Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات

doi: 10.3791/53748 Published: March 24, 2016

Abstract

يصف هذا البروتوكول تقنيات محددة تستخدم لتوصيف الحد نهاية (RE) وتسلسل غليكوزيل المنطقة الداخلية (ق) من heteroxylans. تم عزل دي منشى-جدران الخلايا السويداء القمح باعتباره بقايا الكحول غير قابلة للذوبان (AIR) (1) وبالتتابع استخراج مع الماء (W-سول الاب) و 1 M KOH تحتوي على 1٪ NaBH 4 (كوه-سول الأب) كما وصفها راتناياك وآخرون آل (2014) (2). واعتمد نهجين مختلفين (انظر ملخص في الشكل 1). في المرحلة الأولى، يتم التعامل AXS سليمة W-سول مع 2AB لوضع علامة الأصلي RE العمود الفقري بقايا سلسلة السكر وبعد ذلك تعامل مع endoxylanase لتوليد مزيج من RE-وصفت 2AB والمنطقة الداخلية والحد يغوساكاريدس، على التوالي. في النهج الثاني، وتحلل من الأب كوه-سول مع endoxylanase لتوليد أول خليط من يغوساكاريدس التي وصفت في وقت لاحق مع 2AB. صدر enzymically ((الامم المتحدة) الموسومة ب) يغوساكاريدس من كلاW- وFRS كوه-سول هي ثم مميثل والتحليل الهيكلي التفصيلي لكل من يغوساكاريدس الأم ومميثل يتم تنفيذ ذلك باستخدام مزيج من MALDI-TOF-MS، RP-HPLC-ESI-QTOF-MS وESI-MS ن. هضمها Endoxylanase تتميز كوه-سول AXS أيضا الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي) الذي يقدم أيضا معلومات عن التكوين المصاوغ الكربونيلي. ويمكن تطبيق هذه التقنيات إلى فئات أخرى من السكريات باستخدام إندو-هيدروليز المناسبة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heteroxylans أسرة مكونة من السكريات التي هي الغالبة السكريات غير السليلوزية من الجدران الأساسية من الأعشاب والجدران الثانوية من جميع كاسيات البذور 3-6. العمود الفقرى الزيلان تختلف في أنواعها وأنماط الاستبدال مع غليكوزيل (حمض الغلوكورونيك (GlcA)، أرابينوز (عارف)) وغير غليكوزيل (O-أسيتيل، وحمض الفيرليك) بقايا اعتمادا على نوع الأنسجة، ومرحلة التطوير والأنواع 7.

جدران من القمح وتتكون (الحنطة ايستيفوم L.) السويداء في المقام الأول من arabinoxylans (AXS) (70٪) و (1 → 3) (1 → 4) -β جلوكان-D (20٪) مع كميات ضئيلة من السليلوز وheteromannans (2٪ لكل منهما) 8. قد يكون العمود الفقري الزيلان الامم المتحدة واستبداله بأشكال مختلفة وفي الغالب (في المقام الأول O-2 موقف وإلى حد أقل O-3 موقف) استبدال أحادي و (O-2 و O-3 وظائف) مع α-L-آرا استبداله دى المخلفات و 9. نهاية الحد (RE) من مغايرxylans من dicots (على سبيل المثال، نبات الأرابيدوبسيس thaliana) 10 وعاريات البذور (على سبيل المثال، شجرة التنوب (ABIES Picea)) 11 يحتوي على سمة تسلسل رباعي السكاريد غليكوزيل. -β-D-XYL ص - (1 → 3) -α-L-رحه ع - (1 → 2) -α-D-غال ص A- (1 → 4) -D-XYL ص. لفهم الحيوي heteroxylan وظيفة (البيولوجية والصناعية)، فمن المهم أن تسلسل كامل العمود الفقري الزيلان لفهم أنواع وأنماط من التبديلات فضلا عن سلسلة من نهاية الحد (RE).

ووصف تقنيات محددة تستخدم لتوصيف هيكلي للحد من نهاية (RE) وتسلسل غليكوزيل المنطقة الداخلية (ق) من heteroxylans في هذه المخطوطة. تقنيات تعتمد على fluorophore علامات (مع 2 aminobenzamide (2AB)) والحد من نهاية (RE) من سلسلة heteroxylan قبل الأنزيمية (endoxylanase) التحلل. هذا النهج، لا سيما بالنسبة للتسلسل RE، كانلاول مرة من قبل المختبر نيويورك 10،12-13 لكن الآن امتد ليشمل المنطقة التسلسل الداخلي وهو مزيج من التقنيات الراسخة التي هي قابلة للتكيف بشكل متساو على جميع heteroxylans مستقلة عن مصدرها من العزلة. ويمكن أيضا أن هذا النهج يتم تطبيقها على فئات أخرى من السكريات باستخدام (إن وجدت) وإندو-هيدروليز المناسبة.

في هذه الدراسة، تم عزل جدران الخلايا السويداء القمح منشى دي باعتبارها بقايا الكحول غير قابلة للذوبان (AIR) وبالتتابع استخراج مع الماء (W-سول الاب) و1M KOH تحتوي على 1٪ NaBH 4 (كوه-سول الأب) كما هو موضح في راتناياك وآخرون (2014) (2). ويغوساكاريدس صدر من كلا W- وFRS كوه-SOL ثم يتم مميثل والتحليل الهيكلي التفصيلي لكل من يغوساكاريدس الأم ومميثل يتم تنفيذ ذلك باستخدام مزيج من MALDI-TOF-MS، ESI-QTOF-MS إلى جانب مع HPLC مع الفصل الكروماتوغرافي الانترنت باستخدام RP العمود C-18وESI-MS ن. هضمها Endoxylanase كان كوه-سول AXS تتميز أيضا الرنين المغناطيسي النووي (NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. وضع البطاقات التعريفية على نهاية الحد (RE) السكر بقايا من W-سول AXS مع 2-aminobenzamide (2AB)

