Abstract
Этот протокол описывает конкретные методы, применяемые для характеристики восстанавливающего конца (RE) и последовательность гликозильную внутреннюю область (и) heteroxylans. Де-крахмальные стены эндосперме пшеницы клеток выделяли в виде спиртовой нерастворимого остатка (AIR) 1 и последовательно экстрагировали водой (W-SOL Fr) и 1 М КОН , содержащем 1% NaBH 4 (KOH-SOL Fr) , как описано Ратнаяке ЕТ и др. (2014) 2. Два разных подхода (см резюме на рисунке 1) принимаются. В первом случае, интактные W-SOL AXS обрабатывают 2ab помечать исходную RE основной цепи остаток сахара, а затем обрабатывают эндоксиланазой, чтобы сформировать смесь 2ab меченных RE и внутренней области восстановительной олигосахариды, соответственно. Во втором подходе, KOH-золь ПТ гидролизуется с эндоксиланазой сначала подготовить смесь олигосахаридов, которые впоследствии меченных 2ab. В ферментативно выпустили ((ООН) отмеченном) олигосахариды с обеихW- и KOH-SOL Frs затем метилированной и детальный структурный анализ как нативных , так и метилированных олигосахаридов производится с использованием комбинации MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-МС и ESI-MS п. Эндоксиланазой переваривается KOH-золь AXS также характеризуются ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которая также предоставляет информацию о конфигурации аномерного. Эти методы могут быть применены к другим классам полисахаридов с использованием соответствующих эндо-гидролазы.
Introduction
Heteroxylans представляют собой семейство полисахаридов , которые являются преобладающими нецеллюлозные полисахариды первичных стенок трав и вторичных стенок всех покрытосеменные 3-6. Ксилана магистральные сети различаются по типам и моделей замещения с гликозил (глюкуроновой кислоты (GlcA), арабинозы (Араф)) и не гликозил (O-ацетил, феруловая кислота) остатки в зависимости от типа ткани, стадии развития и видов 7.
Стены из пшеницы (Triticum AESTIVUM L.) , эндосперма состоят в основном из арабиноксиланов (AXS) (70%) и (1 → 3) (1 → 4) -β-D-глюкан (20%) с небольшими количествами целлюлозы и heteromannans (2% каждый) 8. Ксилана цепь может быть различным образом ун-замещенные и преимущественно монозамещенным (в основном O-2 положении и в меньшей степени, O-3-положении) и ди-замещенные (O-2 и O-3 позиции), с & alpha; -L-Ara F остатки 9. Восстанавливающий конец (RE) гетеросвязейксиланы из двудольных (например, Резуховидка Таля) 10 и голосеменных (например, ель (Picea пихта)) 11 содержит характерную последовательность тетрасахарид гликозильную; -β-D-Xyl р - (1 → 3) -α-L-Rha р - (1 → 2) -α-D-Gal р А- (1 → 4) -D-Xyl р. Чтобы понять heteroxylan биосинтез и функции (биологической и промышленных), важно, чтобы полностью секвенировать ксилана позвоночник, чтобы понять типы и образцы замен, а также последовательность восстанавливающего конца (RE).
Конкретные методы, используемые для структурной характеристики восстанавливающего конца (RE) и последовательность гликозильную внутреннюю область (и) heteroxylans описаны в этой рукописи. Методы полагаются на флуорофора мечения (с 2 аминобензамидом (2ab)) восстанавливающий конец (RE) в heteroxylan цепи предшествующего уровня ферментативной (эндоксиланазой) гидролиза. Такой подход, в частности, для РЗ последовательности, быловпервые сообщили в лаборатории - Йорк 10,12-13 , но теперь расширена , чтобы включить внутреннюю область секвенирование и представляет собой сочетание установленных методов , которые в равной степени адаптированы ко всем heteroxylans независимо от их источника изоляции. Этот подход может быть также применен к другим классам полисахаридами, используя (если таковые имеются) соответствующие эндо-гидролазы.
В настоящем исследовании, де-накрахмален стены эндосперме пшеницы клеток выделяли в виде спиртовой нерастворимого остатка (воздух) и последовательно экстрагируют водой (W-золь Fr) и 1 М КОН , содержащем 1% NaBH 4 (КОН-SOL Fr) , как описано в Ратнаяке и др. (2014) 2. Освобожденные олигосахариды с обеих W- и KOH-SOL Frs затем метилированной и детальный структурный анализ как нативных, так и метилированных олигосахаридов производится с использованием комбинации MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-МС-в сочетании с ВЭЖХ с онлайн хроматографическое разделение с использованием с-18 колонке RPи ESI-МС п. Эндоксиланазой переваривается КОН-золь AXS характеризовался также ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Этикетировочное восстанавливающего конца (RE) сахарный остаток W-золь AXS с 2-аминобензамидом (2AB)
- Выдержите W-золь AXS с 2ab (0,2 М) в присутствии 1 М NaBH 3 CN (цианоборгидрид натрия) (рН 5,5) в течение 2 ч при 65 ° С , чтобы преобразовать восстанавливающих концы полисахарид основной цепи с их производными флуоресцентными.
