Abstract
Denne protokollen beskriver spesifikke teknikker som benyttes for karakterisering av reduserende ende (RE) og indre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans. De-stivede hvete endospermcelleveggene ble isolert som en alkohol-uoppløselig rest (AIR) en og i rekkefølge ble ekstrahert med vann (W-sol Fr) og 1 M KOH inneholdende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) som beskrevet av Ratnayake et al. (2014) 2. To ulike tilnærminger (se sammendrag i figur 1) er vedtatt. I den første, blir intakte W-sol AXS behandlet med 2AB å merke den opprinnelige RE stammekjeden sukkerrest og deretter behandlet med en endoxylanase for å generere en blanding av 2AB-merkede RE og indre område reduserende oligosakkarider, respektivt. I en annen tilnærming, er det KOH-sol Fr hydrolysert med endoxylanase først å generere en blanding av oligosakkarider som deretter merket med 2AB. De enzymatisk utgitt ((u) merket) oligosakkarider fra bådeW- og KOH-sol Frs blir deretter metylert og detaljert strukturell analyse av både de native og metylerte oligosakkarider utføres ved hjelp av en kombinasjon av MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS og ESI-MS n. Endoxylanase fordøyd KOH-sol AXS er også preget av kjernemagnetisk resonans (NMR) som også gir informasjon om det anomere konfigurasjon. Disse teknikkene kan anvendes for andre klasser av polysakkarider ved bruk av de passende endo-hydrolaser.
Introduction
Heteroxylans er en familie av polysakkarider som er de dominerende ikke-cellulose polysakkarider av de viktigste veggene av gress og de sekundære vegger av alle angiosperms 3-6. Xylanet hovedkjedene er forskjellige i deres typer og mønstre for substitusjon med glykosyl (glukoronsyre (GlcA), arabinose (Araf)) og ikke-glykosyl (O-acetyl, ferulsyre) rester avhengig av vevstype, utviklingsstadiet og arten 7.
Veggene fra hvete (Triticum aestivum L.) endosperm hovedsakelig består av arabinoxylaner (AXS) (70%) og (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glukan (20%) med mindre mengder av cellulose og heteromannans (2% hver) 8. Xylanet ryggraden kan være forskjellig un-substituerte og overveiende mono-substituert (i hovedsak o-2-posisjon og til en mindre grad O-3-stilling) og di-substituert (O-2 og O-3 posisjoner) med α-L-Ara f rester 9. Den reduserende ende (RE) av heteroxylans fra dicots (for eksempel Arabidopsis thaliana) 10 og gymnosperms (for eksempel gran (Picea abies)) 11 inneholder en karakteristisk tetrasakkarid glykosyl rekkefølge; -β-D-fortelle XYL p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-fortelle XYL s. For å forstå heteroxylan biosyntese og funksjon (biologisk og nærings), er det viktig å fullt sekvensere xylan ryggrad for å forstå de typer og mønstre av substitusjoner, så vel som sekvensen av den reduserende enden (RE).
Spesifikke teknikker som brukes for strukturell karakterisering av reduserende ende (RE) og indre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans er beskrevet i dette manuskriptet. Teknikkene er avhengige av fluorofor merking (med 2-aminobenzamid (2AB)) den reduserende ende (RE) av heteroxylan kjeden før enzymatisk (endoxylanase) hydrolyse. Denne tilnærmingen, spesielt for RE sekvensering, bleførst rapportert av York laboratoriet 10,12-13, men er nå utvidet til å omfatte den innvendige region sekvensering og er en kombinasjon av etablerte teknikker som er like tilpasses alle heteroxylans uavhengig av deres kilde til isolasjon. Denne tilnærmingen kan også brukes til andre klasser av polysakkarider som bruker (hvor tilgjengelig) de aktuelle endo-hydrolaser.
I den foreliggende studien ble de-stivet hvete endospermcelleveggene isoleres som en alkohol-uoppløselig rest (AIR) og sekvensielt ekstrahert med vann (W-sol Fr) og 1 M KOH inneholdende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) som beskrevet i Ratnayake et al. (2014) 2. De frigitte oligosaccharider fra både W- og KOH-sol Frs blir deretter metylert og detaljert strukturell analyse av både de native og metylerte oligosakkarider utføres ved hjelp av en kombinasjon av MALDI-TOF-MS, ESI-MS QTOF-koblet med HPLC med online kromatografisk separasjon ved anvendelse av en RP C-18 kolonneog ESI-MS n. Endoxylanase spaltet KOH-sol AXS ble også karakterisert ved kjernemagnetisk resonans (NMR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Merking av Redusere End (RE) Sugar Rester av W-sol AXS med 2-aminobenzamid (2AB)
- Inkuber W-sol AXS med 2AB (0,2 M) i nærvær av 1 M NaBH3CN (natriumcyanoborhydrid) (pH 5,5) i 2 timer ved 65 ° C for å omdanne de reduserende ender av de polysakkarid-ryggraden kjedene til deres fluorescerende derivater.
FORSIKTIG: Det neste trinnet skal utføres i avtrekkskap som NaBH3CN frigjør giftig cyanidgass når den er i kontakt med vann.- Vei ut NaBH3CN (62,8 mg) og oppløses i vann (1 ml) i et mikrosentrifugerør (1,5 ml) for å fremstille en 1 M NaBH3CN løsning. Oppløs 2AB reagens (27,2 mg) i 1 M NaBH3CN oppløsning (1 ml) ved oppvarming ved 65 ° C og justere pH i reaksjonsblandingen (0,2 M 2AB, 1M NaBH3CN) til pH 5,5 med 10% eddiksyre.