  1. احتضان W-سول AXS مع 2AB (0.2 م) في وجود من 1 M NaBH 3 CN (سيان بورهيدريد الصوديوم) (الرقم الهيدروجيني 5.5) لمدة 2 ساعة على 65 درجة مئوية لتحويل نهايات الحد من السلاسل السكاريد العمود الفقري لمشتقات الفلورسنت الخاصة بهم.
    تنبيه: يجب أن يتم تنفيذ الخطوة التالية في غطاء الدخان كما يطلق NaBH 3 CN غاز السيانيد السام عندما يكون في اتصال مع الماء.
    1. تزن خارج NaBH 3 CN (62.8 ملغ) وتذوب في الماء (1 مل) في أنبوب microcentrifuge (1.5 مل) لإعداد حل M NaBH 3 CN 1. حل كاشف 2AB (27.2 ملغ) في 1 الحل M NaBH 3 CN (1 مل) عن طريق التسخين في 65   درجة مئوية، وضبط درجة الحموضة من خليط التفاعل (0.2 M 2AB، 1 م NaBH 3 CN) لدرجة الحموضة 5.5 مع حمض الخليك 10٪.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من خليط التفاعل (0.2 M 2AB، 1 م NaBH 3 CN) إلى W-حتىAXS ل (1 ملغ) في أنبوب زجاجي مع غطاء وتخلط باستخدام خلاط دوامة. احتضان لمدة 2 ساعة على 65   ° C في غطاء الدخان. تبريد تعليق على RT وإضافة 4 مجلدات. من الايثانول المطلق.
    3. ضع تعليق في التخزين البارد (4 درجة مئوية) O / N لترسيب السكريات.
    4. أجهزة الطرد المركزي (1500 x ج، 10 دقيقة، RT) لإزالة طاف. يغسل بيليه على نطاق واسع مع الايثانول المطلق (4X)، والأسيتون (1X) والميثانول (1X)، الطرد المركزي بين كل غسل. الجاف فراغ عند 40 درجة CO / N.
      ملاحظة: غسل اسعة يزيل أيضا 2AB المتبقية.

2. توليد XYLO-يغوساكاريدس من 2 AB صفتها W-سول AXS

  1. حل 2AB المسمى W-سول AXS (1 ملغ) في 500 ميكرولتر من العازلة خلات الصوديوم (100 ملم، ودرجة الحموضة 5) في أنبوب microcentrifuge (1.5 مل). إضافة 4 وحدات من endoxylanase (GH 11، [M1])، واحتضان في 37   ° مئوية لمدة 16 ساعة.
  2. تدمير نشاط انزيم عن طريق تسخين MIXT رد فعللدى عودتهم لمدة 10 دقيقة في حمام ماء يغلي. تبريد تعليق على RT ونقل إلى أنبوب زجاجي مع غطاء. إضافة 4 مجلدات. من الايثانول المطلق ووضع تعليق في التخزين البارد (4 درجة مئوية) O / N لترسيب أي السكريات غير المهضومة.
  3. أجهزة الطرد المركزي (1500 x ج، 10 دقيقة، RT) لفصل السكريات غير المهضومة (بيليه) وendoxylanase إنشاء XYLO-يغوساكاريدس (طاف). صب طاف في أنبوب زجاجي نظيف ووضعه في حمام ماء دافئ (40 درجة مئوية).
  4. يتبخر الإيثانول تحت تيار من غاز النيتروجين إلى وحدة تخزين نقطة النهاية (~ 500 ميكرولتر). تجميد طاف في -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات وتجفيف طاف المجمدة في مجفف تجميد لاسترداد XYLO-يغوساكاريدس.

3. الجيل من XYLO-يغوساكاريدس من KOH-سول AXS ووسمها 2AB

  1. علاج كوه-سول AXS مع endoxylanase (GH 11، [M1]) لتوليد XYLO-يغوساكاريدس كما هو موضح أعلاه (الأقسام 2،1-2،4).
  2. علاج endoxولدت ylanase XYLO-يغوساكاريدس من KOH-سول AXS مع خليط التفاعل 2AB (0.2 M 2AB، 1 م NaBH 3 CN) كما هو موضح أعلاه (الأقسام 1.1.1-1.1.2).
  3. صب طاف في أنبوب زجاجي نظيف ووضعه في حمام ماء دافئ (40 درجة مئوية). يتبخر الإيثانول تحت تيار من غاز النيتروجين إلى وحدة تخزين نقطة النهاية (~ 500 ميكرولتر). تجميد طاف في -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات وتجفيف طاف المجمدة في مجفف تجميد لاسترداد XYLO-يغوساكاريدس.

4. MALDI-TOF-MS

  1. إعداد MALDI مصفوفة الحل
    1. إضافة مغرفة صغيرة من 2، وحمض 5-dihydroxbenzoic (DHB) إلى 50٪ الأسيتونتريل (500 مل) تحتوي على حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في أنبوب (حل MALDI مصفوفة). مزيج باستخدام الدوامة، إذا كان يذوب بسرعة، إضافة مغرفة صغيرة أخرى من المجالس الصحية المحلية. ملاحظة: التركيز المثالي من حل MALDI مصفوفة هو 10 ميكروغرام / ميكرولتر -1.
  2. إعداد لوحة MALDI المستهدفة
    1. إيداع aqueoلنا قليل السكاريد عينات (الأم) (5-10 ميكروغرام) (W-سول و / أو KOH-سول) على طبق من ذهب MALDI المستهدفة. إضافة 0.3 ميكرولتر حل MALDI مصفوفة باستخدام طرف مستقل ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. السماح للخليط لتجف في RT.
      ملاحظة: يجب أن تتألف العينات المجففة بشكل صحيح من بلورات على شكل إبرة طويلة لافتا نحو وسط بقعة. إذا كانت ودائع غير لزجة و / أو ملطخ العينة قد إما أن تتركز جدا أو تتكون من أملاح، هي تلك الودائع غير المرجح أن تنتج أطياف جيد وينبغي أيضا طهروا العينة.
    2. تقديم لوحة الهدف في مصدر MS وتعمل في (+ إيف) وضع إيجابي أيون. ضبط الجهد مسرع إلى 19.0 كيلو فولت في مصدر أيون 1 و 16.3 كيلو فولت في مصدر أيون 2. ضبط قوة الليزر إلى أكثر من 70٪. حدد بقعة العينة على لوحة MALDI-الهدف وانقر فوق ابدأ لبدء طلقات الليزر.
      ملاحظة: جميع مناطق المستهدفة لم تسفر الإشارات. وهناك نقطة محددة تعطي سوى إشارة لبضع طلقات الليزر إما بسبباستنزاف العينة / خليط مصفوفة أو خصائص وضوح الشمس.
      1. نقل الليزر لمناطق مختلفة من هدف خلال اقتناء والمتوسط ​​ما يقرب من 200 أطياف عشوائي للحصول مرضية إشارة إلى الضجيج.

