Abstract
Denne protokol beskriver de specifikke teknikker, der anvendes til karakterisering af reducerende ende (RE) og indre område glycosyl sekvens (er) af heteroxylans. De stivede hvede endospermcellevægge blev isoleret som en alkohol-uopløselig rest (AIR) 1 og successivt ekstraheret med vand (W-sol Fr) og 1 M KOH indeholdende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) som beskrevet af Ratnayake et al. (2014) 2. To forskellige tilgange (se oversigt i figur 1) er vedtaget. I den første, er intakte W-sol AXS behandlet med 2AB at tagge den oprindelige RE hovedkæden sukkerrest og behandles derefter med et endoxylanase at generere en blanding af 2AB-mærket RE og indre region reducerende oligosaccharider, hhv. I en anden fremgangsmåde bestemmes KOH-sol Fr hydrolyseres med endoxylanase først generere en blanding af oligosaccharider, som efterfølgende mærket med 2AB. De enzymatisk frigivet ((FN) mærkede) oligosaccharider fra bådeW- og KOH-sol FR'erne derefter methyleret og den detaljerede strukturelle analyse af både native og methylerede oligosaccharider udføres ved anvendelse af en kombination af MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS og ESI-MS n. Endoxylanase fordøjet KOH-sol AXS er også karakteriseret ved kernemagnetisk resonans (NMR), der også indeholder oplysninger om den anomere konfiguration. Disse teknikker kan anvendes med andre klasser af polysaccharider anvendelse af de passende endo-hydrolaser.
Introduction
Heteroxylans er en familie af polysaccharider, der er de dominerende ikke-celluloseholdige polysaccharider af de primære vægge græsser og de sekundære vægge i alle dækfrøede 3-6. Xylan rygrade afviger i deres typer og substitutionsmønstre med glycosyl (glucuronsyre (GIcA), arabinose (Araf)) og ikke-glycosyl (O-acetyl, ferulasyre) rester afhængigt af vævstype, udviklingsstadie og arter 7.
Vægge fra hvede (Triticum aestivum L.) endosperm er sammensat primært af arabinoxylaner (AXS) (70%) og (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucaner (20%) med mindre mængder af cellulose og heteromannans (2% hver) 8. Den xylan rygrad kan være forskelligt usubstitueret og overvejende mono-substitueret (primært O-2-stillingen og i mindre grad O-3 positionen) og di-substitueret (O-2 og O-3 positioner) med α-L-Ara F-rester 9. Den reducerende ende (RE) heteroxylaner fra tokimbladede planter (f.eks Arabidopsis thaliana) 10 og nøgenfrøede (f.eks gran (Picea abies)) 11 indeholder en karakteristisk tetrasaccharid glycosyl sekvens; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl s. For at forstå heteroxylan biosyntese og funktion (biologisk og industriel), er det vigtigt at fuldt sekventere xylan rygrad at forstå de typer og mønstre af substitutioner samt sekvensen af den reducerende ende (RE).
Specifikke teknikker, der anvendes til strukturel karakterisering af reducerende ende (RE) og indre område glycosyl sekvens (er) af heteroxylans er beskrevet i dette håndskrift. Teknikkerne afhængige fluorofor tagging (med 2 aminobenzamid (2AB)) den reducerende ende (RE) af heteroxylan kæden før enzymatisk (endoxylanase) hydrolyse. Denne tilgang, især for VE sekventering, varførst rapporteret af York laboratorium 10,12-13 men er nu udvidet til at omfatte den interne region sekventering og er en kombination af etablerede teknikker, der er lige så tilpasses alle heteroxylans uanset deres kilde til isolation. Denne fremgangsmåde kan også anvendes på andre klasser af polysaccharider hjælp (hvor muligt) de relevante endo-hydrolaser.
I den foreliggende undersøgelse blev de-stivede hvede endospermcellevægge isoleret som en alkohol-uopløselig rest (AIR) og successivt ekstraheret med vand (W-sol Fr) og 1M KOH indeholdende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) som beskrevet i Ratnayake et al. (2014) 2. De frigivne oligosaccharider fra både W- og KOH-sol FR'erne derefter methyleret og den detaljerede strukturelle analyse af både native og methylerede oligosaccharider udføres ved anvendelse af en kombination af MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-koblet med HPLC med online kromatografisk separation under anvendelse af en RP C-18-søjleog ESI-MS n. Endoxylanase fordøjet KOH-sol AXS var også præget af kernemagnetisk resonans (NMR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mærkning af den reducerende ende (RE) Sukker Rester af W-sol AXS med 2-aminobenzamid (2AB)
- Inkubér W-sol AXS med 2AB (0,2 M) i nærvær af 1 M NaBH3CN (natriumcyanoborhydrid) (pH 5,5) i 2 timer ved 65 ° C for at omdanne de reducerende ender af polysaccharid backbone kæder til deres fluorescerende derivater.
ADVARSEL: Følgende trin bør udføres i stinkskab som NaBH3CN frigiver giftige cyanid gas, når det er i kontakt med vand.- Afvej NaBH3CN (62,8 mg) og opløses i vand (1 ml) i et mikrocentrifugerør (1,5 ml) til fremstilling af en 1 M NaBH3CN opløsning. Opløs 2AB reagens (27,2 mg) i 1 M NaBH3CN opløsning (1 ml) ved opvarmning ved 65 ° C, og pH indstilles reaktionsblandingen (0,2 M 2AB, 1M NaBH3CN) til pH 5,5 med 10% eddikesyre.