- Tilsett 200 ul av reaksjonsblandingen (0,2 M 2AB, 1M NaBH3CN) til W-sål AXS (1 mg) i et glassrør med en hette og blande ved hjelp av en vortex-blander. Inkuber i 2 timer ved 65 ° C i en avtrekkshette. Avkjøl suspensjon til RT og legge 4 bind. absolutt etanol.
- Plassere suspensjonen i et kjølerom (4 ° C) O / N for å utfelle polysakkarider.
- Sentrifuge (1500 xg, 10 min, RT) for å fjerne supernatanten. Vask pelleten i stor utstrekning med absolutt etanol (4x), aceton (1x) og metanol (1x), sentrifugering mellom hver vask. Vakuum tørr ved 40 ° CO / N.
Merk: Omfattende vask fjerner også rester av 2AB.
2. Generering av Xylo-oligosakkarider fra 2 AB merkede W-sol AXS
- Oppløs 2AB merket W-sol AXS (1 mg) i 500 mL av natrium-acetat-buffer (100 mM, pH 5) i et mikrosentrifugerør (1,5 ml). Tilsett 4 enheter av endoxylanase (GH 11, [M1]) og inkuberes ved 37 ° C i 16 timer.
- Ødelegge enzymaktiviteten ved oppvarming av reaksjons mixture i 10 minutter i et kokende vannbad. Avkjøl suspensjonen til romtemperatur og overført til glassrør med en hette. Tilsett 4 bind. absolutt etanol og plassere suspensjonen i et kjølerom (4 ° C) O / N for å utfelle eventuelle ufordøyde polysakkarider.
- Sentrifuge (1500 xg, 10 min, RT) for å separere ufordøyde polysakkarider (pellet) og endoxylanase generert xylo-oligosakkarider (supernatant). Dekanter supernatanten til et rent glass tube og plassere den i et varmt vannbad (40 ° C).
- Fordamp etanol under en strøm av nitrogengass til et sluttpunkt volum (~ 500 mL). Fryse den overliggende væske ved -80 ° C i 4 timer og tørk den frosne supernatanten i en frysetørker for å gjenvinne xylo-oligosakkarider.
3. Generering av Xylo-oligosakkarider fra KOH-sol AXS og 2AB Merking
- Behandle KOH-sol AXS med endoxylanase (GH 11, [M1]) å generere xylo-oligosakkarider som beskrevet ovenfor (avsnitt 2,1-2,4).
- Unn endoxylanase generert xylo-oligosakkarider fra KOH-sol AXS med 2AB reaksjonsblanding (0,2 M 2AB, 1M NaBH3CN) som beskrevet ovenfor (avsnitt 1.1.1-1.1.2).
- Dekanter supernatanten til et rent glass tube og plassere den i et varmt vannbad (40 ° C). Fordamp etanol under en strøm av nitrogengass til et sluttpunkt volum (~ 500 mL). Fryse den overliggende væske ved -80 ° C i 4 timer og tørk den frosne supernatanten i en frysetørker for å gjenvinne xylo-oligosakkarider.
4. MALDI-TOF-MS
- Utarbeidelse av MALDI-matrise Solution
- Legge til en liten kule av 2, 5-dihydroxbenzoic syre (DHB) til 50% acetonitril (500 ml) inneholdende 0,1% maursyre i et rør (MALDI-matrise-oppløsning). Bland ved hjelp av en virvel, hvis det løser seg raskt, legge til et lite scoop av DHB. Merk: Ideal konsentrasjon av MALDI-matrix løsning er 10 ug / ul -1.
- Utarbeidelse av MALDI-target Plate
- Deponere aqueooss oligosakkarid (native) prøver (5-10 mikrogram) (W-sol og / eller KOH-sol) på en MALDI-sikteplate. Legg 0,3 mL MALDI-matriseoppløsningen ved hjelp av en separat spiss og bland ved å pipettere opp og ned. La blandingen tørke ved romtemperatur.
Merk: Riktig tørkede prøver bør bestå av lange nålformede krystaller som peker mot midten av flekken. Hvis innskuddet er klebrig og / eller smeary prøven kan enten være for konsentrert eller bestå av salter, slike forekomster er neppe til å produsere gode spektra og prøven bør bli renset ytterligere. - Introduser sikteplate inn i MS kilde og operere i positiv (+ ive) ion modus. Juster akselerator spenningen til 19,0 kV ved en ionekilde og 16,3 kV ved ione-kilden 2. Juster lasereffekt til høyere enn 70%. Velg prøven sted på MALDI-target plate og klikk på Start for å begynne laser skudd.
Merk: Alle områder av målet vil ikke gi signaler. En bestemt sted vil bare gi et signal for et par laserskudd enten skyldesutarming av prøve / matriks-blanding eller karakteristikker av krystallen.- Flytter laseren til forskjellige deler av målet under innhenting og gjennomsnittlig ca. 200 tilfeldig spektra for å oppnå tilfredsstillende signal-til-støy.
- Deponere aqueooss oligosakkarid (native) prøver (5-10 mikrogram) (W-sol og / eller KOH-sol) på en MALDI-sikteplate. Legg 0,3 mL MALDI-matriseoppløsningen ved hjelp av en separat spiss og bland ved å pipettere opp og ned. La blandingen tørke ved romtemperatur.