ВНИМАНИЕ: Следующий шаг должен выполняться в вытяжном шкафу , как NaBH 3 CN выпускает ядовитый цианистый газ , когда он находится в контакте с водой.- Взвесить NaBH 3 CN (62,8 мг) и растворяют в воде (1 мл) в микроцентрифужных трубки (1,5 мл) с получением 1 М раствора NaBH 3 CN. Растворите 2AB реагента (27,2 мг) в 1 М растворе NaBH 3 CN (1 мл) при нагревании при 65 ° С и довести рН реакционной смеси (0,2 М 2ab, 1 М NaBH 3 CN) до рН 5,5 с помощью 10% -ной уксусной кислоты.
- Добавить 200 мкл реакционной смеси (0,2 М 2ab, 1 М NaBH 3 CN) в W-такл AXS (1 мг) в стеклянной трубке с крышкой и перемешать с помощью вихревой мешалки. Инкубировать в течение 2 часов при температуре 65 ° C в вытяжном шкафу. Охлаждают суспензию до комнатной температуры и добавить 4 тт. абсолютного этанола.
- Поместите суспензию в холодном хранении (4 ° C) O / N для осаждения полисахаридов.
- Центрифуга (1500 XG, 10 мин, RT) для удаления надосадочной жидкости. Промывают осадок экстенсивно с абсолютным этанолом (4 ×), ацетон (1x) и метанола (1x), центрифугирование между каждой промывке. Вакуумная сушка при 40 ° CO / N.
Примечание: Обширные мойка также удаляет остатки 2ab.
2. Генерация Xylo-олигосахаридов от 2 AB Меченые W-золь AXS
- Растворите 2AB меченый W-золь AXS (1 мг) в 500 мкл буферного раствора ацетата натрия (100 мМ, рН 5) в микроцентрифужных трубки (1,5 мл). Добавить 4 единицы эндоксиланазой (GH 11, [M1]) и инкубировать при температуре 37 ° C в течение 16 часов.
- Уничтожить активность фермента путем нагревания микст реакцииЮр в течение 10 мин в кипящей водяной бане. Охлаждают суспензию до комнатной температуры и передать в стеклянную трубку с крышкой. Добавьте 4 тт. абсолютного этанола и помещают суспензию, в холодном хранении (4 ° C) O / N для осаждения любых непереваренные полисахаридами.
- Центрифуга (1500 XG, 10 мин, RT), чтобы отделить непереваренные полисахариды (пеллет) и эндоксиланазой генерироваться Xylo-олигосахариды (супернатант). Декантируют надосадочную жидкость в чистую стеклянную трубку и поместить его в теплую ванну водой (40 ° C).
- Выпаривают этанол в токе газообразного азота, к объему конечной точке (~ 500 мкл). Замораживание супернатант при -80 ° С в течение 4 ч и сухой замороженный супернатант в сублимационной сушилке для восстановления ксило-олигосахариды.
3. Генерация Xylo-олигосахаридов из KOH-SOL AXS и 2ab маркировки
- Treat KOH-SOL AXS с эндоксиланазой (GH 11, [M1]) для генерации ксило-олигосахаридов, как описано выше (разделы 2.1-2.4).
- Лечить endoxylanase генерируется ксило-олигосахариды с KOH-SOL AXS с реакционной смесью 2AB (0,2 М 2ab, 1 М NaBH 3 CN) , как описано выше (разделы 1.1.1-1.1.2).
- Декантируют надосадочную жидкость в чистую стеклянную трубку и поместить его в теплую ванну водой (40 ° C). Выпаривают этанол в токе газообразного азота, к объему конечной точке (~ 500 мкл). Замораживание супернатант при -80 ° С в течение 4 ч и сухой замороженный супернатант в сублимационной сушилке для восстановления ксило-олигосахариды.
4. MALDI-TOF-MS
- Получение MALDI-матричного решения
- Добавьте небольшое шариком 2, 5-dihydroxbenzoic кислоты (DHB) до 50% ацетонитрила (500 мл), содержащей 0,1% муравьиной кислоты в трубе (MALDI-матрица раствора). Смешайте с помощью вихря, если он быстро растворяется, добавьте еще один маленький совок DHB. Примечание: Идеальная концентрация MALDI-матричного раствора составляет 10 мкг / мкл -1.
- Получение MALDI-целевой плиты
- Депозит aqueoмы олигосахарид (родной) образцы (5-10 мкг) (W-золь и / или KOH-золь) на в MALDI-целевой пластины. Добавить 0,3 мкл раствора MALDI-матрицы с использованием отдельного наконечника и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Дайте смеси высохнуть при комнатной температуре.
Примечание: Правильно высушенные образцы должны состоять из длинных игольчатых кристаллов, указывающими по направлению к центру пятна. Если депозит является липким и / или вязкий образец может быть либо слишком сгущенные или состоят из солей, такие месторождения вряд ли будут производить хорошие спектры и образец должен быть очищен далее. - Введем целевую пластину в источник MS и работать в положительном (+ IVE) режиме ионов. Регулировка напряжения акселератора до 19,0 кВ на источник ионов 1 и 16,3 кВ на источнике ионов 2. Отрегулировать мощность лазера до более чем 70%. Выберите место образца на MALDI-целевой пластины и нажмите кнопку Пуск, чтобы начать лазерные выстрелы.
Примечание: Все области мишени не даст сигналы. Особым местом будет только дать сигнал на несколько лазерных выстрелов из-либоИстощение образца / растворной смеси или характеристик кристалла.- Переместите лазер в различных областях цели при приобретении и в среднем около 200 случайных спектров для получения удовлетворительного соотношения сигнал-шум.