5. ESI-QTOF-MS

  1. تحليل يغوساكاريدس ولدت endoxylanase (اللغة الأم) باستخدام نانو HPLC مقرونا تأين بالإرذاذ الإلكتروني (ESI) وقت رباعي الرحلة (QTOF) MS أداة مع الفصل الكروماتوغرافي الانترنت باستخدام RP العمود C-18 (75 ميكرون س 150 مم؛ 3.5 ميكرون حبة حجم).
    1. نقل ولدت endoxylanase يغوساكاريدس المائية الخليط في قنينة ووضعه في العينات السيارات HPLC. برنامج التدرج شطف من 5-80٪ مع المراحل المتنقلة 0.1٪ (ت / ت) وحامض الفورميك في الماء و 0.1٪ (ت / ت) وحامض الفورميك في أسيتونتريل، على التوالي، أكثر من 60 دقيقة.
    2. ضبط معدل تدفق إلى 0.2 ميكرولتر / دقيقة. ضبط الوضع الإيجابي أيون في نطاق المسح الضوئيمن 300-1،600 م / ض ومعدل المسح من 0.5 بالاشعة / ثانية مستغلا ظروف مصدر ESI على النحو التالي: ستارة الغاز 10، GS1 4، ودرجة الحرارة مصدر 100 درجة مئوية، أيون رذاذ الجهد 2300 V، وإزالة تجميع المحتملين 50 خامسا تشغيل برنامج LC الكروماتوغرافي ويغوساكاريدس أزل. يتم حفظ مجموع اللوني ايون الناتج (TIC) تلقائيا من قبل البرنامج.
    3. فتح TIC حفظ واختر استخراج اللوني. اكتب الجماهير المتوقع (على سبيل المثال، 271، 403، 535، 667، 799 و 931 م / ض) في سطر الأوامر. اللوني الضوئي عن طريق النقر أدخل. معالجة بالاشعة أيون مختارة من البيانات اللوني ESI-MS QTOF باستخدام البرمجيات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 14.

6. ESI-MS ن

  1. إدراج 1-2 ميكرولتر من لكل-O الميثيلي قليل السكاريد (ميثليته كما وصفها Pettolino آخرون 1) عينة في 50٪ الأسيتونتريل إلى طرف nanospray باستخدام حقنة. تقليمغيض نانو رذاذ استخدام قطع الزجاج لتنسجم مع حامل نانو رذاذ منفصلة تعلق على MS.
  2. تعيين كتلة وفقا لمجموعة من المتوقع الشامل (200-1،500 م / ض) والغاز الستار إلى 10، والجهد ionspray في 1900 V والاستقطاب إلى إيجابية.
  3. اضغط على زر اكتساب لفتح نافذة ذات الصلة، أدخل اسم ملف البيانات للحصول على مسح أيون الإجمالي (ESI-MS 1). ثم تضغط على زر التوقف.
  4. تغيير نوع المسح من ايون المنتج لتفتيت ذروة الفائدة. أدخل كتلة الفائدة (على سبيل المثال، 885 م / ض) لتفتيت وضبط مجموعة كتلة (200-900 م / ض). اضغط على زر اكتساب وضبط الطاقة الاصطدام (صعودا و/ أو لأسفل في علامة التبويب مركب) لتحقيق تفتيت كامل أيون الأم (885 م / ض) والحصول على مسح جزء أيون (ESI-MS 2).
  5. أدخل كتلة أيون جزء من الفائدة (على سبيل المثال، 711 م / ض) وضبط مجموعة كتلة (200-720 م / ض). اضغط على زر اكتسابد ضبط الطاقة تصادم تحقيق تفتيت كامل أيون السلائف (711 م / ض) والحصول على مسح جزء أيون (ESI-MS 3).

7. H 1 NMR الطيفي

  1. حل endoxylanase لدت خليط من يغوساكاريدس (كوه-سول، شكل الأصلي) (~ 500 ميكروغرام) في D 2 O (1.0 مل، 99.9٪) في أنبوب اختبار البلاستيك (15 مل). تجميد تعليق في -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات وتجفيف تعليق المجمدة في مجفف تجميد لاسترداد XYLO-يغوساكاريدس.
  2. كرر 7.1 مرتين من أجل تبادل تماما H 2 O مع D 2 O.
  3. حل يغوساكاريدس المجففة في D 2 O (0.6 مل، 99.9٪) وإضافة 0.5 ميكرولتر من الأسيتون (5٪ في D 2 O) كمعيار داخلي. نقل يغوساكاريدس بالديوتيريوم في أنبوب عينة NMR.
  4. عقد أنبوب يحتوي على عينة NMR من أعلى وإدراج أنبوب عينة في الدوار البلاستيك. وضع الدوار في قياس عينة العمق. صديدح أو سحب أنبوب عينة لضبط عمق العينة للتأكد من أن خط الوسط من أعلى العينات ومقاييس عمق القاع متساوون.
  5. إزالة قياس عمق وتضاف العينة إلى العينات السيارات تعلق على NMR مطياف 600 ميغاهيرتز مجهزة البرد التحقيق.
  6. تسجيل الدخول وفتح برنامج حاسوبي لمراقبة الطيف. أدخل اسم ملف عينة. فتح مجموعة البيانات الموجودة ثم استخدام الأمر "تنمية الصادرات" لحفظه إلى تحت اسم جديد. اكتب رقم الموقف من العينة في العينات السيارات واضغط على "دخول".
    ملاحظة: الضغط على زر "دخول" وإسقاط أنبوب عينة بلطف إلى تجويف المغناطيس حيث سيتم وضعه على رأس لجنة التحقيق.
  7. ضبط درجة حرارة العينة المطلوبة عن طريق كتابة "edte" في سطر الأوامر. انتظر درجة حرارة العينة للوصول إلى القيمة المطلوبة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. أدخل "تأمين" في سطر الأوامر وحدد مذيب مناسب (D 2 O). انتظر & #34؛ قفل "رسالة النهائية لتظهر في الجزء السفلي من الإطار.
  8. اكتب "atmm" في سطر الأوامر ثم اضغط على "الأمثل" في الجزء العلوي من شريط القوائم atmm. اختر بدء لضبط ومطابقة لجنة التحقيق للقناة المحددة (1 H في هذه الحالة).
  9. اكتب "topshim" في سطر الأوامر لعملية الملئ التي يتم فيها إجراء تعديلات طفيفة على المجال المغناطيسي حتى يتحقق مجال مغناطيسي منتظم في جميع أنحاء sample.Acquire إشارة عن طريق كتابة "زج" في سطر الأوامر وأدخل.
  10. تحليل الأطياف باستخدام برنامج 15 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع 1 H التحول الكيميائية المشار إليها في مستوى داخلي من الأسيتون في 2.225 جزء من المليون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الهضم Endoxylanase من 2AB المسمى W-سول AXS يولد مزيجا من يغوساكاريدس RE-وصفت 2AB وسلسلة من يغوساكاريدس (دون تسمية 2AB) وصفت الامم المتحدة المستمدة من المناطق الداخلية من سلسلة الزيلان (الشكل 1؛ من راتناياك وآخرون. 2). سلسلة من النهج الكروماتوغرافي ثم يتم توظيف ليجزئ من خليط معقد من سداسي. وأخيرا، وتستخدم تقنيات مايكروسوفت لتحديد الهياكل ايزوميريا أن يتم بعد ذلك التسلسل بواسطة MS ن التقنيات. هنا نقدم ممثل، وليس شاملا، مثال على هذا النهج.