5. ESI-QTOF-MS
- Analyser endoxylanase generert oligosakkarider (native) ved hjelp av nano-HPLC kombinert med en electrospray ionisering (ESI) kvadrupol tiden av fly (QTOF) MS instrument med online kromatografisk separasjon ved hjelp av en RP C-18 kolonne (75 mikrometer x 150 mm, 3,5 mikrometer perle størrelse).
- Overfør endoxylanase generert vann oligosakkarider blandingen i en ampulle og plasser i HPLC auto sampler. Programmere elueringsgradient fra 5-80% med de mobile faser 0,1% (v / v) maursyre i vann og 0,1% (v / v) maursyre i acetonitril, henholdsvis, i løpet av 60 min.
- Regulere strømningshastigheten til 0,2 ul / min. Juster positive-ion modus i skanneområdetav 300-1,600 m / z og en scan-hastighet på 0,5 skanninger / andre som bruker kildeforhold ESI som følger: gardin gass 10, GS1 4, kilde temperatur 100 ° C, ion spray spenning 2300 V, og de-clustering potensial 50 V. Kjør LC kromatografiske program og elueres oligosakkarider. Den resulterende totale ion kromatogram (TIC) lagres automatisk av programvaren.
- Åpne den lagrede TIC og velg extract kromatogram. Skriv inn de forventede masser (f.eks 271, 403, 535, 667, 799 og 931 m / z) på kommandolinjen. Scan kromatogram ved å klikke på Enter. Behandle de valgte ion undersøkelser av ESI-QTOF MS kromatogram data ved hjelp av programvaren i henhold til produsentens instruksjoner 14.
6. ESI-MS n
- Sett 1 til 2 ul per-O-metylert oligosakkarid (metylert som beskrevet av Pettolino et al. 1) prøve i 50% acetonitril i et nanospray spiss ved hjelp av en sprøyte. trimnano-dysen ved hjelp av en glasskutteren for å passe inn i den diskrete nanospray holder festet til MS.
- Still Masse i henhold til den forventede masse området (200-1,500 m / z) og gardin gass til 10, ionspray spenning på 1900 V og polariteten til positiv.
- Trykk på erverve knappen for å åpne relevant vindu, legge inn data filnavnet for å få en total ion scan (ESI-MS 1). Deretter trykker du på STOP-knappen.
- Endre skannetype fra produktet ion å fragmentere en topp på interesse. Oppgi massen av interesse (for eksempel 885 m / z) for å fragmentere og justere massen området (200-900 m / z). Trykk på erverve knappen og juster kollisjonsenergien (opp og / eller ned i kategorien sammensatte) for å oppnå hele fragmentering av foreldre ion (885 m / z) og få et fragment ion scan (ESI-MS 2).
- Skriv inn masse av fragment ion av interesse (for eksempel 711 m / z) og juster masse utvalg (200-720 m / z). Trykk på Hent end justere kollisjonsenergi for å oppnå hele fragmentering av forløper-ion (711 m / z) og skaffe et fragment ion-skanning (ESI-MS 3).
7. H 1 NMR spektroskopi
- Oppløs endoxylanase genererte blanding av oligosakkarider (KOH-sol, native form) (~ 500 ug) i D2O (1,0 ml, 99,9%) i en plast prøverør (15 ml). Fryse suspensjonen ved -80 ° C i 4 timer og tørk den frosne suspensjon i en frysetørker for å gjenvinne xylo-oligosakkarider.
- Gjenta 7,1 ganger for å fullt bytte H 2 O med D 2 O.
- Oppløs tørket oligosakkarider i D2O (0,6 ml, 99,9%) og tilsett 0,5 mL aceton (5% i D 2 O) som en indre standard. Overfør deutererte oligosakkarider inn i NMR prøverøret.
- Hold NMR-rør inneholdende prøven ved toppen og sett prøverøret i et plast spinner. Plasser spinner i prøven dybdemåler. Pussh eller trekke prøverøret for å justere dybden av prøven for å sikre at midtlinjen av prøven topp- og bunndybdemålere er like.
- Fjern det dybdemåleren og sette prøven i den automatiske prøvetaker festet til et 600 MHz NMR-spektrometer utstyrt med et kryo-probe.
- Pålogging og åpen spektrometer kontroll programvare. Skriv prøve filnavnet. Åpne et eksisterende datasett og deretter bruke "EDC" -kommandoen til å lagre den under et nytt navn. Skriv inn posisjonsnummeret til prøven i auto sampler og trykk "Enter".
Merk: Ved å trykke på "Enter" -knappen vil slippe prøverøret forsiktig til magneten bore hvor det vil bli plassert på toppen av sonden. - Still inn ønsket prøvetemperatur ved å skrive "edte" på kommandolinjen. Vent til prøvetemperaturen for å nå ønsket verdi før du går videre til neste trinn. Enter "lås" på kommandolinjen og velg passende løsemiddel (D 2 O). Vent til & #34; låse ferdig "-melding vises nederst i vinduet.
- Skriv "atmm" på kommandolinjen og klikk "optimalisere" på toppen av atmm menylinjen. Velg starte for justering og tilpasning av sonden for den valgte kanalen (1 H i dette tilfelle).
- Skriv "topshim" på kommandolinjen for shimsingen prosess hvor små justeringer er gjort i magnetfeltet til uniform magnetfelt oppnås rundt sample.Acquire signalet ved å skrive "zg" på kommandolinjen og skriv.