- Депозит aqueoмы олигосахарид (родной) образцы (5-10 мкг) (W-золь и / или KOH-золь) на в MALDI-целевой пластины. Добавить 0,3 мкл раствора MALDI-матрицы с использованием отдельного наконечника и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Дайте смеси высохнуть при комнатной температуре.
5. ESI-MS-QTOF
- Анализ эндоксиланазой генерируемых олигосахариды (родной) с использованием нано-ВЭЖХ в сочетании с ионизацией электрораспылением (ESI) квадрупольный время пролета (QTOF) MS инструмент с онлайн хроматографического использованием RP колонка С-18 (75 мкм х 150 мм; 3,5 мкм шарик размер).
- Передача эндоксиланазой сгенерированных водные олигосахариды смесь во флакон и помещают в автосэмплера ВЭЖХ. Предварительно запрограммируйте градиент элюции 5-80% с подвижной фазы 0,1% (об / об) муравьиной кислоты в воде и 0,1% (об / об) муравьиной кислоты в ацетонитриле, соответственно, в течение 60 мин.
- Регулировка скорости потока до 0,2 мкл / мин. Настройка режима положительных ионов в диапазоне сканированияиз 300-1,600 т / г и сканирующим скоростью 0,5 сканирований / сек с использованием условий ESI источника следующим образом : Занавес газ 10, GS1 4, температура источника 100 ° С, с ионным распылением напряжение 2300 В, и де-кластеризация потенциал 50 V. Запустите программу LC хроматографического и элюции олигосахаридов. Полученная общая ионная хроматограмма (TIC) сохраняется автоматически с помощью программного обеспечения.
- Откройте сохраненный TIC и выберите хроматограмму экстракта. Введите ожидаемые массы (например, 271, 403, 535, 667, 799 и 931 м / г) в командной строке. Сканирование хроматограмму, нажав Enter. Процесс выбранных ионов сканы данных хроматограммы ESI-MS QTOF с использованием программного обеспечения в соответствии с инструкциями 14 изготовителя.
6. ESI-МС п
- Вставка 1 до 2 мкл на-O-метилированных олигосахаридов (метилированный , как описано Pettolino и др. 1) образца в 50% ацетонитрила в наконечнике микросфер с использованием шприца. Отделкакончик нано-спрей, используя стеклорез, чтобы вписаться в дискретном держатель нано-спрей, прикрепленной к MS.
- Установите массу в соответствии с ожидаемым диапазоном масс (200-1,500 м / г) и занавеской газа до 10, ionspray напряжения на 1,900 V и полярности к положительной.
- Нажмите кнопку , чтобы открыть сбора по релевантного окна, введите имя файла данных для получения общего ионного сканирования (ESI-MS 1). Затем нажмите кнопку STOP.
- Изменение типа сканирования из иона продукта фрагментировать пик интереса. Введите массу интерес (например, 885 м / г) , чтобы фрагментировать и регулировать диапазон масс (200-900 м / з). Нажмите кнопку получения и регулировки энергии столкновения (вверх и / или вниз на вкладке соединения) для достижения всей фрагментации родительского иона (885 м / г) и приобрести ионный фрагмент сканирования (ESI-MS 2).
- Ввод массы фрагмента иона интерес (например, 711 м / г) и регулировать диапазон масс (200-720 м / г). Нажмите кнопку Приобретатьd регулировать энергию удара , чтобы достичь всего фрагментации иона - предшественника (711 м / г) и приобретают ионный фрагмент сканирования (ESI-MS 3).
7. H 1 ЯМР - спектроскопия
- Растворите эндоксиланазой генерироваться смесь олигосахаридов (КОН-золь, нативной форме) (~ 500 мкг) в D 2 O (1,0 мл, 99,9%) в пластиковую пробирку (15 мл). Замораживание суспензии при -80 ° С в течение 4 ч и сухой замороженный приостановку в сублимационной сушилке для восстановления ксило-олигосахариды.
- Повторите 7.1 дважды, чтобы полностью обменять H 2 O с D 2 O.
- Растворите высушенных олигосахариды в D 2 O (0,6 мл, 99,9%) и добавьте 0,5 мкл ацетона (5% в D 2 O) в качестве внутреннего стандарта. Передача дейтерированных олигосахариды в ЯМР пробирку.
- Держите ЯМР пробирку, содержащую образец с верхней и вставьте пробирку с пробой в пластиковом блесны. Поместите вертушку в глубине образца датчика. Гнойч или тянуть пробирку, чтобы регулировать глубину образца, чтобы гарантировать, что центральная линия верхней и нижней образца глубиномеры равны.
- Извлеките глубиномер и вставить образец в автосамплера, прикрепленного к 600 МГц ЯМР-спектрометре, снабженном крио-зондом.
- Логин и открытое программное обеспечение управления спектрометром. Введите имя файла образца. Откройте существующий набор данных, а затем использовать команду "EDC", чтобы сохранить его под новым именем. Введите номер позиции образца в автоматическом пробоотборнике и нажмите "ENTER".
Примечание: при нажатии кнопки "ENTER" сбросит пробирку осторожно, чтобы отверстие магнита, где оно будет расположено в верхней части зонда. - Установите желаемую температуру образца, набрав "edte" в командной строке. Подождите, пока температура образца достигнет желаемого значения, прежде чем перейти к следующему шагу. Введите "замок" в командной строке и выбрать соответствующий растворитель (D 2 O). Подождите, & #34; блокировка готовой "сообщение появится в нижней части окна.