- Tilsæt 200 pi reaktionsblanding (0,2 M 2AB, 1M NaBH3CN) til W-sol AXS (1 mg) i et glasrør med en hætte og bland ved hjælp af en vortex mixer. Inkuber i 2 timer ved 65 ° C i et stinkskab. Afkøl suspension til RT og tilføje 4 bind. absolut ethanol.
- Anbring suspension i en køle- (4 ° C) O / N til udfældning polysaccharider.
- Centrifuge (1500 x g, 10 min, RT) for at fjerne supernatanten. Vask pelleten grundigt med absolut ethanol (4x), acetone (1x) og methanol (1x), centrifugering mellem hver vask. Vakuum tør ved 40 ° CO / N.
Bemærk: Omfattende vask fjerner også resterende 2AB.
2. Frembringelse af xylo- oligosaccharider fra 2 AB Labelled W-sol AXS
- Opløs 2AB mærkede W-sol AXS (1 mg) i 500 pi natriumacetatpuffer (100 mM, pH 5) i et mikrocentrifugerør (1,5 ml). Tilføj 4 enheder endoxylanase (GH 11, [M1]) og inkuberes ved 37 ° C i 16 timer.
- Ødelægger enzymaktivitet ved opvarmning af reaktions- mixture i 10 minutter i et kogende vandbad. Afkøl suspension til RT og overførsel til glasrør med en hætte. Tilsættes 4 volumener. absolut ethanol og placere suspension i et køle- (4 ° C) O / N til udfaelde ufordøjede polysaccharider.
- Centrifuge (1500 x g, 10 min, RT) for at adskille ufordøjede polysaccharider (pellet) og endoxylanase genereret xylo- oligosaccharider (supernatant). Dekanter supernatanten til et rent reagensglas og placere den ind i et varmt vandbad (40 ° C).
- Inddamp ethanol under en strøm af nitrogengas til et endepunkt volumen (~ 500 pi). Frys supernatanten ved -80 ° C i 4 timer og tør den frosne supernatant i en frysetørrer for at inddrive xylo- oligosaccharider.
3. Frembringelse af xylo- oligosaccharider fra KOH-sol AXS og 2AB Mærkning
- Treat KOH-sol AXS med endoxylanase (GH 11, [M1]) til frembringelse xylo-oligosaccharider, som beskrevet ovenfor (afsnit 2.1-2.4).
- Forkæl endoxylanase genereret xylo-oligosaccharider fra KOH-sol AXS med 2AB reaktionsblanding (0,2 M 2AB, 1M NaBH3CN) som beskrevet ovenfor (afsnit 1.1.1-1.1.2).
- Dekanter supernatanten til et rent reagensglas og placere den ind i et varmt vandbad (40 ° C). Inddamp ethanol under en strøm af nitrogengas til et endepunkt volumen (~ 500 pi). Frys supernatanten ved -80 ° C i 4 timer og tør den frosne supernatant i en frysetørrer for at inddrive xylo- oligosaccharider.
4. MALDI-TOF-MS
- Fremstilling af MALDI-matrix Solution
- Tilføj en lille scoop af 2, 5-dihydroxbenzoic acid (DHB) til 50% acetonitril (500 ml) indeholdende 0,1% myresyre i et rør (MALDI-matrix-opløsning). Bland ved hjælp af en vortex, hvis det opløses hurtigt, tilføje en anden lille scoop af DHB. Bemærk: Ideel koncentration af MALDI-matrix løsning er 10 ug / pi -1.
- Udarbejdelse af MALDI-target Plate
- Depositum på aqueoos oligosaccharid (indfødte) prøver (5-10 ug) (W-sol og / eller KOH-sol) på et MALDI-måltavle. Tilføj 0,3 pi MALDI-matrix-opløsning under anvendelse af en separat spids og blandes ved pipettering op og ned. Lad blandingen tørre ved stuetemperatur.
Bemærk: Korrekt tørrede prøver bør bestå af lange nåleformede krystaller peger mod midten af pletten. Hvis depositum er klæbrig og / eller smeary prøven kan enten være for koncentreret eller består af salte, sådanne indskud er usandsynligt, at producere god spektre og prøven bør renses yderligere. - Indføre målet pladen ind i MS kilden og operere i positiv (+ ive) ion-mode. Juster accelerator spænding til 19,0 kV ved ionkilden 1 og 16,3 kV ved ionkilde 2. Juster lasereffekten til mere end 70%. Vælg stedet prøve på MALDI-måltavle og klik på Start for at begynde laser skud.
Bemærk: Alle områder af målet vil ikke give signaler. En særlig plet vil kun give et signal for et par laserskud enten på grundudtømning af prøven / matrix blanding eller karakteristika krystal.- Flyt laseren til forskellige områder af målet under erhvervelse og gennemsnit ca. 200 tilfældige spektre at opnå tilfredsstillende signal-til-støj.
- Depositum på aqueoos oligosaccharid (indfødte) prøver (5-10 ug) (W-sol og / eller KOH-sol) på et MALDI-måltavle. Tilføj 0,3 pi MALDI-matrix-opløsning under anvendelse af en separat spids og blandes ved pipettering op og ned. Lad blandingen tørre ved stuetemperatur.