وتشمل الإشارات في الطيف MALDI-TOF-MS من يغوساكاريدس المستمدة من المسمى 2AB الأصلي W-سول AXS (الشكل 2A) وفيرة للغاية الزائفة الجزيئي سلسلة ايون في م / ض 701، 833، و 965 يمثلون سلسلة من ليس لها علامة محايدة الداخليةيغوساكاريدس المنطقة مع 5-7 بقايا بنتوزيل (ف 5-7) على التوالي. سلسلة من الإشارات في م / ض 745، 877، و 1009، تعين أن سلسلة قليل السكاريد الحمضية غير المسماة، مع P 4-6 + سداسي 1 (حمض الهيكسورونيك)، هي أيضا موجودة في هذا الكسر (الشكل 2A). أيونات شبه الجزيئية في م / ض 821 و 953 تشير إلى وجود المسمى 2AB الأصلية يغوساكاريدس RE P 5-6 + 2AB، على التوالي.

ثم يتم إجراء تحليل ESI-QTOF-MS ليغوساكاريدس الأم مع تجزئة على الإنترنت الكروماتوغرافي من يغوساكاريدس بواسطة RP C-18 HPLC. الشكل 2B و2C، ويظهر المسح أيون المحدد، المستخرجة من ESI-QTOF-MS الكلي أيون اللوني (TIC)، من يغوساكاريدس الصادرة عن endoxylanase من W-سول الأب AXS. وتشمل إشارات سلسلة أيون شبه الجزيئية المعينة كما [M + NH 4] + في م/ ض 696، 828، 960، 1092، 1224، و 1356 وهو ما يمثل سلسلة من يغوساكاريدس محايدة المنطقة الداخلية مع 5-10 بقايا بنتوزيل (P 10/5)، على التوالي (الشكل 2B). العديد من الهياكل ايزوميريا ممكنة لقليل السكاريد من كتلة محددة (انظر أدناه ESI-MS ن التحليل). وبالتالي قمم متعددة لكل عمليات التفحص أيون الجزيئية ممكنة كما لوحظ في الشكل 2B. أيونات شبه الجزيئية المعينة كما [M + H] + في م / ض 271، 403، 535، 667، 799، و 931 تشير إلى وجود 2AB صفت RE سلسلة قليل السكاريد P 1-6 + 2AB، على التوالي (الشكل 2C) . إشارات الكشف عن [M + H] + الأيونات في م / ض 613، 745، 877، 1009، 1141، و 1273 تشير إلى وجود يغوساكاريدس الحمضية مع P 3-8 + سداسي على التوالي (الشكل 2C). في ذوات الفلقة commelenid، ويمكن أيضا أن تكون بديلا العمود الفقري الزيلان مع الأحماض الفينولية،في المقام الأول حمض الفيرليك (وأيضا ص حمض -coumaric)، التي لديها نفس الكتلة الجزيئية باسم حمض الغلوكورونيك ويمكن اكتشافه في AXS W-سول من القمح جدران الخلايا السويداء. ومع ذلك، مزيد من التحليل للW- وكوه-سول AXS باستخدام ESI-MS ن (والتركيبية ويحلل من قبل GC-MS المشتقات TMS التالية تحلل الميثانول، غير مبينة هنا) تأكيد يغوساكاريدس الحمضية مع P 3-8 + 1 سداسي في السويداء القمح AXS.

الإشارات المخصصة كما [M + H] + الأيونات من ESI-Q-TOF الطيف الضوئي الكامل للمنطقة بين 3،10-3،48 دقيقة (الشكل 2D) يتضمن سلسلة من 2AB صفت يغوساكاريدس RE: م / ض 271، 403، 535، 667، 799، 931، 1063، و 1195 (ف 1-8 + 2AB، على التوالي). سلسلة من أيونات شبه الجزيئية في ESI-Q-TOF الطيف الضوئي الكامل للمنطقة بين 3،59-4،05 دقيقة (الشكل 2E) تمثل يغوساكاريدس الحمضية المنطقة الداخلية تقيداد على حد سواء [M + نا] + الأيونات: م / ض 613، 745، 877، 1009، و 1141 (ف 3-7 + سداسي على التوالي) و[M + NH 4] + الأيونات: م / ض 740، 872، 1004، 1136، و 1268 (ف 4-8 + سداسي على التوالي).