- Введите "atmm" в командной строке и нажмите кнопку "Оптимизировать" в верхней части строки меню atmm. Выберите Пуск для настройки и согласования датчика для выбранного канала (1 H в данном случае).
- Введите "topshim" в командной строке для процесса подкладок, в котором незначительные корректировки для магнитного поля до однородного магнитного поля не будет достигнуто вокруг sample.Acquire сигнал, набрав "ZG" в командной строке и введите.
- Анализ спектров с использованием программного обеспечения 15 в соответствии с инструкциями изготовителя с 1 H химического сдвига , отнесенная к внутреннему стандарту ацетона при 2.225 частей на миллион.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эндоксиланазой переваривание 2ab меченных W-золь AXS производит смесь 2ab меченных RE олигосахариды и ряд не-меченый (без этикетки 2ab) олигосахаридов , полученных из внутренних областей ксилана цепи (рис 1, из Ратнаяке и др. 2). Ряд хроматографических подходов затем используют для фракционирования сложную смесь изомеров. И, наконец, методы MS используются для идентификации изомерных структур, которые затем секвенировали с помощью MS н методов. Здесь мы представляем своего представителя, а не всеобъемлющего, например подхода.
Сигналы в спектре MALDI-TOF-MS олигосахаридов , полученных из 2ab меченных нативной W-золь AXS (фиг.2А) включают в себя весьма обильную псевдо-молекулярному иону серии при m / z 701, 833, и 965 , представляющий серию непомеченная нейтральный внутреннийобласть олигосахариды с 5-7 pentosyl остатками (Р 5-7), соответственно. Серия сигналов при m / z 745, 877, и 1009 г. , обозначают , что немеченого кислом серии олигосахаридов, с P 4-6 + HexA 1 (аскорбиновая кислота), также присутствует в этой фракции (фиг.2А). Псевдо-молекулярных ионов при м / з 821 и 953 указывают на наличие 2ab меченных оригинального RE олигосахариды P 5-6 + 2AB соответственно.
Анализ ESI-QTOF-MS для нативных олигосахаридов с он-лайн хроматографического фракционирования олигосахаридов с помощью RP C-18 ВЭЖХ затем выполняется. Рисунок 2B и 2C, показывает выбранные ионных сканирований, извлеченный из общего иона ESI-QTOF-MS хроматограмма (TIC), олигосахариды, выпущенных эндоксиланазой из W-SOL Fr AXS. Сигналы включают псевдо-молекулярный ион серии , назначенный в качестве [M + NH 4] + при т/ г 696, 828, 960, 1092, 1224, и 1356 , представляющий серию внутренней области нейтральных олигосахаридов с 5-10 pentosyl остатков (P 5-10) соответственно (рис 2В). Несколько изомерных структур возможны для олигосахарида определенной массы (см ниже ESI-MS н анализа). Отсюда множество пиков для каждого из сканов молекулярных ионных возможны , как отмечено на фигуре 2В. Псевдо-молекулярных ионов , назначенных в качестве [M + H] + при m / z 271, 403, 535, 667, 799 и 931 указывают на наличие 2ab маркированы RE олигосахарид серии П 1-6 + 2AB, соответственно (рис 2C) , Сигналы , обнаруженные в [М + Н] + при m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, 1273 и указывают на наличие кислых олигосахаридов с P 3-8 + HexA 1 соответственно (фиг.2с). В commelenid однодольные, ксилан позвоночник также может быть замещен фенольные кислоты,в первую очередь феруловая кислота (а также р -coumaric кислота), которая имеет ту же молекулярную массу , как и глюкуроновой кислоты и могут быть обнаружены в W-SOL AXS стенок эндосперме пшеницы клеток. Тем не менее, дальнейший анализ W- и KOH-SOL AXS с использованием ESI-MS (п и композиционной анализа методом ГХ-МС производных TMS следуя метанолизе; здесь не показано) подтверждают кислые олигосахариды с P 3-8 + 1 HexA в эндосперме пшеницы AXS.
Сигналы , назначенные как [М + Н] + ионы : ESI-Q-TOF полный спектр сканирования области между 3.10-3.48 мин (рис 2D) включает в себя серию 2ab меченый RE олигосахариды: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, и 1195 (Р 1-8 + 2AB, соответственно). Серия псевдо-молекулярных ионов в ЭРИ-Q-TOF полный спектр сканирования области между 3.59-4.05 мин (рис 2E) представляют собой внутреннюю область кислые олигосахариды наблюдатьd и как [M + Na] + ионов: m / z 613, 745, 877, 1009 и 1141 (P 3-7 + HexA 1, соответственно) и [M + NH 4] + ионов: m / z 740, 872, 1004, 1136, и 1268 (С 4-8 + HexA 1, соответственно).