5. ESI-QTOF-MS
- Analyser endoxylanase-genereret oligosaccharider (native) med nano-HPLC koblet med en elektrospray-ionisering (ESI) kvadrupol flyvetid (QTOF) MS instrument med online kromatografisk separation under anvendelse af en RP C-18-søjle (75 um x 150 mm; 3,5 um vulst størrelse).
- Overfør vandige oligosaccharider blandingen endoxylanase-genereret i et hætteglas og anbringes i HPLC-autosampler. Programmere elueringsgradient af 5-80% med de mobile faser 0,1% (v / v) myresyre i vand og 0,1% (v / v) myresyre i acetonitril, henholdsvis over 60 min.
- Hastigheden sættes til 0,2 pl / min. Juster positiv-ion-mode i scanningen områdeaf 300-1,600 m / z og en scanning-hastighed på 0,5 scanninger / sekund ved hjælp af ESI kilde betingelser som følger: gardin gas 10, GS1 4, kilde temperatur 100 ° C, ion spray spænding 2300 V, og de-klyngedannelse potentiale 50 V. Kør LC kromatografiske program og elueres oligosaccharider. Den resulterende samlede ionkromatogram (TIC) gemmes automatisk af softwaren.
- Åbn den gemte TIC og vælg ekstrakt kromatogram. Indtast de forventede masser (f.eks 271, 403, 535, 667, 799 og 931 m / z) på kommandolinjen. Scan kromatogram ved at klikke på Enter. Behandle de udvalgte ion scanninger af de ESI-QTOF MS chromatogramprofiler data ved hjælp af software i overensstemmelse med producentens anvisninger 14.
6. ESI-MS n
- Sæt 1 til 2 pi per-O-methyleret oligosaccharid (methyleret som beskrevet af Pettolino et al. 1) prøve i 50% acetonitril i en nanospray spids med en injektionssprøjte. Trimmenano-sprøjtespids anvendelse af en glas cutter til at passe ind i nano-spray holder diskrete knyttet til MS.
- Indstil i henhold med den forventede masseinterval (200-1.500 m / z) og gardin gas til 10, ionspray spændingen ved 1.900 V og polaritet til positiv.
- Tryk på knappen erhverve at åbne relevante vindue, indtaste data filnavn for at opnå en samlet ion-scanning (ESI-MS 1). Tryk derefter på knappen STOP.
- Skift scanningstype fra produkt ion at fragmentere et højdepunkt af interesse. Indtast massen af interesse (f.eks, 885 m / z) for at fragmentere og justere masseinterval (200-900 m / z). Tryk på knappen erhverve og justere kollisionen energi (op og / eller ned i fanen forbindelse) for at opnå hele fragmentering af forældre ion (885 m / z) og erhverve et fragment ion-scanning (ESI-MS 2).
- Indtast massen af fragment-ion af interesse (f.eks 711 m / z) og juster masseinterval (200-720 m / z). Tryk erhverve knap end Indstil kollisionsenergi at opnå hele fragmentering af precursor ion (711 m / z) og erhverve et fragment ion-scanning (ESI-MS 3).
7. H 1 NMR spektroskopi
- Opløs endoxylanase genereret blanding af oligosaccharider (KOH-sol, native form) (~ 500 ug) i D2O (1,0 ml, 99,9%) i en plastik reagensglas (15 ml). Frys suspensionen ved -80 ° C i 4 timer og tør den frosne suspension i en frysetørrer for at inddrive xylo- oligosaccharider.
- Gentag 7.1 to gange for fuldt ud at ombytte H2O med D 2 O.
- Opløs tørrede oligosaccharider i D2O (0,6 ml, 99,9%), og der tilsættes 0,5 pi acetone (5% i D2O) som en intern standard. Overfør deutererede oligosaccharider i NMR prøverøret.
- Hold NMR-rør indeholdende prøve ved toppen og indsætte prøveglas i en plastik spinner. Placer spinner i prøven dybdemåler. Push eller trække prøverøret at justere dybden af prøven for at sikre, at centerlinjen af prøven øverste og nederste dybdemålere er ens.
- Tag dybdestoppet og indsætte prøven i auto sampler fastgjort til en 600 MHz NMR-spektrometer udstyret med en kryo-probe.
- Login og åben spektrometer kontrol software. Indtast prøve fil. Åbn et eksisterende datasæt og derefter bruge "EDC" kommando til at gemme den på under et nyt navn. Indtast positionen antallet af prøven i auto sampler og tryk "ENTER".
Bemærk: Hvis du trykker på knappen "ENTER" vil falde prøverøret forsigtigt til magneten boring, hvor det vil blive placeret i toppen af sonden. - Indstil den ønskede prøve temperatur ved at skrive "edte" på kommandolinjen. Vent på, at prøvens temperatur til at nå den ønskede værdi, før du fortsætter til næste trin. Indtast "låse" på kommandolinjen og vælg passende opløsningsmiddel (D2O). Vent til & #34; lås færdig "meddelelse vises nederst i vinduet.
- Skriv "atmm" på kommandolinjen og klik på "optimere" øverst på atmm menulinjen. Vælg starte for tuning og matchning af sonden for den valgte kanal (1H i dette tilfælde).