من أجل تسلسل يغوساكاريدس الفردية، أجرينا ESI-MS ن على لكل ميثليته-O يغوساكاريدس بدلا من التركيز على يغوساكاريدس الأم التي تم الحصول عليها من W-سول وكوه-سول AXS لأنه يمثل تحديا لتعيين الهياكل بشكل لا لبس فيه عن طريق التسلسل يغوساكاريدس الأم . وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب أيضا كميات أكبر من المواد. أجريت مثيلة من يغوساكاريدس خارج كما وصفها Pettolino وآخرون. 1. وصفت ESI-MS ن التحقيقات التي تجرى على RE محايد alditols قليل السكاريد المستمدة من KOH-سول AXS، و2AB موصوفة قليل السكاريد RE محايد المستمدة من AXS W-سول بيلوث كمثال للمساعدة في تفسير الأطياف والهياكل استنتاجها. ويمكن تطبيق نفس النهج لجميع يغوساكاريدس الناتجة عن التحلل إنزيمي. وقد تم تحديد الأيونات شظية في ESI-MS ن الأطياف كما Y و B الأيونات وفقا لDomon وكوستيلو 16 مجموعة الهيدروكسيل ميثليته اون (ق) ولدت خلال الطور الغازي تفتيت لكل ميثليته-O يغوساكاريدس في MS ن يوفر يتم وضع علامة 14Da الفرق الشامل "ندبة" التي يمكن استخدامها لتحديد نمط المتفرعة وتسلسل غليكوزيل 12-13 كل ندبة الناتجة عن حالة التشرذم كخط ثابت (الشكلان 3 و 4). كما العديد من الهياكل ايزوميريا الممكنة لكتلة محددة، ثم في هذه الهياكل ايزوميريا، وصفت Y و B أيونات باللونين الأحمر والأسود على التوالي.

وESI-MS ESI-MS 3 و ESI-MS 4 SPECTرا نصيب-O-الميثيلي RE محايد alditol-جزئية غليكوزيل الناتجة عن تجزئة شبه الجزيئية أيون م / ض 885 (ف 4 + XYL رأ) هو مبين في الشكل (3). ويتضمن ESI-MS 2 الطيف وفرة Y الأيونات في م / ض 711، 551، و 391 ولدت من جراء فقدان واحدة وغرفتين وثلاث بقايا بنتوزيل، على التوالي، من أيون الأم. وفرة م / ض 711 أيون يمكن أن تتولد من قبل أي خسارة من غير الحد نهاية طرفية XYL بقايا أو فقدان محطة سلسلة الجانب آرا بقايا. والتشخيص Y م / ض 391 أيون في الطيف الناتجة يمكن أن تتولد من فقدان ثلاثة غير تقليل المخلفات XYL نهاية من قليل السكاريد RE التي لديها آرا بقايا سلسلة جانبية على بقايا رأ RE XYL أو قليل السكاريد RE التي لديها سلسلة الجانب آرا بقايا على بقايا الثانية 2 XYL من رأ بقايا RE XYL. على الرغم من أن هناك إمكانية الرسمية التي الهياكل الأخرى، مثلXYL 4 -Xyl رأ، و (آرا) XYL-XYL-XYL-XYL رأ من شأنه أن يثير هذا يتم استبعاد جزء أيون هذه الهياكل من النظر إليها باعتبارها خصوصية إندو-xylanase تستخدم ليلتصق السكاريد إما تتحلل أو لا يلتصق في الربط غليكوزيدية المجاور لنقطة فرع، على التوالي. في المقابل، فإن التشخيص Y م / ض 551 أيون يمكن أن تتولد من فقدان اثنين من غير تقليل المخلفات XYL نهاية من قليل السكاريد RE الذي يحتوي على سلسلة الجانب آرا بقايا على أي بقايا رأ RE XYL أو قليل السكاريد RE الذي لديه الجانب سلسلة آرا بقايا على بقايا XYL قبل الأخيرة. وهكذا، يمكن اقتراح أربعة مبان ايزوميريا المحتملة (الشكل 3: الأول والثاني والثالث والرابع). وفرة Y أيون م / ض 377 (انظر الشكل 3: الأولى أ والداخليين) و (ب) أيون م / ض 503 (انظر الشكل 3: الأولى أ، باء، مثيرة ويذب) التي تم إنشاؤها من مزيد من تفتيت ايزوميريا السلائف م/ لوحظ ض 711 أيون أيضا في هذا الطيف. وESI-MS 3 الطيف (الشكل 3) التي سجلتها تفتيت ايزوميريا السلائف م / شملت ض 711 أيونات ذروة رئيسية في م / ض 537 (Y أيون ف 2 + XYL رأ مع اثنين من الندوب، ولدت من السلائف أيون الأولى أ ، إب، الداخليين، بنك الاستثمار الدولي، الثالث ألف، IIIB، مثيرة ويذب) وم / ض 391 (Y أيون ف 1 + XYL رأ مع ندبة واحدة، ولدت من السلائف أيون بنك الاستثمار الدولي، الثالث ألف، IIIB، مثيرة ويذب). هذان القمم الكبرى (م / ض 537 و م / ض 391) يمكن أن تتولد من جراء فقدان واحد واثنين من غير الحد بقايا XYL الطرفية، على التوالي، من ايزوميريا السلائف م / ض 711 أيون الناتجة عن تجزئة الزائفة -molecular أيون الأم م / ض 885 (ف 4 + XYL رأ) خلال ESI-MS 2. أقل نسبيا القمم وفرة في م / ض 377 (Y أيون ف 1 + XYL رأ مع اثنين من الندوب، ولدت من precursoوقد لوحظت المتولدة من السلائف أيون إيب وبنك الاستثمار الدولي) أيضا في هذا الطيف، ص أيون الأول (أ) والداخليين) و 551 (Y أيون ف 2 + XYL رأ مع ندبة واحدة.

وESI-MS 4 من تفتيت ايزوميريا السلائف م / ض شملت 551 أيونات ذروة رئيسية في م / ض 377 (Y أيون ف 1 + XYL رأ مع اثنين من ندوب) وم / ض 391 (Y أيون ف 1 + XYL رأ مع ندبة واحدة) التي تم إنشاؤها من أيون السلائف هياكل الأول والثاني. لذلك اقترح الأدلة الجماعي أن تسلسل RE غليكوزيل يتكون من سلسلة من الجانب آرا تعلق على رأ بقايا RE XYL (التشخيص تجزئة المسار م / ض 885 → 711 → 551 → 391، الشكل 3II)، آرا سلسلة الجانب تعلق على حد سواء RE XYL را وقبل الأخيرة (1 ش XYL بقايا من RE XYL رأ) XYL بقايا (التشخيص تجزئة المسار م / ض 885 → 711 → 537 → 391، الشكل 3III)، آرا سلسلة الجانب تعلق على ما قبل الأخيرة (1 ش XYL من RE XYL رأ) XYL بقايا (التشخيص تجزئة المسار م / ض 885 → 711 → 537 → 377، الشكل 3I) و سلسلة الجانب آرا تعلق على بقايا الثانية 2 XYL من رأ RE XYL (الشكل 3IV).

