cámara ambiental pre-calentado para mantener un env húmedoironment con 5% de CO2 y 37 ° C. Utilizar un microscopio equipado con un Plan de 60X-Apocromático, 1.4 lente objetivo NA DIC y alta del condensador NA para la mejor calidad de imagen y resolución.
- Ajustar el plano focal para encontrar las neuronas a través de los oculares utilizando iluminación de luz transmitida.
- Uso de la función multi adquisición zona en software de imágenes, encontrar y salvar a los lugares XYZ de al menos 6 células. Coloque el escenario para que las neuronas de interés quepan dentro del campo de visión para obtener los mejores resultados.
- Estimular con 250 ng / ml netrina-1 y pulse 'iniciar la adquisición de múltiples área'. adquirir imágenes secuencialmente en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas, haciendo una pausa adquisición y reorientación como sea necesario.
- Revisar las imágenes en el software de imágenes utilizando Aplicaciones> revisión de datos> nombre de archivo abierto Multi Dimensional. Identificar las ramas del axón estables (20 m de largo) que se forman durante la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de línea de drenaje para medir una branc stableaxonh desde la base en el axón hasta la punta para asegurar que se cumpla la longitud de calificación de 20 micras.
- En una hoja de cálculo, registre el número de trama después de la estimulación netrina cuando protuberancias de la membrana inician en zonas en las ramas más tarde forman, así como el número de trama después de la estimulación netrina cuando nacientes ramas alcanzan los 20 m de longitud.
- Multiplicar el número de fotogramas entre la protrusión y la formación de la rama por 20 segundos para calcular el tiempo de formación por cada rama.
5. Las manipulaciones toxina y Inmunofluorescencia teléfono fijo
- A las 2 DIV, el tratamiento de las neuronas en condiciones experimentales con 250 ng / ml netrina-1 y / o 10 nM de toxina botulínica A (TBA), que escinde la proteína SNARE SNAP25 y efectivamente inhibe la exocitosis mediada por SNARE 13, más 250 ng / ml netrin- 1. Deja un conjunto de neuronas no tratadas como condición de control.
PRECAUCIÓN: BoNTA requiere el uso de protección ocular y respiratoria cuando la preparación y usosoluciones. Mantener todos los materiales contaminados como material de riesgo biológico y autoclave tan pronto como sea posible. - A las 3 DIV (tratamiento post 24 h) medios de aspirado, y vuelva a colocar inmediatamente con al menos 1 ml de solución PHEM (véase la Tabla 1 para más detalles) se calienta a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Enjuagar 3 veces con PBS (para una futura utilización del sello con parafilm y se almacena a 4 ° C).
- Coloque los cubreobjetos en la cámara de tinción oscura, humidificado y permeabilizar las membranas de las células durante 10 min en recién diluido 0,2% Triton X-100 en PBS (hecho de 10% Triton X-100 de valores).
- Retire la solución de permeabilización y enjuague con 50 l de 1x con PBS. Bloquear durante 30 min en ~ 50 l de 10% de albúmina sérica bovina en PBS (BSA-PBS) o 10% hervidos burro suero en PBS a RT.
- Enjuague con 1x PBS de nuevo. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo primario (1: 1000 βIII tubulina, para confirmar la identidad neuronal) en 1% BSA-PBS durante 1 hora a RT, en la oscuridad.
- Realizar 3 x 5 min lavados en PBS. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo secundario espectralmente distinta de la tubulina (1: 400), y faloidina fluorescente (varía por excitación: 488 faloidina a 1: 400, 647 faloidina en 1: 100) en 1% BSA-PBS durante 1 hr .
- Lavar 3x 5 min en 1 x PBS y montar los cubreobjetos sobre portaobjetos en medio de montaje.
- el exceso de vacío del material de montaje de los bordes del cubreobjetos y el sello con esmalte de uñas transparente.
- Recoger las imágenes de campo amplio de epifluorescencia en un microscopio invertido con un objetivo de 40X 1.4NA, las capacidades de epifluorescencia y EM-CCD.
- analizar manualmente ramificación usando ImageJ. Pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo> Abrir> Nombre de archivo (Figura 4A recuadro 1).
- El uso de la línea> línea segmentada, trace el axón, que se define como la neurita más larga que se extiende desde el soma (Figura 4A recuadro 2 - 3).
- Utilizando Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión, guardar el axón de rastreo como una región de interés. Rastrear y guardar cada rama axón, que se define como una de las neuritas ≥20 micras de longitud. Incluir ramas solamente primarios (excrecencias que brotan directamente desde el axón) en el análisis (Figura 4A inserción 3-4).
- Pulse 'm' para medir las regiones guardados de interés, y la transferencia de longitudes en píxeles a una hoja de cálculo para calcular la longitud en cm.
- Se divide el número de ramificaciones del axón ≥20 micras de longitud, por la longitud del axón en micras dividido por 100 para obtener el número de ramificaciones del axón por 100 m de longitud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando técnicas bioquímicas in vitro para ensayar la cantidad de complejos SNARE SDS-resistentes en una población de neuronas. La figura 1 muestra la transferencia de Western resultante después de la terminación de la SNARE complejo de ensayo SDS-resistente probaron para SNAP-25, y Sintaxina1A VAMP2.