- Skriv "topshim" på kommandolinjen for afstandsstykker proces, hvor mindre justeringer er lavet til det magnetiske felt, indtil ensartet magnetfelt opnås omkring sample.Acquire signalet ved at skrive "zg" på kommandolinjen og skrive.
- Analyser spektre ved brug af software 15 i overensstemmelse med producentens instruktioner med 1H kemiske skift refereres til en intern standard af acetone ved 2,225 ppm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endoxylanase fordøjelse af 2AB-mærket W-sol AXS genererer en blanding af 2AB-mærket RE oligosaccharider og en række un-mærket (uden 2AB label) oligosaccharider afledt af de interne regioner i xylan-kæden (figur 1; fra Ratnayake et al. 2). En serie af kromatografiske metoder anvendes derefter til at fraktionere den komplekse blanding af isomerer. Endelig er MS-teknikker anvendes til identifikation af de isomere strukturer, som derefter sekventeret ved MS n teknikker. Her præsenterer vi en repræsentant, snarere end omfattende, eksempel på fremgangsmåde.
Signalerne i MALDI-TOF-MS-spektrum af oligosaccharider afledt af 2AB-mærket nativt W-sol AXS (figur 2A) indbefatter en yderst rigelige pseudo-molekylion serie ved m / z 701, 833, og 965 repræsenterer en serie af umærket neutral internregion oligosaccharider med 5-7 pentosyl rester (P 5-7) henholdsvis. En række signaler ved m / z 745, 877, og 1009, udpege, at en umærket surt oligosaccharid serie, med P 4-6 + HexA 1 (Hexuronic acid), er også til stede i denne fraktion (figur 2A). Pseudo-molekylære ioner ved m / z 821 og 953 indikerer tilstedeværelsen af 2AB-mærkede original VE oligosaccharider P 5-6 + 2AB hhv.
ESI-QTOF-MS-analyse for de native oligosaccharider med en on-line kromatografisk fraktionering af oligosaccharider ved RP C-18-HPLC udføres derefter. Figur 2B og 2C viser de udvalgte ion scanninger, udvundet af ESI-QTOF-MS total ion kromatogrammet (TIC), af oligosaccharider frigivet af endoxylanase fra W-sol Fr AXS. Signalerne omfatter en pseudo-molekylion serie tildelt som [M + NH4] + ved m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, og 1356 repræsenterer en serie af indre område neutrale oligosaccharider med 5-10 pentosyl rester (P 5-10), henholdsvis (figur 2B). Adskillige isomere strukturer er mulige for et oligosaccharid af en defineret masse (se nedenfor ESI-MS n analyse). Dermed de mange toppe for hver af de molekylære ion scanninger er mulige som observeret i figur 2B. Pseudo-molekylære ioner tildelt som [M + H] + ved m / z 271, 403, 535, 667, 799, og 931 indikere tilstedeværelsen af en 2AB mærket RE oligosaccharid serie P 1-6 + 2AB, henholdsvis (figur 2C) . De detekterede som signaler [M + H] + ioner ved m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, og 1273 indikerer tilstedeværelsen af en sur oligosaccharider med P 3-8 + HexA 1, henholdsvis (figur 2C). I de commelenid enkimbladede kan xylan rygrad også være substitueret med phenoliske syrer,primært ferulasyre (og også s -coumaric syre), som har den samme molekylvægt som glucuronsyre og kan påvises i W-sol AXS over hvede endosperm cellevægge. Imidlertid er yderligere analyse af W- og KOH-sol AXS hjælp ESI-MS n (og analyser af sammensætning ved GC-MS af TMS-derivater efter methanolyse, ikke vist her) bekræfter de sure oligosaccharider med P 3-8 + HexA 1 i hvedeendosperm AXS.
Signalerne tildelt som [M + H] + ioner af ESI-Q-TOF fuld scanning spektrum af regionen mellem 3,10-3,48 min (figur 2D) indbefatter rækken af 2AB mærket RE oligosaccharider: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063 og 1195 (P 1-8 + 2AB, henholdsvis). En række pseudo-molekylære ioner i ESI-Q-TOF fuld scanning spektrum af området mellem 3,59-4,05 min (Figur 2E) repræsenterer interne region sure oligosaccharider observered som både [M + Na] + ioner: m / z 613, 745, 877, 1009, og 1141 (P 3-7 + HexA 1, henholdsvis) og [M + NH4] + ioner: m / z 740, 872, 1004 1136, og 1268 (P 4-8 + HexA 1, henholdsvis).
For at sekventere de enkelte oligosaccharider, udførte vi ESI-MS n fra pro-O-methylerede oligosaccharider snarere end på de native oligosaccharider opnået fra W-sol og KOH-sol AXS da det er udfordrende at utvetydigt tildele strukturer ved sekventering native oligosaccharider . Derudover kræver også større mængder materiale. Methylering af oligosaccharider blev udført som beskrevet af Pettolino et al. 1. ESI-MS n undersøgelser udført på VE neutral oligosaccharid alditoler afledt af KOH-sol AXS, og 2AB mærket neutral RE oligosaccharid afledt fra W-sol AXS beskrives below som et eksempel for at hjælpe med fortolkningen af spektrene og udledte strukturer. Den samme fremgangsmåde kan anvendes på alle de oligosaccharider genereret fra enzymatisk hydrolyse. Fragmentionerne i ESI-MS n spektre blev identificeret som Y og B-ioner ifølge Domon & Costello. 16 Un-methyleret hydroxylgruppe (r), der genereres ved gasfase-fragmentering af per-O-methyleret oligosaccharider i MS n tilvejebringer en 14Da masseforskel "ar", der kan anvendes til at identificere forgrening mønster og de glycosyl sekvenser. 12-13 Hver ar genereret af fragmentering begivenhed er markeret som en optrukken linje (figur 3 og 4). Da flere isomere strukturer er mulige for en defineret masse, så i disse isomere strukturer, Y og B-ioner er mærket med rødt og sort, henholdsvis.
ESI-MS 2, ESI-MS 3 og ESI-MS 4 SPECTra af per-O-methylerede RE neutral oligo-glycosyl alditol genereret fra fragmenteringen af pseudo-molekylære ion m / z 885 (P 4 + Xyl ol) er vist i figur 3. ESI-MS 2 spektrum omfatter de rigelige Y ioner ved m / z 711, 551, og 391, der genereres af tabet af en, to og tre pentosyl rester henholdsvis fra moderselskabet ion. Den rigelige m / z 711 ion kan dannes ved enten tabet af en ikke-reducerende terminale ende Xyl rest eller ved tabet af en terminal sidekæde Ara rest. Den diagnostiske Y m / z 391 ion i den resulterende spektrum kan genereres fra tabet af tre ikke-reducerende ende Xyl rester fra RE oligosaccharid, som har en sidekæde Ara rest på RE Xyl ol rest eller VE oligosaccharid, som har en sidekæde Ara rest på 2. Xyl rest fra RE Xyl ol rest. Selv om der er en formel mulighed for, at andre strukturer, såsomXyl 4 -Xyl ol, og (Ara) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ol ville give anledning til denne fragment ion disse strukturer er udelukket fra betragtning som specificiteten af endo-xylanase anvendt til spaltning polysaccharidet enten ville blive forringet eller undlade spalte ved glycosidbindingen støder op til en filial -point. Tilsvarende kan den diagnostiske Y m / z 551 ion blive genereret fra tabet af to ikke-reducerende ende Xyl rester fra RE oligosaccharid, som har sidekæden Ara rest på enten RE Xyl ol rest eller VE oligosaccharid, som har den side kæde Ara rest på næstsidste Xyl rest. Således kan der foreslås fire mulige isomere strukturer (Figur 3: I, II, III og IV). Den rigelige Y ion m / z 377 (se figur 3: Ia og IIa) og B-ion m / z 503 (se figur 3: Ia, Ib, IVa og IVb) dannet fra yderligere fragmentering af isomere precursor m/ z 711-ion er også observeret i dette spektrum. ESI-MS 3-spektrum (figur 3) registreres af opsplitningen af isomere precursor m / z 711 ioner omfattede en større top ved m / z 537 (Y ion P 2 + Xyl ol med to ar, dannet fra prækursor-ion Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa og IVb) og m / z 391 (Y ion af P 1 + Xyl ol med en ar, der genereres fra forstadiet ion IIb, IIIa, IIIb, IVa og IVb). Disse to store toppe (m / z 537 og m / z 391) kan genereres ved tabet af et og to ikke-reducerende terminal Xyl rester henholdsvis fra den isomere forløber m / z 711 ion genereret fra fragmenteringen af pseudo -molecular moderion m / z 885 (P4 + Xyl ol) under ESI-MS 2. Relativt lavere overflod toppe ved m / z 377 (Y ion af P 1 + Xyl ol med to ar, genereret fra precursoR ion Ia og IIa) og 551 (Y ion P 2 + Xyl ol med én ar, dannet fra prækursor-ion Ib og IIb) blev også observeret i dette spektrum.
ESI-MS 4 af fragmenteringen af den isomere forløber m / z 551 ioner omfattede en større top ved m / z 377 (Y ion af P 1 + Xyl ol med to ar) og m / z 391 (Y ion af P 1 + Xyl ol med én ar), der genereres fra prækursor-ion af strukturer i og II. Foreslog derfor den kollektive beviser for, at VE-glycosyl sekvens består af Ara sidekæde knyttet til RE Xyl ol rest (diagnostisk fragmentering vej m / z 885 → 711 → 551 → 391, figur 3II), Ara sidekæde knyttet til begge RE Xyl ol og den næstsidste (1. Xyl rest fra RE Xyl ol) Xyl rest (diagnostisk fragmentering vej m / z 885 → 711 → 537 → 391, figur 3III), Ara sidekæde knyttet til den næstsidste (1. Xyl fra RE Xyl ol) Xyl rest (diagnostisk fragmentering vej m / z 885 → 711 → 537 → 377, figur 3I) og Ara-sidekæde fastgjort på 2. Xyl rest fra RE Xyl ol (Figur 3iV).
Tilstedeværelsen af disse ioner bekræfter de foreslåede isomere strukturer I, II, III og IV og den neutrale RE oligosaccharid struktur: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl s.
ESI-MS 2 spektrum af per-O-methyleret 2AB mærket RE oligosaccharid dannet fra Fragmtation af den kvasi-molekylære [M + Na] + ved m / z 871 (P4 + 2AB) er vist i figur 4. Dette spektrum indeholder den mest rigelige Y ion ved m / z 697 (P 3 + 2AB med én ar), m / z 537 (P 2 + 2AB med ét ar) og m / z 377 (P 1 + 2AB med et ar), der genereres af tabet af enten en, to eller tre ikke-reducerende pentosyl rester hhv. M / z 697 ion kan dannes ved enten tabet af en ikke-reducerende terminale ende Xyl rest eller ved tabet af en terminal Ara rest hvorimod m / z 537 ion kan kun frembringes ved tabet af to terminale Xyl rester . Den diagnostiske fragmentering pathway (m / z 871 → 697 → 537 → 377) foreslog, at eksistensen af lineære un-forgrenede xylan backbone oligosaccharid (erne) ved RE svarende til den kvasi-molekylion m / z 871 (P4 + 2AB ). Men den lineære un-forgrenede xylosyl rygrad (P 4 + 2AB) er susceptible til stedsspecifik endoxylanase for yderligere fordøjelse. Derfor kan to isomere m / z 697 ioner eksisterer. Derfor foreslås to mulige isomere strukturer (Figur 4: I og II). I disse isomere strukturer Y og B-ioner er mærket med rødt og sort, henholdsvis. ESI-MS 3 spektrum optaget fra fragmentering af isomere forløber m / z 697 ion genererer m / z 523-ion (Y ion af P 2 + 2AB med to ar; Figur 4, strukturer Ia, Ib, IIa og IIb), m / z 363 ion (Y ion af P 1 + 2AB med to ar, figur 4, struktur IIa), og Y ion ved m / z 377 (P 1 + 2AB med én ar, figur 4, strukturer la og Ib). Fragmentet ion ved m / z 377 kan kun opstå ved den foreslåede struktur I og fragmentet ion ved m / z 363 kan kun opstå ved den foreslåede struktur II. Den samtidige tilstedeværelse af disse to ioner bekræfter de foreslåede strukturer I og II. Således VE glycosyl sekvens af xylan kæde af hvedeendosperm AXS består af en Ara gren fastgjort til RE-Xyl rest (fragmentering pathway m / z 871 → 697 → 523 → 363) og / eller næstsidste Xyl rest (fragmentering pathway m / z 871 → 697 → 523 → 377).
NMR-analyse af AXS
MS-baserede analyser giver ikke oplysninger om enten anomere konfiguration (α / β) eller D / L-konfiguration af det sukker, der skal opnås ved andre tilgange, herunder enzymatiske og fysisk (fx NMR). For heteroxylans med den karakteristiske RE reduceret tetrasaccharid (Xyl-Rha-gala-Xyl ol), indeholder NMR-spektret anomere signaler, der fører til identifikation og sekventering af denne VE oligosaccharid. Vi beskriver anvendelsen af 600 MHz 1D 1H-NMR-spektroskopi som en enkelt trins metode til DetHermelin den komplette glycosyl sekvens af hvede endosperm AX RE oligosaccharid på KOH-sol Fr, herunder det anomere konfiguration (α / β), og D / L-konfiguration af sukkerstofferne. Resonanser blev tildelt på grundlag af offentliggjorte opgaver af hvede AX oligosaccharider 17-18 (figur 5, tabel 1). 1H-NMR-spektret af AX ekstraheret fra hvedeendosperm domineres af de anomere kemiske skift ved 5,39, 5,27 og 5,22 ppm, som er tildelt til protonen af en terminal α-L-Ara f rest bundet til O-3 positionen (T-α-L-Ara f → 3 S) af de enkeltvis forgrenede (1,4) -β-Xyl p backbone-rester, og både O-3 og O-2 positioner (T-α-L-Ara f → 3 D og T-α-L-Ara f → 2 D) dobbeltdestilleret forgrenet (1,4) -β-Xyl p backbone rester, henholdsvis (figur 5 og tabel 1).
f → 3 S + D) H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-3 positionen af enkeltvis forgrenede β-D-Xyl p resten med tilstødende dobbelt forgrenet β-D-Xyl s. Signalet ved 5,29 er tildelt den (T-α-L-Ara f → 3 D + D) H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-3-stillingen i den dobbelt forgrenede β-D-Xyl p resten med tilstødende dobbelt forgrenet β-D-Xyl s. signalet ved 5,24 er tildelt til den (T-α-L-Ara f → 2 D + D) H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-2-positionen i den dobbelt forgrenede β-D-Xyl p resten med tilstødende dobbelt forgrenet β-D-Xyl s.