Для того , чтобы показать порядок отдельных олигосахариды, мы проводили ESI-МС п на за-O-метилированных олигосахариды , а не на нативных олигосахаридов , полученных из W-SOL и KOH-SOL AXS , поскольку она является сложной задачей , чтобы однозначно присвоить структуры с помощью секвенирования нативные олигосахариды , Кроме того, он также требует большого количества материала. Метилирование олигосахаридов осуществляли, как описано Pettolino и др. 1. ESI-МС п исследования , выполненные на RE нейтрального олигосахарида полиолов , полученных из KOH-золь AXS и 2AB маркированы нейтральный RE олигосахарид получен из W-SOL AXS описаны БелуW в качестве примера для оказания помощи в интерпретации спектров и выведенными структур. Такой же подход может быть применен ко всем олигосахаридов, полученных от ферментативного гидролиза. Ионы фрагмент в ESI-MS н спектры были определены в качестве ионов Y и B в соответствии с Domon & Costello. 16 Ун-метилированных гидроксильную группу (группы) , образующихся при газофазной фрагментации на-O-метилированных олигосахаридов в MS N обеспечивает 14Da разность масс "шрам" , который может быть использован для идентификации ветвление и гликозильные последовательности. 12-13 Каждый шрам , порожденный события фрагментации помечен как сплошной линией (Рисунки 3 и 4). Поскольку несколько изомерных структур возможны для определенной массы, то в этих изомерных структур, ионы Y и B обозначены в красный и черный, соответственно.
ESI-МС 2, ESI-МС 3 и ESI-МС 4 ОФЭКТра из за O-метилированный RE нейтральной олиго-гликозильная альдита генерируется из фрагментации псевдо-молекулярных ионов т / г +885 (P 4 + Xyl ол) показан на рисунке 3. 2 - спектр ESI-MS включает в себя богатый Y ионы при m / z 711, 551, и 391 , порожденный потерей одного, двух и трех pentosyl остатков, соответственно, от родительского иона. Обильные м / з 711 ионов может быть сгенерирован либо потерей невосстановительной Xyl концевой остаток конца или потерей терминала боковой цепи Ara остатка. Диагностическая Y м / з 391 ионов в полученном спектре может быть восстановлена из потери трех невосстанавливающих концевых Xyl остатков из РЗ олигосахарида , который имеет Ara остаток боковой цепи на остатке ола RE Xyl или RE олигосахарида , который имеет боковой цепи Ara остаток на остаток 2 - й Xyl из ола остатка RE Xyl. Хотя существует формальная возможность того, что другие структуры, такие какXyl 4 -Xyl ол и (ARA) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ол бы привести к этому ионный фрагмент этих структур, исключаются из рассмотрения в качестве специфичности эндо-ксиланазы, используемой для расщепления полисахарида будет либо ухудшать или не расщепляют на гликозидной связи, прилегающей к точке ветвления, соответственно. Соответственно, диагностический Y м / з 551 ион может быть восстановлена из потери двух невосстанавливающих концевых Xyl остатков из РЗ олигосахарида , который имеет АРА остаток боковой цепи , либо на остаток ола RE Xyl или RE олигосахарида , который имеет сторону цепь Ara остаток на предпоследнем остаток Xyl. Таким образом, четыре возможных изомерных структур могут быть предложены (Рисунок 3: I, II, III и IV). Обильные Y ион м / з 377 (смотри рисунок 3: Ia и IIa) и B иона m / z 503 (см Рисунок 3: Ia, Ib, IVA и IVb) , полученные от дальнейшей фрагментации изомерных предшественника м/ г 711 ионов также наблюдаются в этом спектре. 3 - спектр : ESI-МС (рис 3) , записанные с помощью фрагментации изомерных предшественника m / z 711 ионы включены основной пик при м / з 537 (Y ион P 2 + Xyl ола с двумя рубцами, генерируется из предшественника иона Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa и IVb) , и м / з 391 (Y ион P 1 + Xyl ола с одним рубцом, генерируется из предшественника иона IIB, IIIA, IIIB, IVa и IVb). Эти два основных пика (m / z 537 и m / z 391) могут быть получены в результате потери одного и двух невосстанавливающих концевых остатков Xyl, соответственно, из изомерных предшественника м / з 711 ион генерируется из фрагментации псевдо -molecular исходный ион м / з 885 (P 4 + Xyl ол) во время ESI-MS 2. Относительно более низкие пики численности при м / з 377 (Y ион P 1 + Xyl ола с двумя рубцами, генерируется из precursoг ионов Ia и IIa) и 551 (Y ион P 2 + Xyl ола с одним рубцом, полученные от предшественника иона Ib и IIb) также наблюдались в этом спектре.
ESI-МС 4 фрагментации изомерных предшественника т / г 551 ионы включены основной пик при м / з 377 (Y ион P 1 + Xyl ола с двумя рубцами) и м / з 391 (Y ион P 1 + Xyl ола с одним рубцом) , образующихся из предшественника иона структур I и II. Поэтому коллективные данные свидетельствуют о том, что последовательность RE гликозильная состоит из боковой Ара цепи , присоединенной к ола остатка RE Xyl (диагностическая фрагментация путь м / Z 885 → 711 → 551 → 391; Рисунок 3II), Ара боковой цепи , присоединенной к обоим RE Xyl ола и предпоследний (1 - й Xyl остаток от RE Xyl ола) Xyl остаток (диагностическая фрагментация путь м / г 885 → 711 → 537 → 391; Рисунок 3III), Ара боковой цепи , присоединенной к предпоследнему (1-Xyl из RE Xyl ол) Xyl остаток (диагностическая фрагментация путь м / Z 885 → 711 → 537 → 377; Рисунок 3I) , и сторона Ара цепь прикреплена к остатку 2 - й Xyl из RE Xyl ола (рис 3IV).
Присутствие этих ионов подтверждает предложенные изомерных структур I, II, III и IV , а нейтральный олигосахарид RE структура: - [Ара F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl р - (1 → 4) - [Ара F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl р - (1 → 4) - [Ара F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl р.