Microscopía TIRF en la membrana celular basal proporciona imágenes de alta resolución de los eventos de fusión exocytic individuales en células individuales. La figura 2A muestra la metodología de análisis de imágenes para la identificación de VAMP2-pHluorin eventos exocytic mediadas. El recuadro muestra un solo evento exocytic como se produce la fusión de vesículas y como VAMP2-pHluorin se difunde dentro de la membrana de plasma. La Figura 2B muestra un ejemplo de un evento que ocurre exocytic con el tiempo (segundos) en una neurona cortical. inserciones Zoomed denotan el soma, una rama de axón y un cono de crecimiento axonal que muestra los Spätial utilidad de este ensayo. Círculos denotan eventos de fusión exocítica individuales, que se pueden ver a través de microscopía TIRF.
Timelapse DIC imágenes de netrina estimulada axón ramificación revela el momento de la formación de ramificación de los axones. La Figura 3 representa la formación de una rama de axón en tiempo real después de la estimulación netrina. puntas de flechas blancas indican el saliente inicial de un sitio de sucursal. puntas de flecha negras denotan una, rama estable totalmente formado de al menos 20μm midiendo desde el axón principal a la punta de la rama. aumentos dependientes netrina en axón bifurcación se realiza tras los aumentos dependientes netrina en fusión exocytic.
Inmunocitoquímica de células fija combinada con la inhibición farmacológica de la actividad SNARE muestra que SNARE mediada por exocitosis es un requisito para el axón cortical ramificación. Figura 4A, se esboza un proceso paso a paso de los trazados rama perfo rmó en ImageJ. La figura 4B muestra imágenes representativas de las neuronas corticales en 3div. Las condiciones son como sigue: sin tratar, se estimularon con 250 netrina ng / ml, o tratados con BoNTA y 250 netrina ml / ng por 24 hr.
Figura 1. Uso de la resistencia de SDS SNARE complejos como una formación cuantificable métricas de SNARE in vitro. Un representante de western blot probaron para miembros del complejo SNARE VAMP2, Sintaxina1A y SNAP-25 y la tubulina BIII control de carga. Tanto SNARE proteínas en monómeros complejas e identificables se muestran. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
pg "/>
Figura 2. Imágenes de células vivas y cuantificación de exocytic Vesícula Fusion Eventos en neuronas corticales. (A) Paso a paso contorno del análisis de imágenes fusión de vesículas exocytic ya que se realizó manualmente usando ImageJ. Los paneles (B) de la inserción muestran un evento de la fusión de vesículas sola VAMP2-pHlourin ya que se produce con el tiempo. El segundo panel que ofrece una imagen de microscopía TIRF de toda una neurona cortical expresar VAMP2-pHlourin en 2div. cajas de línea punteadas indican las regiones de interés, como se muestra a continuación: soma, axón rama, y un cono de crecimiento axonal. Círculos con las regiones de interés denotan eventos de fusión de vesículas individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Largo Plazo DI de células vivasC Las imágenes revelan Momento de netrina-1 dependientes imágenes de células vivas Axon ramificación. DIC de una neurona cortical que muestra la formación de ramificaciones de los axones en respuesta a la estimulación netrina. puntas de flechas blancas indican puntos de protrusión inicial antes de la neurita llegar a 20 micras de longitud. puntas de flecha negras denotan ramas de buena fe (longitud ≥20 micras). Tiempo denotado como horas: Min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La inmunofluorescencia celular Figura 4. fijo Junto con la inhibición de la exocitosis toxina Muestra que la exocitosis se requiere para Netrina-1 dependiente de ramificación del axón. (A) Esquema de los pasos de rastreo y análisis para la cuantificación de los axones se ramifican en una netrina estimula la neurona cortical en 3div. (B) Imágenes representativas de neuronas corticales en 3div de cada condición experimental: sin tratar, se estimularon con 250 ng / ml de netrina, o tratadas con 10 nM BoNTA toxina plus 250 netrina ng / ml. El verde es la F-actina (faloidina), el rojo es βIIItubulin. Las flechas indican los puntos de las ramas de los axones ≥20 micras de longitud. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Receta |
| tampón de homogeneización | 10 mM HEPES-NaOH pH NaCl 7.4,150 mM, EGTA 1 mM. Además de inhibidores de la proteasa y de fosfatasa necesarias dependen del tipo de célula |
| tampón de muestra 2x | 60 mM pH 6,75, 5% (v / v) fI-mercaptoetanol, 2% de Tris-HCl (w / v) SDS, 10% (w / v) de glicerol, 0,007% (w /v) de azul de bromofenol |
| fijador PHEM | TUBOS 60 mM pH 7,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM de pH 8,0, 2 mM MgCl 2, 0,12 M de sacarosa EGTA, 4% de PFA |
| medios de montaje | 20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% de N-propil-galato, 90% de glicerol de alta calidad, MilliQ H 2 O |
| 10X SDS Running Buffer | Disolver 30,0 g de base Tris, 144,0 g de glicina y 10,0 g de SDS en 1.000 ml de H2O, pH 8,3. Diluir a 1X. |
| 10X tampón de transferencia | Disolver 30,3 g de Tris de 250 mM y 144,1 g Glicina para solución 1,92 M en 1 LH 2 O; (para 1 L de tampón 1x, añadir la solución de 100 ml de 10x a 200 ml de MeOH y 700 ml DI fría H 2 O) |
| Medio libre de suero (SFM) | 50 ml: 0,5 ml de L-glutamina, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal medios |
| Tripsina MEDIOS DE ENFRIAMIENTO (GCT) | 50 ml: 0,5 ml de L-glutamina, 2,5 ml de FBS, 47 ml Neurobasal medios |
| Solución salina tamponada con TRIS | 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM en 1 LH 2 O; (Para TBS-T se añade 1 ml de Tween-20) |
Tabla 1. Soluciones
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud: SR1-GM108970 (SLG) y F31-NS087837 (CW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).