Figur 2. MALDI-TOF MS (A) og ESI-QTOF MS (B - E) analyse af native oligosaccharider frigøres ved endoxylanase fra 2AB mærkede W-sol AXS som skitseret i figur 1. MALDI-TOF MS-spektrum: (A) ( signalerne a re identificeret som [M + Na] + addukt-ioner); Udvalgte ion scanninger af ESI-MS QTOF kromatogrammer: B = P 5-10 afledt af indre region oligosaccharider (Signalerne identificeret som [M + NH4] + addukt-ioner) C = P 1-6 + 2AB afledt fra RE oligosaccharider (signalerne identificeret som [M + H] + addukt-ioner) & P 3-8 G afledt af sure oligosaccharider (signalerne identificeret som [M + Na] + addukt-ioner); D = ESI-Q-TOF fuld scan spektrum: regionen mellem 3,10-3,48 min, E = ESI-Q-TOF komplet scanning spektrum: regionen mellem 3,59-4,05 min (signalerne identificeret som både [M + Na] + og [M + NH4] + addukt-ioner ); P = pentosyl enhed (enten Ara eller Xyl); G = uronosyl rest (GlcA); RE = reducerende ende oligosaccharider; 2AB = 2 aminobenzamid; EIC: udvundet ion kromatogram. annonce / 53.748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. ESI-MS 2, ESI-MS 3 og ESI-MS 4 spektre af per-O-methyleret RE neutral glycosyl alditol (P 4 + Xyl ol) - m / z 885. Signalerne tilknyttet som [M + Na] + pseudo-molekylære ion addukter. Da flere isomere strukturer for en defineret masse er mulig, i isomere strukturer Y og B-ioner er mærket med rødt og sort, henholdsvis. Hver "ar" genereret af fragmentering begivenheden er markeret som en fast linje. X = xylosyl rest; A = arabinosyl rest. ESI-MS 3 spektre er gengivet med tilladelse fra Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. ESI-MS 2 og ESI-MS 3 spektre af per-O-methylerede 2AB mærkede neutrale RE oligosaccharid (P 4 + 2AB) - m / z 871. Signalerne tilknyttet som [M + Na] + pseudo -molecular ion addukter. Da flere isomere strukturer for en defineret masse er mulige i isomere strukturer, er Y og B-ioner mærket med rødt og sort hhv. Hver "ar" genereret af fragmentering begivenheden er markeret som en fast linje. X = xylosyl rest; A = arabinosyl rest. Dette tal er gengivet med tilladelse fra Ratnayake et al. (2014) 2. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 5. anomere region af 600 MHz 1D 1H-NMR-spektret af AX oligosaccharider frembragt af endoxylanase behandling af KOH- Sol Fr. 1H kemiske skift refereres til en intern standard af acetone ved 2,225 ppm. T-α-L-Ara f → 3 S: H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-3 positionen af enkeltvis forgrenede β-D-Xyl p-rest; T-α-L-Ara f → 2 D: H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-2-positionen i den dobbelt forgrenede β-D-Xyl p-rest; T-α-L-Ara f → 3 D: H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-3-stillingen i den dobbelt forgrenede β-D-Xyl p-rest; T-α-L-Ara f → 3 S + D: H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-3 positionen af enkeltvis forgrenede β-D-Xyl p rest med tilstødende dobbelt forgrenet β-D- Xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-2-positionen i den dobbelt forgrenede β-D-Xyl p rest med tilstødende dobbelt forgrenet β-D -Xyl p; T-α-L-Ara f → 3 D + D: H1 signal af α-L-Ara f sidekæde bundet til O-3-stillingen i den dobbelt forgrenede β-D-Xyl p rest med tilstødende dobbelt forgrenet β-D -Xyl p; 2-α-L-Ara f → 3 S: H1 signal af 2-α-L-Ara f sidekæde rest knyttet til O-3 positionen af enkeltvis forgrenede β-D-Xyl p rest; Klik her for at seen større version af denne figur.
| sukkerrester | H-1 / C-1 | H-2 / C-2 | H-3 / C-3 | H-4 / C-4 | H-5 ækv / C-5 | H-5 ax / C-5 |
| T-α-L-Araf → 3 S | 5,396 / 107,6 | 4.16 | 3,95 | 4.3 | 3,82 | 3,72 |
| T-α-L-Araf | 5,415 / | 4.18 | 3,95 | |||
| → 3 S + D | ||||||
| T-α-L-Araf → 2 D | 5,223 / | 4.16 | 3,97 | 3,82 | 3,74 | |
| T-α-L-Araf → 2 D + D | 5,243 / | 4.16 | 3,98 | |||
| T-α-L-Araf → 3 D | 5,272 / 108,9 | 4.18 | 3,96 | 4,26 | 3,79 | 3,74 |
| T-α-L-Araf → 3 D + D | 5,298 / | 4.18 | 3,96 | |||
| 2-α-L-Araf → 3 S | 5,548 / 106,4 | 4,27 | 4,06 | 4.3 | 3,82 | |
| a-Xylp (Reduktion) | 5,185 / 91,9 | 3,55 | 3,72 | |||
| P-Xylp (Reduktion) | 4,580 / 96,6 | 3,29 | 3,48 | 3,64 | 4,06 | 3.38 |
| β-4-Xylp | 4.470 / | 3,32 | 3.58 | |||
| P -4-Xylp + S | 4,461 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3.36 |
| β-4-Xylp + D | 4,448 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3.36 |
| P-3,4-Xylp | 4,518 / | 3,44 | 3,85 | |||
| S + β-3,4-Xylp | 4,514 / | 3,47 | 3,75 | 3,86 | 4.14 | 3.43 |
| D + β-3,4-Xylp | 4,505 | |||||
| P-3,4-Xylp + S | 4,492 | 3,45 | 3,74 | |||
| β-3,4-Xylp + D | 4,482 | 3,45 | 3,74 | |||
| P-2,3,4-Xylp | 4,638 | |||||
| S + β-2,3,4-Xylp | 4,627 | 3,59 | 3,87 | 3,88 | ||
| D + β-2,3,4-Xylp | 4,616 | |||||
| P-2,3,4-Xylp + S | 4,593 | |||||
| β-2,3,4-Xylp + D | 4,593 | |||||
| Kemiske skift er rapporteret i forhold til intern acetone, A 2,225. | ||||||
| S = Enkeltsubstituerede forgrenet β-Xylp | ||||||
| S + D = Enkeltvis forgrenet β-Xylp + Dobbelt forgrenede β-Xylp | ||||||
| D = Dobbelt forgrenede β-Xylp | ||||||
| D + D = Dobbelt forgrenede β-Xylp + Dobbelt forgrenede β-Xylp | ||||||
Tabel 1. 1H-NMR-signaler af xylo-oligosaccharider frembragt af endoxylanase behandling af hvede endosperm KOH-sol Fr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste matrixfase cellevæg polysaccharider har tilsyneladende tilfældigt substitueret skeletter (med både glycosyl og ikke-glycosylrester), der er meget varierende afhængigt af plantearter, udviklingsstadiet og vævstype 3. Da polysaccharider er sekundære genprodukter deres sekvens ikke er skabelon udledes, og der er derfor ingen enkelt analytisk tilgang, som findes for nukleinsyrer og proteiner, for deres sekventering. Tilgængeligheden af oprensede linkage-specifik hydrolytiske enzymer har tilvejebragt et effektivt værktøj til at nedbryde polysaccharider til oligosaccharider, der dernæst kan kromatografisk fraktioneret, og når de anvendes i kombination med kemiske og fysiske teknikker fuldstændigt sekventeret. Udfordringen er at derefter igen samle disse komplekse blandinger i den oprindelige polysaccharid sekvens- en, der er stadig at være held behandlet.
Her beskriver vi en tilgang (hvis rækkefølge ansøgning can varieres), der bygger på integration af etablerede enzymatiske, kemiske og fysiske teknikker til strukturelle karakterisering af både den reducerende ende (RE) og intern region glycosyl sekvens (er) af heteroxylans. En yderligere supplerende teknik ikke er beskrevet her, som har vist sig meget nyttig til karakterisering oligosaccharider er PACE (polysaccharid analyse af kulhydrat gelelektroforese) udviklet af Dupree 19-gruppen, og det kunne nemt integreres i denne protokol, hvis udstyret er til rådighed. Endvidere kan variationer på LC kromatografi også være anvendelige, såsom tandem inline hydrofil interaktion kromatografi (HILIC) efterfulgt af RP-chromatografi giver muligheden for at adskille både umærket / tagged oligosaccharider i et enkelt trin. Teknikkerne afhængige tagging (med 2 aminobenzamid (2AB)) den reducerende ende (RE) af heteroxylan kæden før enzymatisk (endoxylanase) hydrolyse. To forskellige tilgange (se oversigt iFigur 1) er vedtaget. I den første, er intakte W-sol AXS behandlet med 2AB at tagge den oprindelige RE hovedkæden sukkerrest og behandles derefter med et endoxylanase at generere en blanding af 2AB-mærket RE og indre region reducerende oligosaccharider, hhv. I en anden fremgangsmåde KOH-sol Fr hydrolyseres med endoxylanase først generere en blanding af oligosaccharider, som efterfølgende mærket med 2AB. I sidstnævnte scenario den oprindelige RE af KOH-sol AX ikke ville være mærket med 2AB da det var blevet reduceret til glycosyl-alditol under alkaliske ekstraktion, der indeholdt reduktionsmiddel, natriumborhydrid (NaBH4). Derfor genereret 2AB-mærkede oligosaccharider post-xylanase fordøjelse, vil stamme fra "interne" oligosaccharider og den oprindelige RE oligosaccharid vil indeholde en RE alditol uden 2AB tag (se figur 1). Denne fremgangsmåde kan også anvendes på andre klasser af polysaccharider usynge (hvor det er muligt) de relevante endo-hydrolaser.
MS tilgang er signifikant forøget ved methylering af oligosacchariderne genereret efter endoxylanase behandling, da den ikke-methylerede hydroxylgruppe (r), der genereres ved gasfase-fragmentering af per-O-methyleret oligosaccharider i MS n tilvejebringer en 14Da masseforskel "ar ", der kan anvendes til at bidrage til identifikationen af forgrening mønster og glycosyl-sekvensen. 5-6 identiteten af pentosyl rester (og eventuelle sukkerrest) ikke kan fremstilles af de MS-data alene, men kommer af at have kendskab til sammensætning af molekylet; hvor dette ikke er tilgængelig så de relevante monosaccharid- og sammenkædning analyser skal udføres inden du gør disse opgaver i MS n. Endvidere er signaler svarende til RE-sure oligosaccharid alditol, genereret fra KOH-sol Fr (Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) og lmaracteristic tokimbladet xylan RE glycosyl sekvens (Xyl 2 -Rha-Gala-Xylitol: m / z 761), hvis tilstede, ikke er i stand at skelne som begge har den samme molekylære masse i native form, men kan skelnes fra deres MS fragmentering ( MS n) spektre, som er bedst udført på de methylerede oligosaccharider. Endelig MS-baserede teknikker er i stand til at give oplysninger om enten anomere konfiguration (α / β) af glycosidbindingen eller D / L-konfiguration af sugars- dette skal bestemmes ved alternative metoder, herunder enzymatiske og fysisk (f.eks NMR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
- Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