- Analyser spektra ved hjelp av programvare 15 i henhold til produsentens instruksjoner med en H kjemisk skift refererte til en intern standard aceton ved 2.225 ppm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endoxylanase fordøyelse av 2AB-merkede W-sol AXS genererer en blanding av 2AB-merkede RE oligosakkarider og en serie av un-merkede (uten 2AB label) oligosakkarider avledet fra de indre regioner av xylan kjeden (figur 1; fra Ratnayake et al. 2). En serie av kromatografiske metoder blir så brukt for å fraksjonere den komplekse blanding av isomerer. Til slutt, blir MS-teknikker anvendes for å identifisere de isomere strukturer som er så sekvensert ved MS n teknikker. Her presenterer vi et representativt, snarere enn omfattende, eksempel på tilnærmingen.
Signalene i det MALDI-TOF-MS-spektrum av oligosakkarider avledet fra 2AB-merket naturlig W-sol AXS (figur 2A) og består av en meget rikelig pseudo-molekylært ion serie ved m / z 701, 833, og 965 som representerer en serie av umerket nøytral internregionens oligosakkarider med 5-7 pentosyl rester (P 5-7), henholdsvis. En serie av signaler ved m / z 745, 877, og 1009, angir at en umerket surt oligosakkarid serie, med P 4-6 + hexa 1 (Hexuronic syre), er også til stede i denne fraksjon (figur 2A). Pseudo-molekylært ioner ved m / z 821 og 953 indikerer tilstedeværelsen av den 2AB-merkede opprinnelige RE oligosakkarider P 5-6 + 2AB, respektivt.
ESI-QTOF-MS-analyse av native oligosakkarider med en on-line kromatografisk fraksjonering av oligosakkarider ved RP C-18-HPLC utføres deretter. Figur 2B og 2C viser de valgte ion skanner, utvunnet fra ESI-QTOF-MS total ion kromatogram (TIC), av oligosakkarider utgitt av endoxylanase fra W-sol Fr AXS. De signaler som omfatter et pseudo-molekylært ion serier tildelt som [M + NH4] + ved m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224 og 1356 som representerer en serie av indre region nøytrale oligosakkarider med 5-10 pentosyl rester (P 5-10), respektivt (figur 2B). Flere isomere strukturer er mulig for et oligosakkarid med en definert masse (se nedenfor ESI-MS n-analyse). Derav flere topper for hver av de molekylære ion skanner er mulig som observeres i figur 2B. Pseudo-molekylært ioner som er tilordnet [M + H] + ved m / z 271, 403, 535, 667, 799, og 931 indikerer tilstedeværelsen av et 2AB-merket oligosakkarid RE serie P 1-6 + 2AB, henholdsvis (figur 2C) . De signaler som detekteres som [M + H] + ioner ved m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, og 1273 indikerer tilstedeværelse av en sur oligosakkarider med P 3-8 + heksa 1, henholdsvis (figur 2C). I commelenid enfrøbladete planter, kan det xylan ryggraden også være substituert med fenoliske syrer,hovedsakelig ferulsyre (og også p -coumaric syre), som har den samme molekylvekt som glukuronsyre og kan påvises i W-sol AXS av hvete stivelse celleveggene. Men videre analyse av W- og KOH-sol AXS bruker ESI-MS n (og kompositorisk analyser ved GC-MS av TMS derivater følgende metanolyse, ikke vist her) bekrefte sure oligosakkarider med P 3-8 + Hexa 1 i hvete stivelse AXS.
De signaler som er tilordnet som [M + H] + ioner av ESI-Q-TOF fullstendig skanning spektrum av området mellom 3,10 til 3,48 min (figur 2D) innbefatter serien av 2AB merket RE oligosakkarider: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, og 1195 (P 1-8 + 2AB, henholdsvis). En serie av pseudo-molekylære ioner i ESI-Q-TOF fullstendig skanning spekteret av området mellom 3,59 til 4,05 min (figur 2E) representerer de interne regionens sure oligosakkarider observered som begge [M + Na] + ioner: m / z 613, 745, 877, 1009, og 1141 (P 3-7 + heksa 1, henholdsvis) og [M + NH4] + ioner: m / z 740, 872, 1004, 1136, og 1268 (P 4-8 + heksa 1, henholdsvis).
For å sekvensere de enkelte oligosakkarider, utførte vi ESI-MS n på per-O-denaturert oligosakkarider stedet for på innfødte oligosakkarider hentet fra W-sol og KOH-sol AXS siden det er utfordrende å utvetydig tildele strukturer ved å sekvensere innfødte oligosakkarider . I tillegg kreves det også større mengder av materiale. Metylering av oligosakkaridene ble utført som beskrevet av Pettolino et al. 1. ESI-MS n undersøkelser utført på RE nøytral oligosakkarid alditoler avledet fra KOH-sol AXS, og 2AB merket nøytral RE oligosakkarid avledet fra W-sol AXS er beskrevet below som et eksempel for å hjelpe til med tolkning av spektrene og utledet strukturer. Den samme metode kan anvendes på alle de oligosakkarider som genereres fra enzymatisk hydrolyse. De fragmentioner i ESI-MS n-spektra ble identifisert som Y og B-ioner i henhold til Domon og Costello. 16 Un-metylert hydroksyl-gruppe (r) som dannes under gassfase-fragmentering av per-O-metylert oligosakkarider i MS n gir en 14Da masse forskjell "arr" som kan brukes til å identifisere forgreningsmønsteret og de glykosylgrupper sekvenser. 12-13 Hver arr som genereres av fragmentering arrangementet er merket som en heltrukket linje (figur 3 og 4). Som flere isomere strukturer er mulig for en definert masse, da i disse isomere strukturer, Y og B-ioner er merket med rødt og sort, respektivt.
ESI-MS 2, ESI-MS 3 og ESI-MS 4 SPECTra av per-O-metylert RE nøytral oligo-glycosyl alditol generert fra fragmentering av pseudo-molekylært ion m / z 885 (P 4 + fortelle XYL ol) er vist i figur 3. ESI-MS 2-spektrum inneholder rikelig Y ioner ved m / z 711, 551, og 391 som genereres av tapet av ett, to og tre pentosyl-rester, henholdsvis, fra den overordnede ion. Den rike m / z 711 ion kan genereres enten ved tap av et ikke-reduserende terminale ende fortelle XYL rest eller ved tap av en terminal sidekjede Ara rest. Den diagnostiske Y m / z 391 ion i det resulterende spektrumet kan genereres fra tapet av tre ikke-reduserende ende fortelle XYL rester fra RE oligosakkarid som har en sidekjede Ara rester på RE fortelle XYL ol-rest eller RE oligosakkarid som har en sidekjede Ara rester på 2 nd fortelle XYL rester fra RE fortelle XYL ol rester. Selv om det er en formell mulighet for at andre strukturer, så somFortelle XYL 4 -Xyl ol, og (Ara) fortelle XYL-fortelle XYL-fortelle XYL-fortelle XYL ol ville gi opphav til denne fragment ion disse strukturene er ekskludert fra hensyn som spesifisiteten av endo-xylanase som brukes til å spalte polysakkarid enten ville forringe eller ikke henge fast ved glykosidisk binding i tilknytning til et forgreningspunkt, henholdsvis. Tilsvarende kan den diagnostiske Y m / z 551 ion genereres fra tapet av to ikke-reduserende ende fortelle XYL rester fra RE oligosakkarid som har sidekjeden Ara rest på enten RE fortelle XYL ol-rest eller RE oligosakkarid som har side kjede Ara rester på den nest siste fortelle XYL rest. Således kan bli foreslått fire mulige isomere strukturer (figur 3: I, II, III og IV). Den rikelige Y-ion m / z 377 (se Figur 3: Ia og IIa) og B ion m / z 503 (se Figur 3: la, lb, IVa og IVb) som er generert fra ytterligere fragmentering av isomere forløper m/ z 711 ion er også observert i dette spekteret. ESI-MS 3-spektrum (figur 3) som er registrert ved fragmentering av isomere forløper m / z 711 ioner inkludert en hovedtopp ved m / z 537 (Y ion av P 2 + fortelle XYL ol med to arr, generert fra den forløperion Ia , Ib, IIa, IIb, Ula, IIIb, IVa og IVb) og m / z 391 (Y ion av P 1 + fortelle XYL ol med en arr, generert fra forløperen ion IIb, Ula, IIIb, IVa og IVb). Disse to hovedtopper (m / z 537 og m / z 391) kan frembringes ved tapet av en og to ikke-reduserende terminale fortelle XYL-rester, henholdsvis fra den isomere forløper m / z 711 ion generert fra fragmentering av pseudo -molecular moder ion m / z 885 (P + 4 fortelle XYL ol) ved ESI-MS 2. Relativt lavere overflod topper ved m / z 377 (Y ion av P 1 + fortelle XYL ol med to arr, generert fra precursor ion Ia og IIa) og 551 (Y ion av P 2 + fortelle XYL ol med en arr, generert fra den forløperion lb og Ilb) ble også observert i dette spekteret.
ESI-MS fire av fragmenteringen av den isomere forløper m / z 551 ioner inkludert en hovedtopp ved m / z 377 (Y ion av P 1 + fortelle XYL ol med to arr) og m / z 391 (Y ion av P 1 + fortelle XYL ol med en arr) som ble generert fra forløperen ion av strukturene i og II. Derfor den kollektive bevis antydet at RE glykosyl sekvens består av Ara sidekjede festet til RE fortelle XYL ol rest (diagnostisk fragmentering sti m / z 885 → 711 → 551 → 391, figur 3II), Ara side kjetting festet til både RE fortelle XYL ol og den nest siste (1 st fortelle XYL rester fra RE fortelle XYL ol) fortelle XYL rest (diagnostisk fragmentering sti m / z 885 → 711 → 537 → 391, figur 3III), Ara side kjetting festet til den nest siste (1 st fortelle XYL fra RE fortelle XYL ol) fortelle XYL rest (diagnostisk fragmentering sti m / z 885 → 711 → 537 → 377, figur 3I) og Ara sidekjede festet på 2 nd fortelle XYL rester fra RE fortelle XYL ol (figur 3IV).
Tilstedeværelsen av disse ionene bekrefter den foreslåtte isomere strukturer I, II, III og IV, og den nøytrale RE oligosakkarid struktur av: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl s.