وجود هذه الأيونات يؤكد الهياكل ايزوميريا المقترح الأول والثاني والثالث والرابع ومحايد RE هيكل قليل السكاريد من: - [أرا و - (1 → 3)] (+/-) -Xyl ص - (1 → 4) - [أرا و - (1 → 3)] (+/-) -Xyl ص - (1 → 4) - [أرا و - (1 → 3)] (+/-) -Xyl ص.

الطيف ESI-MS 2 من 2AB في-O-ميثليته صفت RE قليل السكاريد المتولدة من fragmويرد entation من شبه الجزيئي [M + نا] + أيون في م / ض 871 (ف 4 + 2AB) في الشكل رقم 4. ويشمل هذا الطيف أيون Y الأكثر وفرة في م / ض 697 (ف 3 + 2AB مع واحد ندبة)، م / ض 537 (ف 2 + 2AB مع ندبة واحدة) وم / ض 377 (ف 1 + 2AB مع ندبة واحدة)، الناتجة عن فقدان أي واحد أو اثنين أو ثلاثة غير الحد بقايا بنتوزيل، على التوالي. أيون م / ض 697 يمكن أن تتولد من قبل أي خسارة من غير الحد بقايا محطة نهاية XYL أو فقدان بقايا محطة آرا بينما م / ض 537 أيون يمكن إلا أن يكون الناتجة عن فقدان اثنين من مخلفات XYL الطرفية . مسار تجزئة التشخيص (م / ض 871 → 697 → 537 → 377) أشار إلى أن وجود الخطية الامم المتحدة أفرع قليل السكاريد العمود الفقري الزيلان (ق) في RE المقابلة لشبه الجزيئية أيون م / ض 871 (ف 4 + 2AB ). ولكن الخطية الامم المتحدة أفرع xylosyl العمود الفقري (ف 4 + 2AB) هي susceptible إلى الموقع endoxylanase محددة لمزيد من الهضم. لذلك يمكن أن اثنين من ايزوميريا م / ض 697 الأيونات موجودة. وفقا لذلك يقترح هيكلين ايزوميريا المحتملة (الشكل 4: الأول والثاني). في هذه الهياكل ايزوميريا وصفت Y و B أيونات باللونين الأحمر والأسود على التوالي. وESI-MS 3 الطيف المسجلة من تفتيت السلائف ايزوميريا م / ض 697 أيون يولد م / ض 523 أيون (Y أيون ف 2 + 2AB مع اثنين من الندوب، الشكل (4)، والهياكل IA، إب، الداخليين وبنك الاستثمار الدولي)، م / ض 363 أيون (Y أيون ف 1 + 2AB مع اثنين من الندوب، الشكل (4)، هيكل الداخليين) وY أيون في م / ض 377 (ف 1 + 2AB مع ندبة واحد؛ الشكل 4، الهياكل الأول (أ) وIB). أيون شظية في م / ض 377 يمكن أن تنشأ فقط من الهيكل المقترح الأول وأيون شظية في م / ض 363 يمكن أن تنشأ فقط من الهيكل الثاني المقترح. وجود وقت واحد من هذه الأيونات اثنين يؤكد الهياكل المقترحة الأول والثاني. وهكذا تسلسل RE غليكوزيل من سلسلة الزيلان من AXS السويداء القمح تتكون من غصن آرا تعلق على بقايا RE XYL (تجزئة المسار م / ض 871 → 697 → 523 → 363) و / أو قبل الأخيرة XYL بقايا (تجزئة المسار م / ض 871 → 697 → 523 → 377).

تحليل NMR من AXS

التحليلات يستند إلى MS-لا تقدم معلومات على أي تكوين المصاوغ الكربونيلي (α / β) أو التكوين D / L من السكريات التي يجب أن يحصل عليها المناهج الأخرى، بما في ذلك استخدام إنزيمات تساعد والجسدية (على سبيل المثال، NMR). لheteroxylans مع مميزة RE خفض رباعي السكاريد (XYL-رحه-حفل-XYL رأ)، الطيف NMR يحتوي على إشارات المصاوغ الكربونيلي مما يؤدي إلى تحديد وتسلسل هذا قليل السكاريد RE. وصفنا استخدام 600 ميغاهيرتز 1D 1 H-NMR الطيفي كوسيلة خطوة واحدة إلى ديت فرو القاقم تسلسل غليكوزيل كاملة من السويداء القمح AX RE قليل السكاريد على الأب كوه-سول، بما في ذلك التكوين المصاوغ الكربونيلي (α / β) والتكوين D / L من السكريات. تم تعيين الأصداء على أساس المهام نشرت من القمح يغوساكاريدس AX 17-18 (الشكل 5، الجدول 1). ويهيمن على H-NMR الطيف 1 من AX المستخرجة من السويداء القمح بنسبة التحولات المصاوغ الكربونيلي الكيميائية في 5.39، 5.27 و 5.22 جزء في المليون التي تم تعيينها إلى بروتون من محطة بقايا α-L-آرا و الملحق O-3 موقف (T-α-L-آرا و → 3 S) من تشعبت منفردة (1،4) -β-XYL بقايا ص العمود الفقري وكلاهما O-3 و O-2 وظائف (T-α-L-آرا و → 3 D و T-α-L-آرا و → 2 د) من متفرعة مضاعفا (1،4) -β-XYL بقايا ص العمود الفقري، على التوالي (الشكل 5 والجدول 1).

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> يتم تعيين إشارات في 5.41 إلى (T-α-L-آرا و → 3 S + D) إشارة H1 من α-L-آرا و سلسلة الجانب تعلق على موقف O-3 من تشعبت منفردة β-D-XYL ص بقايا مع المجاورة تشعبت مضاعف β-D-XYL ص. يتم تعيين إشارة على 5.29 إلى (T-α-L-آرا و → 3 D + D) إشارة H1 من α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-3 من تشعبت مضاعف β-D-XYL يتم تعيين ص بقايا مع المجاورة تشعبت مضاعف β-D-XYL ص إشارة إلى 5.24 إلى (T-α-L-آرا و → 2 D + D) إشارة H1 من α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على O-2 موقف تشعبت مضاعف β-D-XYL ص بقايا مع المجاورة تشعبت مضاعف β-D-XYL ص.