ESI-MS 2 спектр за O-метилированной 2ab маркированы RE олигосахариды генерируется из Фрагментация из квазимолекулярный [M + Na] + ионов при т / г 871 (P 4 + 2AB) показан на рисунке 4. Этот спектр включает в себя наиболее обильные Y ион при м / з 697 (P + 3 2ab с одним рубец), м / з 537 (P 2 + 2AB с одного шрама) и m / z 377 (P 1 + 2ab с одним рубцом), порожденный потерей либо один, два или три невосстанавливающих остатков pentosyl соответственно. М / з 697 ионов может быть сгенерирован либо потерей невосстановительной остатка концевая Xyl или потерей остатка терминала Ara , тогда как т / г 537 ионов может быть сгенерирован только потерей двух концевых остатков Xyl , Диагностическая фрагментация путь (м / Z 871 → 697 → 537 → 377) предположил , что существование линейной не-разветвленного ксилана магистральную олигосахарида (ов) на RE , соответствующий квазимолекулярный ионным м / з 871 (Р 4 + 2AB ). Однако линейный ун-разветвленными ксилозил магистральная (P 4 + 2AB) является susceptible на сайт конкретных эндоксиланазой для дальнейшего переваривания. Поэтому два иона изомерные м / г 697 может существовать. Соответственно два возможных изомерных структур предложены (Рисунок 4: I и II). В этих изомерных структур ионов Y и B обозначены в красный и черный, соответственно. ESI-МС 3 Спектр записывается от фрагментации изомерных предшественника т / г 697 ион генерирует m / z 523 ион (Y ион P 2 + 2AB с двумя рубцами, рисунок 4, структуры Ia, Ib, IIa и IIb), м / Z 363 ион (Y ион P 1 + 2AB с двумя рубцами; Рисунок 4, структура IIа) и Y ион при m / z 377 (P 1 + 2AB с одним рубцом; Рисунок 4, структуры Ia и Ib). Ионный фрагмент при м / з 377 может возникнуть только из предложенной структуры I и фрагмент ионов при м / з 363 может возникнуть только из предложенной структуры II. Одновременное присутствие этих двух ионов подтверждает предложенные структуры I и II, Таким образом, последовательность RE гликозильная из ксилана цепи эндосперме пшеницы AXS состоят из ветви Ara прикрепленной к остатку RE Xyl (осколочной затрагивающего пути м / з 871 → 697 → 523 → 363) и / или предпоследний Xyl остаток (фрагментация путь m / z 871 → 697 → 523 → 377).
ЯМР-анализ AXS
Анализы MS на основе не предоставляют информацию о любой конфигурации аномерного (α / р) или конфигурации D / L из сахаров , которые должны быть получены другими подходами, в том числе ферментативной и физические (например, ЯМР). Для heteroxylans с характерным RE сниженной тетрасахарида (Xyl-Rha-GALA-Xyl ол), спектр ЯМР содержит аномерные сигналы , приводящие к идентификации и секвенирования этого RE олигосахариды. Описано использование 600 МГц 1D 1 H-ЯМР - спектроскопии в качестве единственного метода шага опргорностая полную последовательность гликозильную пшеницы эндосперма AX RE олигосахарида на KOH-SOL Fr, включая конфигурацию аномерного (α / р) и конфигурации D / L из сахаров. Резонансы были назначены на основании опубликованных присвоений пшеницы AX олигосахаридов 17-18 (рисунок 5, таблица 1). 1 H-ЯМР - спектр AX , извлеченной из эндосперме пшеницы преобладают аномерная химических сдвигов в 5,39, 5,27 и 5,22 промилле, которые назначены на протон в α-L-Ara ф концевой остаток, прикрепленной к O-3 позиции (Т-α-L-Ara F → 3 S) , из однократно разветвленного (1,4) -β-Xyl р магистральным остатков и как O-3 и о-2 позиции (Т-α-L-Ara F → 3 D и Т-α-L-Ara F → 2 D) , двукратно разветвленными (1,4) -β-Xyl р магистральным остатков, соответственно (рис 5 и в таблице 1).
F → 3 S + D) H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-3 однократно разветвленного р остатка β-D-Xyl с примыкающей двукратно разветвленного β-D-Xyl с. Сигнал на 5,29 назначается (T & alpha; -L-Ara F → 3 D + D) H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-3 двукратно разветвленного бета-D-Xyl р остаток с примыкающей двукратно разветвленного β-D-Xyl с. сигнал на 5,24 назначается (T & alpha; -L-Ara F → 2 D + D) H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к O-2 положение двукратно разветвленного р остатка β-D-Xyl с примыкающей двукратно разветвленного β-D-Xyl р.
<р класс = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> Рисунок 1. Резюме Экспериментальный подход Резюме стратегии , используемой в генераторной, очистки и секвенирования восстанавливающего конца (RE) и внутренние олигосахариды область. пшеницы эндосперма арабиноксиланы (AXS) показан. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Ратнаяке и др. (2014) 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. MALDI-TOF MS (А) и ESI-QTOF МС (В - Е) анализ нативных олигосахаридов , выпущенных эндоксиланазой из 2ab меченый W-SOL AXS , как показано на рисунке 1. MALDI-TOF МС - спектр: (A) ( сигнализирует вновь идентифицирована как [M + Na] + ионов аддукта); Отдельные ионные сканы ESI-MS QTOF хроматограммах: B = P 5-10 , полученной из внутренних олигосахариды области (Сигналы обозначены как [M + NH 4] + ионов аддукта), C = P 1-6 + 2ab , полученные из RE олигосахариды (сигналы обозначены как [M + H] + ионов аддукта) & P G 3-8 , получаемые из кислотных олигосахаридов (сигналы обозначены как [M + Na] + ионов аддукта), D = ESI-Q-TOF полный спектр сканирования: область между 3.10-3.48 мин, E = ESI-Q-TOF полный спектр сканирования: область между 3.59-4.05 мин (сигналы обозначены как оба [M + Na] + и [M + NH 4] + ионов аддукта ); P = pentosyl блок (либо Ара или Xyl); G = остаток uronosyl (GlcA); RE = восстанавливающий конец олигосахариды; 2AB = 2 аминобензамид; EIC: извлеченный ионная хроматограмма. Объявление / 53748 / 53748fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. ESI-МС 2, ESI-МС 3 и ESI-МС 4 - спектры на-O-метилированных RE нейтрального гликозильного альдита (Р 4 + Xyl ола) - м / з 885. Сигналы назначаются в качестве [M + Na] + псевдо-молекулярных ионов аддуктов. Поскольку несколько изомерных структур для определенной массы возможны, то в изомерных структурах ионы Y и B обозначены в красный и черный, соответственно. Каждый "шрам" генерируется событие фрагментации отмечен как сплошной линией. X = ксилозил остаток; A = Arabinosyl остаток. 3 Спектры ESI-MS была воспроизведена с разрешения Ратнаяке и др. (2014) 2.748fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. ESI-MS 2 и ESI-MS 3 спектры за O-метилированной 2ab маркированы нейтральный олигосахарид RE (P 4 + 2AB) - м / з 871. Сигналы назначаются как [M + Na] + псевдо -molecular ионных аддуктов. Поскольку несколько изомерных структур для определенной массы возможны в изомерных структурах, ионы Y и B обозначены в красный и черный соответственно. Каждый "шрам" генерируется событие фрагментации отмечен как сплошной линией. X = ксилозил остаток; A = Arabinosyl остаток. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Ратнаяке и др. (2014) 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное версион этой фигуры.
Рисунок 5. аномерная область спектра 600 МГц 1D 1 H-ЯМР AX олигосахариды , порожденного эндоксиланазой обработкой KOH- Sol Фр 1 Н химический сдвиг ссылка на внутренний стандарт ацетона при 2.225 частей на миллион. Т-α-L-Ara F → 3 S: H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-3 однократно разветвленного р остатка β-D-Xyl; Т-α-L-Ara F → 2 D: H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-2 двукратно разветвленного р остатка β-D-Xyl; Т-α-L-Ara F → 3 D: H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-3 двукратно разветвленного р остатка β-D-Xyl; T-α-L-Arg F → 3 S + D: H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-3 однократно разветвленного р остатка β-D-Xyl с прилегающим двукратно разветвленной β-D- Xyl р; Т-α-L-Ara F → 2 D +: H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-2 двукратно разветвленного р остатка β-D-Xyl с прилегающим двукратно разветвленной β-D -Xyl р; Т-α-L-Ara F → 3 D +: H1 сигнал α-L-Ara F боковой цепи , присоединенной к положению O-3 двукратно разветвленного р остатка β-D-Xyl с прилегающим двукратно разветвленной β-D -Xyl р; 2-α-L-Ara F → 3 S: H1 сигнал 2-α-L-Ara остаток е боковой цепи , прикрепленной к положению O-3 однократно разветвленного р остатком β-D-Xyl; Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры.
Сахарные остатки | Н-1 / C-1 | Н-2 / С-2 | Н-3 / С-3 | Н-4 / С-4 | Н-5 экв / С-5 | H-5 топор / C-5 |
Т-α-L-Араф → 3 S | 5,396 / 107,6 | 4.16 | 3,95 | 4.3 | 3,82 | 3,72 |
Т-α-L-Араф | 5,415 / | 4,18 | 3,95 | |||
→ 3 S + D | ||||||
Т-α-L-Араф → 2 Д | 5,223 / | 4.16 | 3,97 | 3,82 | 3,74 | |
Т-α-L-Араф → 2 D + | 5,243 / | 4.16 | 3,98 | |||
Т-α-L-Араф → 3 D | 5,272 / 108,9 | 4,18 | 3,96 | 4,26 | 3,79 | 3,74 |
Т-α-L-Араф → 3 D + | 5,298 / | 4,18 | 3,96 | |||
2-α-L-Араф → 3 S | 5,548 / 106,4 | 4,27 | 4,06 | 4.3 | 3,82 | |
a-Xylp (уменьшение) | 5,185 / 91,9 | 3,55 | 3,72 | |||
бета-Xylp (уменьшение) | 4,580 / 96,6 | 3,29 | 3,48 | 3,64 | 4,06 | 3,38 |
β-4-Xylp | 4,470 / | 3,32 | 3,58 | |||
& beta ; -4-Xylp + S | 4,461 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3,36 |
β-4-Xylp + D , | 4,448 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3,36 |
бета-3,4-Xylp | 4,518 / | 3,44 | 3,85 | |||
S + β-3,4-Xylp | 4,514 / | 3,47 | 3,75 | 3,86 | 4,14 | 3,43 |
D + β-3,4-Xylp | 4,505 | |||||
бета-3,4-Xylp + S , | 4,492 | 3,45 | 3,74 | |||
β-3,4-Xylp + D , | 4,482 | 3,45 | 3,74 | |||
бета-2,3,4-Xylp | 4,638 | |||||
S + β-2,3,4-Xylp | 4,627 | 3,59 | 3,87 | 3,88 | ||