ESI-MS 2-spektrum av per-O-metylerte 2AB merkede oligosakkarid RE generert fra fragmentering av kvasi-molekylær [M + Na] + ion ved m / z 871 (P + 4 2AB) er vist i figur 4. Dette spektrum omfatter de mest tallrike Y-ion ved m / z 697 (P 3 + 2AB med ett arr), m / z 537 (P 2 + 2AB med en arr) og m / z 377 (P 1 + 2AB med en arr), dannet ved tap av enten en, to eller tre ikke-reduserende pentosyl-rester, henholdsvis. M / z 697 ion kan genereres enten ved tap av et ikke-reduserende terminale ende fortelle XYL rest eller ved tap av en terminal Ara rest, mens m / z 537 ion kan bare frembringes ved tapet av to terminale fortelle XYL rester . Den diagnostiske fragmentering pathway (m / z 871 → 697 → 537 → 377) foreslått at eksistensen av lineære un-forgrenede xylan ryggrad oligosakkarid (er) ved RE som svarer til den kvasi-molekylært ion m / z 871 (P 4 + 2AB ). Men den lineære un-forgrenet xylosyl ryggrad (P 4 + 2AB) er susceptible til stedsspesifikke endoxylanase for videre fordøyelse. Derfor er to isomere m / z 697 ioner kan eksistere. Følgelig er to mulige isomere strukturer er foreslått (Figur 4: I og II). I disse isomere strukturer Y og B-ioner er merket med rødt og sort, respektivt. ESI-MS 3-spektrum registreres fra fragmentering av isomere forløper m / z 697 ion genererer m / z 523 ion (Y ion av P 2 + 2AB med to arr, figur 4, strukturer la, Ib, Ila og Ilb), m / z 363 ion (Y ion av P 1 + 2AB med to arr, figur 4, struktur Ila) og Y-ion ved m / z 377 (P 1 + 2AB med en arr, figur 4, strukturer Ia og Ib). Fragmentet ion ved m / z 377 kan bare oppstå fra den foreslåtte struktur I og fragmentet ion ved m / z 363 kan bare oppstå fra den foreslåtte struktur II. Det samtidige nærvær av disse to ioner bekrefter den foreslåtte strukturene I og II. Dermed RE glykosyl sekvensen av xylan kjeden av hvete-endosperm AXS består av en Ara gren er festet til den RE fortelle XYL rest (fragmentering sti m / z 871 → 697 → 523 → 363) og / eller nest siste fortelle XYL rest (fragmentering sti m / z 871 → 697 → 523 → 377).
NMR-analyse av den AXS
MS-baserte analyser ikke gi informasjon om enten den anomeriske konfigurasjon (α / β) eller D / L-konfigurasjonen av sukkerarter som må oppnås ved andre metoder, herunder enzymatisk og fysisk (for eksempel, NMR). For heteroxylans med den karakteristiske RE redusert tetrasakkarid (fortelle XYL-Rha-fest fortelle XYL ol), inneholder det NMR-spektrum anomere signaler som fører til identifikasjon og sekvensering av denne RE oligosakkarid. Vi beskriver bruk av 600 MHz 1D 1H-NMR-spektroskopi som et enkelt trinn metode for å DETrøyskatt den fullstendige glykosyl-sekvensen av hveteendospermen AX RE oligosaccharid på KOH-sol Fr, inkludert det anomeriske konfigurasjon (α / β) og D / L-konfigurasjonen av sukkerarter. Resonanser ble tildelt på grunnlag av publiserte oppdrag av hvete AX oligosakkarider 17-18 (Figur 5, Tabell 1). Den 1H-NMR-spektrum av AX ekstrahert fra hvete endospermen er dominert av den anomere kjemisk skift på 5,39, 5,27 og 5,22 ppm som er tilordnet proton av en terminal α-L-Ara f rest, bundet til O-3 stilling (T-α-L-Ara f → 3-S) av de enkeltvis forgrenede (1,4) -β-fortelle XYL p ryggradsrester, og begge O-3 og O-2 posisjoner (T-α-L-Ara f → 3 D og T-α-L-Ara f → 2 D) av dobbelt forgrenede (1,4) -β-fortelle XYL p ryggradsrester, henholdsvis (figur 5 og tabell 1).
f → 3 S + D) H1 signal av α-L-Ara f sidekjede bundet til O-3-stillingen av enkeltvis forgrenede β-D-p fortelle XYL rest med tilstøtende dobbelt forgrenet β-D-fortelle XYL s. Signalet ved 5.29 er tilordnet den (T-α-L-Ara f → 3 D + D) H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-3-stillingen av dobbelt forgrenede β-D-fortelle XYL p residuet med tilstøtende dobbelt forgrenet β-D-fortelle XYL s. signalet ved 5.24 er tilordnet den (T-α-L-Ara f → 2 D + D) H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden som er knyttet til O-2-stillingen av dobbelt forgrenede β-D-p fortelle XYL rest med tilstøtende dobbelt forgrenet β-D-fortelle XYL s.
Figur 2. MALDI-TOF MS (A) og ESI-MS QTOF (B - E) analyse av innfødte oligosakkarider utgitt av endoxylanase fra 2AB-merket W-sol AXS som skissert i figur 1. MALDI-TOF MS-spektrum: (A) ( signalene en re identifisert som [M + Na] + addukt-ioner); Utvalgte skanninger ion av ESI-QTOF MS kromatogrammene: B = P 5-10 avledet fra interne regionens oligosakkarider (Signalene er identifisert som [M + NH 4] + adduktpartiklene ioner), C = P 1-6 + 2AB avledet fra RE oligosakkarider (signalene blir identifisert som [M + H] + addukt-ioner) og P 3-8 G avledet fra sure oligosakkarider (signalene blir identifisert som [M + Na] + addukt-ioner); D = ESI-Q-TOF fullstendig scan-spektrum: område mellom 3,10 til 3,48 min, E = ESI-Q-TOF full skanning-spektrum: området mellom 3,59 til 4,05 min (signalene blir identifisert som både [M + Na] + og [M + NH4] + addukt ioner ); P = pentosyl enhet (enten Ara eller fortelle XYL); G = uronosyl rest (GlcA); RE = reduserende ende oligosakkarider; 2AB = 2 aminobenzamid; EIC: utvunnet ion kromatogram. ad / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. ESI-MS 2, ESI-MS 3 og ESI-MS 4 spektra av per-O-denaturert RE nøytral glykosyl alditol (P 4 + fortelle XYL ol) - m / z 885. Signalene tildelt som [M + Na] + pseudo-molekylær ion-addukter. Som flere isomere strukturer for et definert masse er mulig da i isomere strukturer Y og B-ioner er merket i rødt og svart, henholdsvis. Hver "arr" generert av fragmentering hendelsen er merket som en heltrukken linje. X = xylosyl rester; A = Arabinosyl rester. ESI-MS 3 spektra er gjengitt med tillatelse fra Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. ESI-MS 2 og ESI-MS tre spektra av per-O-metylerte 2AB merket nøytral RE oligosakkarid (P 4 + 2AB) - m / z 871. Signalene blir tildelt som [M + Na] + pseudo -molecular ion addukter. Som flere isomere strukturer for et definert masse er mulig i isomere strukturer, er Y og B-ioner merket i rødt og svart henholdsvis. Hver "arr" generert av fragmentering hendelsen er merket som en heltrukken linje. X = xylosyl rester; A = Arabinosyl rester. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Ratnayake et al. (2014) 2. Klikk her for å se et større version av denne figuren.
Figur 5. anomere region av de 600 MHz 1D 1H-NMR-spektrum av øksen oligosakkarider dannet ved endoxylanase behandling av KOH- Sol Fr. 1H kjemisk skift referert til en indre standard av aceton ved 2,225 ppm. T-α-L-Ara f → 3 S: H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-3-stillingen av enkeltvis forgrenede β-D-p fortelle XYL rest; T-α-L-Ara f → 2 D: H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-2-stillingen av dobbelt forgrenede β-D-fortelle XYL p-rest; T-α-L-Ara f → 3 D: H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-3-stillingen av dobbelt forgrenede β-D-fortelle XYL p-rest; T-α-L-Ara f → 3 S + D: H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-3-stillingen av enkeltvis forgrenede β-D-p fortelle XYL rest med tilstøtende dobbelt forgrenet β-D- fortelle XYL p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-2-stillingen av dobbelt forgrenede β-D-fortelle XYL p rest med tilstøtende dobbelt forgrenet β-D -Xyl p; T-α-L-Ara f → 3 D + D: H1 signal fra α-L-Ara f-sidekjeden bundet til O-3-stillingen av dobbelt forgrenede β-D-fortelle XYL p rest med tilstøtende dobbelt forgrenet β-D -Xyl p; 2-α-L-Ara f → 3 S: H1 signal fra 2-α-L-Ara f sidekjede rester festet til O-3 posisjon enkeltvis forgrenet β-D-fortelle XYL p rest; Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
| sukker rester | H-1 / C-1 | H-2 / C-2 | H-3 / C-3 | H-4 / C-4 | H-5 eq / C-5 | H-5 ax / C-5 |
| T-α-L-Araf → 3 S | 5,396 / 107,6 | 4.16 | 3,95 | 4.3 | 3,82 | 3,72 |
| T-α-L-Araf | 5,415 / | 4.18 | 3,95 | |||
| → 3 S + D | ||||||
| T-α-L-Araf → 2 D | 5,223 / | 4.16 | 3,97 | 3,82 | 3,74 | |
| T-α-L-Araf → 2 D + D | 5,243 / | 4.16 | 3,98 | |||
| T-α-L-Araf → 3 D | 5,272 / 108,9 | 4.18 | 3,96 | 4,26 | 3,79 | 3,74 |
| T-α-L-Araf → 3 D + D | 5,298 / | 4.18 | 3,96 | |||
| 2-α-L-Araf → 3 S | 5,548 / 106,4 | 4.27 | 4,06 | 4.3 | 3,82 | |
| a-Xylp (Redusere) | 5,185 / 91.9 | 3.55 | 3,72 | |||
| P-Xylp (Redusere) | 4,580 / 96.6 | 3,29 | 3,48 | 3,64 | 4,06 | 3,38 |
| β-4-Xylp | 4,470 / | 3,32 | 3,58 | |||
| ß -4-Xylp + S | 4,461 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3,36 |
| β-4-Xylp + D | 4,448 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3,36 |
| ß-3,4-Xylp | 4,518 / | 3,44 | 3,85 | |||
| S + β-3,4-Xylp | 4,514 / | 3,47 | 3,75 | 3,86 | 4.14 | 3,43 |
| D + β-3,4-Xylp | 4,505 | |||||
| ß-3,4-Xylp + S | 4,492 | 3.45 | 3,74 | |||
| β-3,4-Xylp + D | 4,482 | 3.45 | 3,74 | |||
| P-2,3,4-Xylp | 4,638 | |||||
| S + β-2,3,4-Xylp | 4,627 | 3,59 | 3,87 | 3,88 | ||
| D + β-2,3,4-Xylp | 4,616 | |||||
| P-2,3,4-Xylp + S | 4,593 | |||||
| β-2,3,4-Xylp + D | 4,593 | |||||
| Kjemiske skift er angitt i forhold til indre aceton, S 2,225. | ||||||
| S = Enkeltvis forgrenet β-Xylp | ||||||
| S + D = Enkeltvis forgrenet β-Xylp + Dobbelt forgrenet β-Xylp | ||||||
| D = Dobbelt forgrenet β-Xylp | ||||||
| D + D = Dobbelt forgrenet β-Xylp + Dobbelt forgrenet β-Xylp | ||||||
Tabell 1. 1H-NMR-signaler fra de xylo-oligosakkarider som genereres av endoxylanase behandling av hvete endospermen KOH-sol Fr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste matrise fase cellevegg polysakkarider har tilsynelatende tilfeldig byttet stamnett (med både glykosyl og ikke-glykosylrester) som er svært variabel avhengig av plantearter, utviklingsstadiet og vevstype tre. Siden polysakkarider er sekundære genprodukter deres sekvens ikke er templat avledet og det er derfor ikke enkelt analytisk tilnærming, som for eksempel finnes for nukleinsyrer og proteiner, for deres sekvensering. Tilgjengeligheten av rensede koblings-spesifikk hydrolytiske enzymer har gitt et kraftig verktøy for å nedbryte polysakkarider til oligosakkarider som kan deretter bli kromatografisk fraksjonert, og når det brukes i kombinasjon med kjemiske og fysikalske teknikker fullstendig sekvensert. Utfordringen er å deretter re-montere disse komplekse blandinger i den opprinnelige polysakkarid sekvens en som fortsatt er å være vellykket behandlet.
Her beskriver vi en tilnærming (hvis ordre av søknaden can være variert) som er avhengig av integrering av etablerte enzymatisk, kjemisk og fysikalske teknikker for strukturell karakterisering av både reduserende ende (RE) og indre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans. En ytterligere komplementære teknikk ikke beskrevet her som har vist seg svært nyttig for å karakterisere oligosakkarider er PACE (polysakkarid analyse av karbohydrat-gelelektroforese) utviklet av den Dupree 19 gruppen, og det kan lett integreres i denne protokollen hvis utstyret er tilgjengelig. Videre kan variasjoner på LC kromatografi også være anvendbare, for eksempel tandem linjebundet hydrofil interaksjons-kromatografi (HILIC) fulgt av RP-kromatografi og tilbyr muligheten til å separere både ukodet / merket oligosakkarider i et enkelt trinn. Teknikkene er avhengige av merking (med to aminobenzamid (2AB)) den reduserende enden (RE) av heteroxylan kjeden før enzymatisk (endoxylanase) hydrolyse. To ulike tilnærminger (se sammendrag iFigur 1) er vedtatt. I den første, blir intakte W-sol AXS behandlet med 2AB å merke den opprinnelige RE stammekjeden sukkerrest og deretter behandlet med en endoxylanase for å generere en blanding av 2AB-merkede RE og indre område reduserende oligosakkarider, respektivt. I en annen tilnærming KOH-sol Fr hydrolyseres med endoxylanase først å generere en blanding av oligosakkarider som deretter merket med 2AB. I dette siste tilfellet den opprinnelige RE av KOH-sol AX ikke ville være merket med 2AB, siden det hadde blitt redusert til glykosyl-alditol under alkaliske ekstraksjonen som inneholdt reduksjonsmiddel, natriumborhydrid (NaBH4). Derfor 2AB-merkede oligosakkaridene generert post-xylanase fordøyelse, vil stamme fra "interne" oligosakkarider og den opprinnelige RE oligosakkaridet inneholder en RE alditol uten et 2AB tag (se figur 1). Denne fremgangsmåten kan også anvendes for andre klasser av polysakkarider usynge (når ledig) de aktuelle endo-hydrolaser.
Den MS-baserte tilnærmingen er betydelig forbedret ved metylering av oligosakkarider generert etter endoxylanase behandling siden FN-metylert hydroksyl gruppe (r) som dannes under gassfase fragmentering av pr-O-denaturert oligosakkarider i MS n gir en 14Da masse forskjell "arr «som kan brukes til å hjelpe til med identifikasjon av forgrening mønster og glykosyl-sekvensen. 5-6 identiteten til pentosyl rester (og en hvilken som helst sukkerrest) kan ikke fremstilles fra de MS-data alene, men kommer fra å ha kunnskap om sammensetningen av molekylet; der dette ikke er tilgjengelig da de relevante monosakkarid og koblingsanalyser må utføres før du gjør disse oppgavene i MS n. Videre signalene som tilsvarer RE sure oligosakkarider alditol, generert fra KOH-sol Fr (fortelle XYL 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) og characteristic dicot xylan RE glykosyl sekvens (fortelle XYL 2 -Rha-fest Xylitol: m / z 761), hvis de finnes, er ikke i stand til å skilles som begge har samme molekylmasse i det opprinnelige form, men kan skilles fra sin MS fragmentering ( MS n) spektre som er best utført på denaturert oligosakkarider. Til slutt, MS-baserte teknikker ikke er i stand til å gi informasjon om enten det anomere konfigurasjon (α / β) av glykosidisk binding eller D / L konfigurasjon av sugars- dette må bestemmes av alternative metoder, inkludert enzymatisk og fysiske (f.eks NMR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
- Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