الشكل 1

<الطبقة ص = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل 1. ملخص المنهج التجريبي ملخص الاستراتيجية المستخدمة في توليد تنقية وتسلسل نهاية الحد (RE) ويغوساكاريدس المنطقة الداخلية. من القمح ويرد arabinoxylans السويداء (AXS). وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من راتناياك وآخرون. (2014) (2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. MALDI-TOF MS (A) وESI-MS QTOF (B - E) تحليل يغوساكاريدس الأم الصادرة عن endoxylanase من 2AB المسمى W-سول AXS كما هو مبين في الشكل 1. MALDI-TOF MS الطيف: (A) ( إشارات ل إعادة يدعى [M + نا] + الأيونات ناتج إضافة)؛ مسح أيون مختارة من ESI-MS QTOF الاستشرابية: B = P 5-10 المستمدة من يغوساكاريدس المنطقة الداخلية (يتم تحديد الإشارات كما [M + NH 4] + الأيونات ناتج إضافة)؛ C = P 1-6 + 2AB المستمدة من RE يغوساكاريدس (يتم تحديد الإشارات كما [M + H] + الأيونات ناتج إضافة) & P 3-8 G المستمدة من يغوساكاريدس الحمضية (يتم تحديد الإشارات كما [M + نا] + الأيونات ناتج إضافة)؛ D = ESI-Q-TOF كامل الطيف الضوئي: المنطقة الواقعة بين 3،10-3،48 دقيقة، E = ESI-Q-TOF كامل الطيف الضوئي: المنطقة الواقعة بين 3،59-4،05 دقيقة (يتم تحديد الإشارات على حد سواء [M + نا] + [وM + NH 4] + الأيونات ناتج إضافة )؛ P = وحدة بنتوزيل (إما آرا أو XYL)؛ G = uronosyl بقايا (GlcA)؛ RE = الحد يغوساكاريدس الغاية؛ 2AB = 2 aminobenzamide. EIC: استخراج ايون اللوني. إعلان / 53748 / 53748fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ESI-MS ESI-MS 3 و ESI-MS 4 أطياف لكل O-الميثيلي RE محايد alditol غليكوزيل (ف 4 + رأ XYL) - م / ض 885. يتم تعيين إشارات مثل [M + نا] + adducts أيون شبه الجزيئية. كما العديد من الهياكل ايزوميريا لكتلة محددة ممكنة ثم في الهياكل ايزوميريا وصفت Y و B أيونات باللونين الأحمر والأسود على التوالي. وتتميز كل "ندبة" الناتجة عن حالة التشرذم كخط ثابت. X = Xylosyl بقايا؛ A = Arabinosyl بقايا. وقد استنسخت ESI-MS 3 أطياف بإذن من راتناياك وآخرون. (2014) 2.748fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. ESI-MS 2 و ESI-MS 3 أطياف 2AB في-O-ميثليته صفت قليل السكاريد RE محايد (ف 4 + 2AB) - م / ض 871. يتم تعيين إشارات مثل [M + نا] + الزائفة adducts أيون -molecular. كما العديد من الهياكل ايزوميريا لكتلة محددة ممكنة في الهياكل ايزوميريا، وصفت Y و B أيونات باللونين الأحمر والأسود على التوالي. وتتميز كل "ندبة" الناتجة عن حالة التشرذم كخط ثابت. X = Xylosyl بقايا؛ A = Arabinosyl بقايا. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من راتناياك وآخرون. (2014) (2). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرسأيون من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. المنطقة المصاوغ الكربونيلي من الطيف 600 ميغاهرتز 1D 1 H-NMR من يغوساكاريدس AX الناتجة عن العلاج endoxylanase من KOH- سول الأب 1 H التحول الكيميائية المشار إليها في مستوى داخلي من الأسيتون في 2.225 جزء من المليون. T-α-L-آرا و → 3 S: H1 إشارة α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-3 من تشعبت منفردة β-D-XYL ص بقايا؛ T-α-L-آرا و → 2 D: H1 إشارة α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-2 من تشعبت مضاعف β-D-XYL ص بقايا؛ T-α-L-آرا و → 3 D: H1 إشارة α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-3 من تشعبت مضاعف β-D-XYL ص بقايا؛ ت-α-L-آرا و → 3 S + D: إشارة H1 من α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-3 من تشعبت منفردة β-D-XYL ص بقايا مع المجاورة تشعبت مضاعف β-د- XYL ع؛ T-α-L-آرا و → 2 D + D: إشارة H1 من α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-2 من تشعبت مضاعف β-D-XYL ص بقايا مع المجاورة تشعبت مضاعف β-D ص -Xyl. T-α-L-آرا و → 3 D + D: إشارة H1 من α-L-آرا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-3 من تشعبت مضاعف β-D-XYL ص بقايا مع المجاورة تشعبت مضاعف β-D ص -Xyl. 2-α-L-آرا و → 3 S: إشارة H1 من 2-α-L-آرا بقايا سلسلة جانبية و تعلق على موقف O-3 من تشعبت منفردة β-D-XYL ص بقايا؛ الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

بقايا السكر H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-4 / C-4 H-5 مكافئ / C-5 H-5 الفأس / C-5
T-α-L-عارف → 3 S 5،396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-عارف 5،415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-عارف → 2 D 5،223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-عارف → 2 D + D 5،243 / 4.16 3.98
T-α-L-عارف → 3 D 5،272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-عارف → 3 D + D 5،298 / 4.18 3.96
2-α-L-عارف → 3 S 5،548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
ألفا Xylp (الحد) 5،185 / 91.9 3.55 3.72
بيتا-Xylp (الحد) 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
بيتا -4-Xylp + S 4،461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4،448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
بيتا-3،4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
S + β-3،4-Xylp 4،514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D + β-3،4-Xylp 4،505
بيتا-3،4-Xylp + S 4،492 3.45 3.74
β-3،4-Xylp + D 4،482 3.45 3.74
بيتا-2،3،4-Xylp 4،638
S + β-2،3،4-Xylp 4،627 3.59 3.87 3.88
D + β-2،3،4-Xylp 4،616
بيتا-2،3،4-Xylp + S 4،593
β-2،3،4-Xylp + D 4،593
وذكرت التحولات الكيميائية بالنسبة لالأسيتون الداخلي، δ 2.225.
S = تشعبت منفردة β-Xylp
S + D = تشعبت منفردة β-Xylp + مضاعف تشعبت β-Xylp
D = تشعبت المضاعفة β-Xylp
D + D = تشعبت المضاعفة β-Xylp + مضاعف تشعبت β-Xylp