D + β-2,3,4-Xylp | 4,616 | |||||
бета-2,3,4-Xylp + S | 4,593 | |||||
β-2,3,4-Xylp + D | 4,593 | |||||
Химические сдвиги представлены относительно внутреннего ацетона, б 2,225. | ||||||
S = Поодиночке разветвленные β-Xylp | ||||||
S + D = Поодиночке разветвленным β-Xylp + Вдвойне разветвленные бета-Xylp | ||||||
D = Вдвойне разветвленным β-Xylp | ||||||
D + D = Вдвойне разветвленным β-Xylp + Вдвойне разветвленные бета-Xylp |
Таблица 1. 1 H-ЯМР сигналы ксило-олигосахариды , генерируемых эндоксиланазой обработкой пшеницы эндосперма KOH-золь Фр
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство фазы матрицы полисахаридами клеточной стенки имеют по- видимому случайным образом замещенные основные цепи (с обоими гликозильная и не Гликозильные остатков) , которые сильно варьируют в зависимости от вида растений, стадии развития и типа ткани 3. Поскольку полисахаридами являются вторичными генные продукты их последовательность не шаблона: происходит и нет, поэтому ни один аналитический подход, например, существует для нуклеиновых кислот и белков, их последовательности. Наличие очищенных рычажную конкретных гидролитических ферментов обеспечила мощный инструмент деградировать полисахаридов олигосахаридов, которые затем могут быть хроматографически фракционированию, и при использовании в сочетании с химическими и физическими методами полностью секвенирован. Задача состоит в том, чтобы затем вновь собрать эти сложные смеси в исходный полисахарида sequence- тот, который еще предстоит быть успешно решена.
Здесь мы опишем подход (чей порядок применения окп разнообразны), которая опирается на интеграцию установленного ферментативных, химических и физических методов структурной характеристике как восстанавливающего конца (RE) и последовательности гликозильного внутренней области (ами) heteroxylans. Дополнительный метод дополняют друг друга , не описанные здесь , что оказалось весьма полезным для характеристики олигосахариды является PACE (анализ полисахарида с помощью электрофореза в углеводном геле) , разработанный группой Дюпри 19 и может быть легко интегрирован в этот протокол , если оборудование. Кроме того, вариации на LC-хроматографии также может быть полезным, например, тандем инлайн гидрофильное взаимодействия хроматографии (HILIC), а затем с помощью ОФ хроматографии, предлагающим возможность разделения как непомеченная / помечено олигосахариды в одну стадию. Методы полагаются на мечение (с 2 аминобензамидом (2ab)) восстанавливающего конца (RE) от heteroxylan цепи предшествующего уровня ферментативной (эндоксиланазой) гидролиза. Два разных подхода (см резюме вРисунок 1) принимаются. В первом случае, интактные W-SOL AXS обрабатывают 2ab помечать исходную RE основной цепи остаток сахара, а затем обрабатывают эндоксиланазой, чтобы сформировать смесь 2ab меченных RE и внутренней области восстановительной олигосахариды, соответственно. Во втором подходе KOH-золь ПТ гидролизуется с эндоксиланазой сначала подготовить смесь олигосахаридов, которые впоследствии меченных 2ab. В этом последнем случае оригинал RE из KOH-золь AX не будет помечена 2ab , поскольку она была сведена к гликозильному-альдит во время щелочной экстракции , который содержал восстановитель, борогидрид натрия (NaBH 4). Поэтому 2AB меченые олигосахариды генерироваться после ксиланазы пищеварение, будет исходить из "внутренних" олигосахаридов и оригинального RE олигосахарида будет содержать RE альдитол без 2ab тега (рисунок 1). Этот подход может быть также применен к другим классам полисахаридами Uпеть (если таковые имеются) соответствующие эндо-гидролаз.
MS-ориентированный подход значительно повышается за счет метилирования олигосахаридов генерируется после обработки эндоксиланазой , так как ООН-метилированных гидроксильную группу (ы) генерируется во время газовой фазы фрагментации на-O-метилированный олигосахаридов в MS п обеспечивает разность масс 14Da "шрам " , которые могут быть использованы для оказания помощи в идентификации ветвления и последовательности гликозильного. 5-6 Идентичность pentosyl остатков (и любого остатка сахара) не могут быть сделаны только из данных MS , но приходит от иметь знания о состав молекулы; где это не доступно , то соответствующие моносахаридов и рычажный анализы должны быть выполнены до выполнения этих заданий в MS п. Кроме того , сигналы , соответствующие RE кислой олигосахаридов альдита, генерируемой из KOH-SOL Fr (Xyl 3 -MeGlcA-ксилитом: m / z 761) и чaracteristic двудольным ксилана RE последовательность гликозильная (Xyl 2 -Rha-GALA-Ксилит: м / з 761), если они присутствуют, не в состоянии отличить , как оба имеют одинаковую молекулярную массу в нативном виде , но можно отличить от их фрагментации MS ( МС п) спектры , которые лучше всего проводить на метилированных олигосахаридов. И, наконец, методы , основанные на МС не в состоянии предоставить информацию о любой конфигурации аномерной (α / β) гликозидной связи или конфигурации D / L от sugars- это должно определяться альтернативными методами, в том числе и ферментативный физические (например, ЯМР).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
(ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
- Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).