الجدول 1. إشارات 1 H-الرنين المغناطيسي النووي من XYLO-يغوساكاريدس الناتجة عن العلاج endoxylanase من السويداء القمح كوه سول الأب

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ومعظم المرحلة مصفوفة السكريات جدار الخلية على ما يبدو بديلا عشوائيا العمود الفقرى (مع كل غليكوزيل والمخلفات غير غليكوزيل) التي تختلف اختلافا كبيرا تبعا لنوع من النباتات، ومرحلة النمو ونوع الأنسجة 3. منذ السكريات هي منتجات الجين الثانوية تسلسلها لا قالب اشتقاق، وبالتالي لا يوجد نهج تحليلي واحد، مثل وجود للأحماض النووية والبروتينات، لتسلسلها. وقد وفرت توافر الإنزيمات حلمهي النقاء-رابط محدد أداة قوية لتتحلل السكريات إلى يغوساكاريدس التي يمكن أن تكون ثم مجزأة chromatographically، وعندما تستخدم بالاقتران مع التقنيات الكيميائية والفيزيائية التسلسل تماما. ويتمثل التحدي في ثم إعادة تجميع هذه مخاليط معقدة في السكاريد الأصلي sequence- واحد هو أن لا يزال لمعالجتها بنجاح.

نحن هنا وصف نهج (النظام الذي من كاليفورنيا تطبيقن يكون المتنوعة) التي تعتمد على التكامل بين إنزيمي أنشئت والكيميائية والتقنيات الفيزيائية لتوصيف هيكلي لكل من نهاية الحد (RE) وتسلسل غليكوزيل المنطقة الداخلية (ق) من heteroxylans. تقنية تكميلية إضافية غير الموصوفة هنا ثبت أنه مفيد جدا لوصف يغوساكاريدس هي PACE (تحليل السكاريد من الكربوهيدرات الكهربائي للهلام) التي وضعها الفريق دوبري 19 ويمكن أن يتكامل بسهولة مع هذا البروتوكول إذا كانت المعدات المتاحة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الاختلافات حول اللوني LC أيضا أن تكون مفيدة، مثل جنبا إلى جنب مضمنة التفاعل ماء اللوني (HILIC) تليها اللوني RP تقدم إمكانية فصل على حد سواء بلا علامات / المعلمة يغوساكاريدس في خطوة واحدة. تقنيات تعتمد على العلامات (مع 2 aminobenzamide (2AB)) في نهاية الحد (RE) من سلسلة heteroxylan قبل الأنزيمية (endoxylanase) التحلل. نهجين مختلفين (انظر ملخص فييتم اعتماد الشكل 1). في المرحلة الأولى، يتم التعامل AXS سليمة W-سول مع 2AB لوضع علامة الأصلي RE العمود الفقري بقايا سلسلة السكر وبعد ذلك تعامل مع endoxylanase لتوليد مزيج من RE-وصفت 2AB والمنطقة الداخلية والحد يغوساكاريدس، على التوالي. في النهج الثاني هو تحلل من الأب كوه-سول مع endoxylanase لتوليد أول خليط من يغوساكاريدس التي وصفت في وقت لاحق مع 2AB. في هذا السيناريو الأخير لRE الأصلي للAX-كوه سول لن يكون المسمى مع 2AB لأنها قد خفضت إلى غليكوزيل-alditol خلال استخراج القلويات التي تحتوي على اختزال، بوروهيدريد الصوديوم (NaBH 4). لذلك، ولدت يغوساكاريدس المسمى 2AB الهضم بعد xylanase، سوف تنشأ من يغوساكاريدس "الداخلية" وقليل السكاريد RE الأصلي سوف تحتوي على alditol RE دون علامة 2AB (انظر الشكل 1). ويمكن أيضا أن تطبق هذا النهج إلى فئات أخرى من السكريات شالغناء (إن وجدت) وإندو-هيدروليز المناسبة.

ومما يعزز النهج القائم على MS-إلى حد كبير من قبل مثيلة من يغوساكاريدس ولدت بعد العلاج endoxylanase منذ مجموعة الهيدروكسيل-ميثليته الامم المتحدة (الصورة) التي تم إنشاؤها خلال الطور الغازي تفتيت لكل-O الميثيلي يغوساكاريدس في MS ن توفر 14Da الفرق كتلة "ندبة "والتي يمكن استخدامها للمساعدة في التعرف على نمط المتفرعة وتسلسل غليكوزيل 5-6 هوية بقايا بنتوزيل (وأي بقايا السكر) لا يمكن أن تكون مصنوعة من البيانات MS وحدها، بل يأتي من وجود المعرفة تكوين جزيء. حيث هذا غير متوفر ثم يجب أن يتم تنفيذ أحادي السكاريد والربط التحليلات ذات الصلة قبل اتخاذ هذه المهام في MS ن. وعلاوة على ذلك إشارات المقابلة لalditol RE الحمضية قليل السكاريد، ولدت من KOH-سول الأب (XYL 3 -MeGlcA-إكسيليتول: م / ض 761) والفصلaracteristic dicot RE الزيلان غليكوزيل تسلسل (XYL 2 -Rha-حفل-إكسيليتول: م / ض 761)، إذا كان موجودا، ليست قادرة على أن تميز على حد سواء لديهم نفس الكتلة الجزيئية في شكل الأصلي لكن يمكن تمييزها عن تجزئة مرض التصلب العصبي المتعدد ( MS ن) الأطياف والذي هو أفضل أداء على يغوساكاريدس مثيلة. وأخيرا، وتقنيات يستند إلى MS-غير قادرة على تقديم معلومات عن أي تكوين المصاوغ الكربونيلي (α / β) من الربط غليكوزيدية أو التكوين D / L من sugars- هذا يجب أن يتم تحديدها من قبل وسائل بديلة، بما في ذلك إنزيمي والمادية (على سبيل المثال، NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
  2. Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
  3. Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
  4. York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
  5. Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
  6. Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
  7. Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
  8. Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82, (13), 372-377 (1980).
  9. Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
  10. Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
  11. Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
  12. Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
  13. Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22, (2012), 439-451 (2012).
  14. Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
  15. Topspin User Manual. Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
  16. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
  17. Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter