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Chemistry

使用酶法,化学(甲基化)和物理(质谱,核磁共振)技术,植物墙Heteroxylans测序

doi: 10.3791/53748 Published: March 24, 2016

Abstract

这个协议描述了用于还原末端(RE)和heteroxylans的内部区域的糖基序列(多个)的表征的具体的技术。脱浆小麦胚乳细胞壁中分离作为不溶醇残基(AIR)1,并依次用水(W-溶胶星期五)萃取和含有1M的KOH 1%的NaBH 4(KOH溶胶星期五),为通过Ratnayake 描述 (2014)2。两种不同的方法( 见图1中的摘要)被采用。在第一,完整的W-溶胶AXS用2AB处理来标记原始RE主链糖残基,然后用木聚糖内切处理,以生成2AB标记的RE和内部区域分别还原的低聚糖,的混合物。在第二种方法中,所述KOH溶胶星期五与内木聚糖酶水解成第一生成其随后用2AB标记的寡糖的混合物。该酶解释放((UN)的标签)从两个低聚糖W-和KOH溶胶FRS然后甲基化并且两个天然和甲基化寡糖的详细的结构分析使用MALDI-TOF-MS,RP-HPLC-ESI-QTOF-MS和ESI-MS n的组合被执行。木聚糖内切消化的KOH溶胶AXS的特征还在于用核磁共振(NMR)也提供了关于异头配置信息。这些技术可以应用于其他类使用适当的内切水解酶多糖。

Introduction

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Heteroxylans是属于禾本科的主壁和所有被子植物3-6的次生壁的主要非纤维素多糖多糖家族。木聚糖主链中它们的类型和与糖基(葡糖醛酸(中,GlcA),阿拉伯糖(阿拉伯糖))和非糖基(O-乙酰基,阿魏酸),这取决于组织类型,发育阶段和物种7个残基的取代的图案不同。

从小麦壁( 普通小麦 )胚乳组成主要由阿拉伯木聚糖(AXS)(70%)和(1→3)(1→4)-β-D-葡聚糖(20%)与少量的纤维素和heteromannans的(2%各)8。木聚糖主链可以是各种未取代的和主要的单取代的(主要是O-2位和在较小程度上O-3的位置)和二 - 取代的(O-2和O-3位)用α-L-阿拉˚F残留9。还原性末端(RE)异质从双子叶植物的木聚糖(例如, 拟南芥 )10和裸子植物(例如,云杉( 云杉 ))11包含一个特性四糖的糖基序列; -β-D-木糖 - (1→3)-α-L-鼠李糖 - (1→2)-α-D-半乳糖p A-(1→4)-D-的Xyl 。理解heteroxylan生物合成和功能(生物和工业),重要的是要充分序列木聚糖主链理解的种类和取代的模式以及还原端(RE)的序列。

用于还原端(RE)和heteroxylans的内部区域的糖基序列(多个)的结构特征的特定的技术在本手稿中描述。该技术依赖于荧光团标记(用2氨基苯甲酰胺(2AB))之前,酶(木聚糖内切)水解heteroxylan链的还原端(RE)。这种方法,特别是用于对RE测序,是首先由纽约实验室10,12-13报道,但现在扩展为包括内部区域测序,并且是已建立的技术的组合是同样适用于独立的隔离的源的所有heteroxylans。这种方法也可以使用(如果有的话),相应的内切水解酶应用于其他类多糖。

在本研究中,如所述脱浆小麦胚乳细胞壁中分离作为不溶醇残基(空气)中,依次用水(W-溶胶FR)萃取,含有1%的NaBH 4(KOH-溶胶FR)1M KOH在Ratnayake 等人。(2014)2。从两个W-和KOH溶胶FRS释放寡糖然后甲基化并且两个天然和甲基化寡糖的详细的结构分析使用MALDI-TOF-MS,ESI-QTOF-MS-加上HPLC用的组合进行使用RP C-18柱在线色谱分离和ESI-MSñ。木聚糖内切消化的KOH溶胶AXS还特征在于核磁共振(NMR)。

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Protocol

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W-溶胶AXS 1.还原性末端的标签(RE)糖残基与2-氨基苯甲酰胺(2AB)

  1. 在65℃孵育的W-溶胶AXS用在1M的NaBH 3 CN(氰基硼氢化钠)(pH5.5)中进行2小时的存在2AB(0.2M)到多糖主链链的还原末端转化成它们的荧光衍生物。
    注意:以下步骤应在通风橱作为加入NaBH 3 CN释放有毒的氰化物气体,当它是在与水接触来进行。
    1. 称出的NaBH 3 CN(62.8毫克)和溶解于水(1毫升)的微量离心管(1.5ml)中以制备1M的加入NaBH 3 CN溶液。在1M的NaBH 3 CN溶液(1ml)中加热在65溶解2AB试剂(27.2毫克)   ℃,调节反应混合物(0.2M 2AB,1M的NaBH 3 CN)与10%乙酸的pH 5.5的pH值。
    2. 添加反应混合物中加入200μl(0.2M 2AB,1M的NaBH 3 CN)至W-所以升AXS(1毫克)在有盖的玻璃管,混合使用涡旋混合器。孵育在65 2小时 在通风橱°以下。酷悬浮RT,并添加4卷。无水乙醇。
    3. 放置悬浮于冷藏(4℃)O / N,以沉淀多糖。
    4. 离心机(1500 XG,10分钟,RT),除去上清液。用无水乙醇(4次),丙酮(1x)和甲醇(1×)广泛洗涤沉淀,每次洗涤之间离心。在40°CO / N真空干燥。
      注意:彻底清洗也消除残留2AB。

2.来自2 AB标记的代低聚木糖的W-溶胶AXS

  1. 溶解2AB在微量离心管的乙酸钠缓冲液500微升(100毫米,pH值5)(1.5毫升)标记的W-溶胶AXS(1毫克)。加入4单位木聚糖内切的(GH 11,[M1]),在37孵育  °下16小时。
  2. 通过加热反应mixt破坏酶的活性URE在沸水浴10分钟。冷却该悬浮液至室温并转移到玻璃管用帽。添加4卷。无水乙醇,并将该悬浮液在冷藏(4℃)O / N,以沉淀任何未消化的多糖。
  3. 离心(1500 xg离心10分钟,室温)以分离未消化多糖(片)和木聚糖内切产生低聚木糖(上清液)。倒出上清到一个干净的玻璃管,并把它变成一个温水浴(40℃)。
  4. 蒸发在氮气流下乙醇到终点体积(〜500微升)。冻结在-80℃的上清液4小时,并在一个冷冻干燥器回收低聚木糖干燥冷冻上清液。

3.从KOH-溶胶AXS和2AB标签低聚木糖的生成

  1. 对待切木聚糖酶KOH-溶胶AXS(GH 11,[M1])以上(部分2.1-2.4)所描述的生成低聚木糖。
  2. 治疗endoxylanase产生低聚木糖从KOH溶胶AXS以上(部分1.1.1-1.1.2)描述2AB反应混合物(0.2M 2AB,1M硼氢化钠3 CN)。
  3. 倒出上清到一个干净的玻璃管,并把它变成一个温水浴(40℃)。蒸发在氮气流下乙醇到终点体积(〜500微升)。冻结在-80℃的上清液4小时,并在一个冷冻干燥器回收低聚木糖干燥冷冻上清液。

4. MALDI-TOF-MS

  1. MALDI基质溶液的制备
    1. 加的2,5- dihydroxbenzoic苯甲酸(DHB)的小舀到含有0.1%甲酸的一管(MALDI-基质溶液)50%乙腈(500毫升)中。混合使用一个旋涡,如果迅速溶解,加DHB的另一个小瓢。注:MALDI-矩阵的理想解决方案浓度为10微克/微升-1。
  2. MALDI-目标板的制作
    1. 存款aqueo我们寡糖(本机)的样品(5-10微克)(W-溶胶和/或KOH-SOL)到MALDI-目标板。使用单独的尖端添加0.3微升的MALDI基质溶液和通过上下抽吸混合。使混合物在RT干燥。
      注意:正确干燥的样品应当包括向着光点的中心指向长针形晶体。如果存款是粘性和/或油污样品既可以过于集中或由盐,这些沉积物是不可能产生良好的光谱和样本应进一步纯化。
    2. 引入目标板进入MS源和正(+ IVE)离子模式。调整加速器电压到离子源1 19.0千伏和离子源2 16.3千伏调整激光功率,以大于70%。选择在MALDI-靶板样品当场单击开始,开始激光发射。
      注意:目标的所有区域不会产生信号。特定的点只会给一个信号,这或者是由于一些激光发射采样/基质混合物或晶体的特性的枯竭。
      1. 移动激光到目标的不同区域采集和平均在大约200随机光谱以获得满意的信号 - 噪声。

5. ESI-QTOF-MS

  1. 采用纳米HPLC加上使用RP电喷雾电离(ESI)飞行(QTOF)MS仪器在线色谱分离的四极时分析切木聚糖酶生成低聚糖(本机)C-18柱(75微米×150毫米; 3.5微米珠尺寸)。
    1. 所述木聚糖内切产生的含水寡糖混合物转移到小瓶中,并放入HPLC自动采样器。编程的5-80%在乙腈中,分别在流动相的0.1%(体积/体积)的水甲酸和0.1%(V / V)甲酸的梯度洗脱,经60分钟。
    2. 调节流速,以0.2微升/分钟。调整正离子模式中的扫描范围帘气体10,GS1 4,源温度100℃,离子喷雾电压2300伏,和去聚类电位50:300-1,600 米/ z和的0.5次/秒使用ESI源条件如下一扫描速率的五,运行LC色谱程序和洗脱低聚糖。所得到的总离子色谱(TIC)是由软件自动保存。
    3. 打开保存的TIC,并选择提取色谱图。在命令行中键入预期的群众(如 271,403,535,667,799 931 M / Z)。点击进入扫描色谱图。处理,根据制造商的说明14使用软件:ESI-QTOF MS色谱数据的选择离子扫描。

6. ESI- 质谱

  1. 插入1〜2微升每-O-甲基化的寡糖在50%乙腈样品放入使用注射器一纳米喷雾尖端(如由Pettolino 等人 1所记载的甲基化)。修剪使用玻璃切割器的纳米喷嘴以适合附连到MS的离散纳米喷雾支架。
  2. 根据预期的质量范围(200-1,500 米/ z)和帘气体至10,离子喷雾电压1,900 V和极性到正集的质量。
  3. 按下获取按钮以打开相关的窗口中,输入数据的文件名 ​​,以获得总离子扫描(ESI-MS 1)。然后按STOP按钮。
  4. 从产品的离子更改扫描类型片段的关注峰。输入感兴趣的质量( 如885 M / Z)产生碎片,并调整质量范围(200-900 M / Z)。按下获取按钮和调整碰撞能量(在化合物标签向上和/或向下),以实现母离子的整个碎片(885米/ z)和获得的片段离子扫描(ESI-MS 2)。
  5. 输入感兴趣( 如711 M / Z)片段离子的质量,并调整质量范围(200-720 米/ z)表示 。按采样按键的d调整碰撞能量,以达到前体离子的整个碎片(710 米/ z)和获得的片段离子扫描(ESI-MS 3)。

7. H 1 NMR光谱

  1. 溶解寡糖木聚糖内切生成混合物(KOH-溶胶,天然形式)(〜500微克)在D 2 O中(1.0毫升,99.9%)在一个塑料试管(15毫升)中。冻结在-80℃的悬浮液4小时,在冷冻干燥机以回收低聚木糖干燥冰冻的悬浮液中。
  2. 为了与D 2 O.充分交流的H 2 o重复两次7.1
  3. 溶解干燥的寡糖在D 2 O中(0.6ml毫升,99.9%),并添加丙酮的0.5微升(在D 2 O中的5%)作为内标。转移氘化寡糖进入NMR样品管中。
  4. 持由顶部核磁共振含有管样品,并在塑料离心器插入样品管。放置在采样深度尺微调。脓H或拉该样品管以调节样品的深度,以保证样品的顶部和底部深度计的中心线是相等的。
  5. 除去深度规和插入所述试样附连到配备有冷冻探针的600MHz的NMR波谱仪自动采样器。
  6. 登录和开放式光谱仪控制软件。输入样品文件名。打开现有的数据集,然后使用“EDC”命令将其保存到一个新的名称。键入样品的位置一批在自动进样器,然后按“ENTER”。
    注:按“ENTER”键会轻轻滴样品管的磁铁孔中,其中,将被定位在探针的顶部。
  7. 通过在命令行中输入“edte”设置所需的样品温度。等待样品温度继续下一步骤之前达到所需的值。进入“锁定”在命令行,并选择适当的溶剂(D 2 O)。等待"锁定完成“的消息显示在窗口的底部。
  8. 键入“ATMM”在命令行,然后单击“优化”的ATMM菜单栏的顶部。选择启动调谐和探针匹配所选通道(在此情况下1H)。
  9. 在为垫补过程中,轻微的调整对磁场做出直到均匀磁场通过在命令行中输入“ZG”,进入周围的sample.Acquire实现了信号命令行中键入“topshim”。
  10. 分析根据制造商的使用在2.225 ppm的参考丙酮的内标1小时的化学位移说明使用软件15光谱。

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Representative Results

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的木聚糖内切消化2AB标记的W-溶胶AXS生成2AB标记的RE寡糖的混合物和一系列从木聚糖链( 图1中的内部区域衍生的未标记的(无2AB标签)寡糖;从Ratnayake 等人2)。然后将一系列的色谱方法被用来分馏异构体的复杂混合物。最后,MS技术被用于识别异构结构,然后由质谱技术测序。这里,我们提出的代表,而不是该方法的全面的,例子。

在从2AB标记的天然的W-溶胶AXS( 图2A)衍生的寡糖的MALDI-TOF-MS谱的信号包括在m /高度丰富的伪分子离子Z系列701,833,和965表示了一系列的未标记内部中性区域低聚糖分别5-7戊糖残基(P 5-7)。一系列在m / z 745,877,1009的信号,指定该未标记酸性低聚糖系列,以P 4-6 + HexA的1(己糖醛酸),也存在于该馏分( 图2A)。m / z 821和953的伪分子离子指 ​​示2AB标记的原始RE寡糖P 5-6 + 2AB的存在下,分别。

然后,进行与通过RP C-18 HPLC寡糖的在线色谱分离天然寡糖:ESI-QTOF-MS分析。 图2B图2C,示出了所选择的离子扫描,从:ESI-QTOF-MS总离子提取图(TIC),从W-溶胶AXS神父被切木聚糖酶释放的寡糖的。这些信号包括分配为[M + NH 4] +m伪分子离子系列/ Z 696,828,960,1092 1224号和第1356表示具有5-10戊糖残基(P 5-10),分别为( 图2B)的一系列内部区域中性寡糖。几个异构体结构是可能为一限定质量的寡糖(见下文:ESI- 质谱分析)。如在图2B中观察到的,因此对每个分子离子扫描的多个峰值是可能的。被指定为[M + H] +m / z 271,403,535,667,799,和931的伪分子离子指 ​​示2AB的存在标记的RE寡糖序列P 1-6 + 2AB,分别( 图2C) 。检测为信号[M + H] +离子在m / z 613,745,877,1009 1141号和第1273表明酸性寡糖其中P 3-8 + HexA的1,分别为( 图2C)的存在。在commelenid单子叶植物,木聚糖主链也可以与酚酸取代主要阿魏酸(以及p -coumaric酸),它具有相同的分子质量为葡糖醛酸,并且可以在小麦胚乳细胞壁的W-溶胶AXS来检测。然而,使用ESI- 质谱 W-和KOH溶胶AXS的进一步分析(和组成由TMS衍生物的GC-MS分析如下甲醇分解分析;在这里未示出)确认为P 3-8 + HexA的1小麦胚乳酸性低聚糖AXS。

被指定为[M + H] + 3.10-3.48分钟之间的区域的ESI-Q-TOF全扫描谱的离子( 图2D)包括串联2AB标记的RE寡糖的信号:M / Z 271,403,535, 667,799,931,1063和1195(P + 1-8 2AB,分别)。 3.59-4.05分钟之间的串联在该区域的。ESI-Q-TOF全扫描谱伪分子离子( 图2E)表示内部区域酸性低聚糖观察-d作为既[M +的Na] +离子:M / Z 613,745,877,1009和1141(P 3-7 + HexA的1,分别地)和[M + NH 4] +离子:M / Z 740, 872,1004,1136,和1268(P 4-8 + HexA的1,分别地)。

为了测序单个寡糖,我们进行ESI-MS上的N次O-甲基化的寡糖,而不是因为它是具有挑战性的通过测序天然寡糖明确分配结构从W-溶胶和KOH溶胶AXS得到的天然寡糖。此外,这还需要材料的更大的数量。寡糖的甲基化作为由Pettolino 等人所述进行。1。在ESI-MS N于从KOH-溶胶AXS得到的RE中性寡糖糖醇进行调查,并标有2AB从W-溶胶AXS衍生中性RE寡糖描述贝罗瓦特作为一个例子在光谱和推导的结构的解释协助。同样的方法可以应用到从酶水解所产生的所有寡糖。在ESI- 质谱光谱碎片离子是根据土门&科斯特洛确定为Y和B离子。(多个)的气相碎裂过程中产生的16取消甲基羟基每-O-甲基化的寡糖在质谱提供了一个可用于鉴定分支模式和糖基的序列12-13由碎片事件产生的每个瘢痕14Da质量差“疤痕”标记为一个实线( 图34)。作为几个异构体结构是可能为一限定的质量,然后在这些异构体的结构,Y和B离子被分别标记为在红色和黑色。

的ESI-MS 2中 ,ESI-MS 3和ESI-MS 4 SPECT从伪分子离子M / Z 885的碎裂产生的每-O-甲基化的稀土中性低聚葡糖基糖醇的RA(P 4 +的Xyl )示于图3,ESI-MS 2谱包括丰富ÿ离子在m / z 711,551,和391通过一个,两个和三个戊糖残基,分别损失产生,从母离子。可以通过一个非还原末端的Xyl残基的任一损失或由终端侧链阿糖胞苷残基的损耗来产生丰富的M / Z 711离子。在所得的光谱诊断ýM / Z 391离子可以从损失来产生三个非还原从具有对再生的Xyl 残基或具有对RE寡糖侧链阿糖胞苷剩余物对RE寡糖端的Xyl残从再生的Xyl 残基的 2 的Xyl残基侧链阿糖胞苷残基。虽然有正式的可能性的其他结构,如XYL 4 -Xyl ,和(阿糖胞苷)的Xyl-的Xyl-的Xyl-木糖会引起这 碎片离子这些结构被排除在考虑与用于裂解多糖要么降解或不分别劈开在一个分支点邻近糖苷键,内切木聚糖酶的特异性。相应地,可以从损失来生成诊断ýM / Z 551离子两个非还原从具有在任一再生的Xyl 残基或具有侧对RE寡糖侧链阿糖胞苷剩余物对RE寡糖端的Xyl残在倒数第二木糖渣链阿糖胞苷残留。因此,四个可能的异构体的结构,可以建议( 图3:I,II,III和IV)。丰富的ÿ离子M / Z 377(参见图3:Ⅰa和Ⅱa族)和B离子M / Z 503(参见图3:IA,IB,阴入,阳)从异构体m有关碎片产生/ Z 711离子也在此光谱中观察到。通过的同分异构体微米碎片记录ESI-MS 3谱( 3)/ Z 711离子包含在m的主要峰/ Z 537(磷ý离子2 +木糖具有两个疤痕;从该前体离子IA生成,IB,IIA,IIB,IIIA,IIIB,IVA和IVb)中和m / z 391(P 1 +木糖与一种瘢痕ý离子;从所述前体离子ⅡB,ⅢA,ⅢB,ⅣA生成和IVb)中。这两个主要的峰(M / Z 537 m / z 391)可以通过一个和两个非还原末端的Xyl残基,分别损失产生,从来自伪的碎裂产生的同分异构体M / Z 711离子分子模母离子M / ESI-MS 2ž885(P 4 +木糖 )。在m相对低丰度峰/ Z 377(P的Ÿ离子1 +木糖有两个疤痕;从precurso产生ř离子Ⅰa和Ⅱa)的和551(P 2 +木糖与一种瘢痕ý离子;从所述前体离子Ⅰb和Ⅱb族生成)在此谱中也观察到。

同分异构体M / Z的零散的ESI-MS 4 551离子包括在的主峰/ Z 377(P的Ÿ离子1 +木糖有两个疤痕)和m / z 391(P 1ÿ离子+一个疤痕,从结构的母离子I和II产生的木糖 )。因此,集体证据表明这些RE糖序列由连接到RE木糖残留阿糖胞苷侧链(诊断裂解途径M / Z 885→711→551→391, 图3II),连接到两个阿糖胞苷侧链RE木糖OL和倒数第二(从RE木糖 1 木糖渣)渣木糖(诊断裂解途径M / Z 885→711→537→391, 图3III),阿糖胞苷侧链连接到倒数第二第1木糖从RE木糖 )木糖渣(诊断裂解途径M / Z 885→711→537→377, 图3I)和阿糖胞苷侧链连接在从再生的Xyl 图3IV)第2 的Xyl残基。

这些离子的存在证实了提出的异构体结构Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ和中性RE寡糖结构: - [阿糖胞苷的F - (1→3)(+/-)-Xyl - (1→4) - [阿糖胞苷的F - (1→3)(+/-)-Xyl - (1→4) - [阿糖胞苷的F - (1→3)(+/-)-Xyl

每O-甲基化2AB的ESI-MS谱2标从fragm产生RE寡糖准分子的[M +的Na]的entation 离子m / z 871(P 4 + 2AB)在图4中该频谱包括在m / z 697(P 3 + 2AB与最丰富ÿ离子显示瘢痕),M / Z 537(P 2 + 2AB与疤痕)和m / z 377(P 1 + 2AB与疤痕),分别由一个,两个或三个非还原戊糖残基的损失产生。可以通过一个非还原末端的Xyl残基或由终端阿糖胞苷残基,而M / Z 537离子的损失或损失来产生M / Z 697离子只能通过两个终端的Xyl残基的丢失而产生。诊断裂解途径(M / Z 871→697→537→377)建议对应于准分子离子m,在对RE线性非支化木聚糖主链寡糖的存在/ Z 871(P 4 + 2AB )。然而,线性未被分支的骨干木糖(P 4 + 2AB)是susceptible现场具体切木聚糖酶的进一步消化。因此两种异构体M / Z 697离子可存在。因此两种可能的异构体的结构,提出( 图4:I和II)。在这些异构体结构Y和B离子被标记为红色和黑色分别。的ESI-MS 3谱从异构体的前体在m / z碎裂记录697离子产生M / Z 523离子(P 2 + 2AB的ý离子具有两个疤痕; 图4,结构IA,IB,IIa和IIb)中,m / Z 363离子(P 1 + 2AB的ý离子具有两个疤痕; 图4,结构IIa)中和在m / z 377Ý离子(P 1 + 2AB与疤痕; 图4,结构Ia和Ib)。在m / z 377的碎片离子只能从所提出的结构I和在m / z 363的碎片离子只能从所提出的结构II出现出现。这两种离子的同时存在证实了提出的结构I和II。从而小麦胚乳AXS的木聚糖链的稀土糖序列由连接到RE的Xyl残余物(裂解途径M / Z 871→697→523→363)和/或倒数第二的Xyl残余物(裂解途径M / Z的阿糖胞苷分支的871→697→523→377)。

在AXS的NMR分析

基于MS的分析不提供任一异头配置(α/β)或必须由其他方法,包括酶和物理(如 NMR)得到的糖的D / L的配置信息。用于与特性RE减少四糖(木糖-RHA-GALA-木糖 )heteroxylans,NMR谱包含导致这种稀土寡糖的识别和测序端基异构信号。我们描述了使用600兆赫1D 1 H-NMR光谱学,为单一的步骤的方法来DET貂在KOH溶胶星期五的小麦胚乳AX RE寡糖,包括异头配置(α/β)和糖的D / L构的完整糖基序列。共振被分配小麦AX低聚糖17-18公布分配( 图5, 表1)的基础上。从小麦胚乳中提取的AX的1 H-NMR光谱是通过异头化学位移在5.39,5.27和5.22 ppm的分配给一个终端α-L-阿拉˚F残基的质子,附着到O-3的位置为主(T-α-L-阿拉˚F→3 S)的单独使用支链的(1,4)-β-的Xyl p骨架残基和两个O-3和O-2的位置(T-α-L-阿拉˚F→3 D和双支链的(1,4)-β-的Xyl p的骨架残基,分别为( 图5表1)的T-α-L-阿拉˚F→2 D)。

˚F→3 S + D)的 α-L-阿糖的F H 1信号侧链连接到单独支链β-D-木糖p残基的O-3的位置与相邻的双支β-D-木糖 。在5.29的信号被分配给(T-α-L-阿拉˚F→3 D + D)的附连到双支链β-D-木糖的O-3位α-L-阿拉F侧链的H1信号与相邻的双支β-D-木糖p p残基在5.24的信号被分配到(T-α-L-阿拉˚F→2 D)+(D)的附连到α-L-阿拉F侧链的H1信号与毗邻的双支β-D-木糖p中的双支β-D-木糖渣p的O-2的位置。

图1

<p系列=“jove_content”FO:保together.within页=“1”> 图1. 概述实验方法的产生,净化和测序还原端(RE)所采用的策略的总结和内部区域的低聚糖小麦胚乳阿拉伯木聚糖(AXS)所示。这个数字已被复制与Ratnayake 权限。 (2014年)2。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. MALDI-TOF MS(A)和ESI-QTof质谱仪(B - E)从2AB通过切木聚糖酶释放的标记W-溶胶AXS天然低聚糖分析,如图1 MALDI-TOF MS谱概述:(A)(的信号的重新确定为[M +的Na] +加合离子);在ESI-QTof质谱仪色谱选择离子扫描: = P 5-10从内部区域低聚糖衍生(的信号被认定为[M + NH 4 +加合离子); C = P + 1-6 2AB从RE派生寡糖(该信号被确定为[M + H] +加合离子)普3-8从酸性低聚糖衍生(的信号被确定为[M +的Na] +加合离子); D = ESI-Q-TOF满扫描谱:3.10-3.48分钟,E = ESI-Q-TOF全扫描谱之间的区域:区域3.59-4.05分钟之间(的信号被确定为既[M +的Na] +和[M + NH 4] +加合离子); P =戊糖单位(阿糖胞苷或木糖); G = uronosyl残渣(中,GlcA); RE =还原端低聚糖; 2AB = 2氨基苯甲酰胺; EIC:提取离子色谱。广告/ 53748 / 53748fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
3. ESI-MS 2,ESI-MS 3和ESI-MS谱4每-O-甲基化RE中性糖糖醇(P 4 +木糖 ) -的信号被指定为[M M / Z 885 +钠] +伪分子离子加合物。作为一个定义质量的几个异构体结构是可能的再异构体结构Y和B离子分别标记为红色和黑色。由碎片事件产生的每一个“伤疤”被标记为实线。 X =木糖渣; A =阿拉伯糖渣。在ESI-MS谱3已被复制与Ratnayake 权限。 (2014)2。748fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. ESI-MS 2和ESI-MS 3%-O-甲基化2AB光谱标记中性RE寡糖(P 4 + 2AB) -的信号被指定为[M +钠] M / Z 871 +伪分子模离子加合物。作为用于定义质量数的异构体结构的异构体结构是可能的,Y和B离子被分别标记为在红色和黑色。由碎片事件产生的每一个“伤疤”被标记为实线。 X =木糖渣; A =阿拉伯糖渣。这个数字已被复制与Ratnayake 权限。 (2014年)2。 请点击此处查看大VERS这个数字的离子。

图5
图5. 由木聚糖内切处理KOH-溶胶Fr的产生对AX寡糖的600兆赫1D 1 H-NMR光谱的端基异构区域 1小时的化学位移在2.225 ppm的参考丙酮的内标。 T-α-L-阿拉˚F→3 S:连到单独支链β-D-木糖p残基的O-3位α-L-阿拉F侧链的H1信号; T-α-L-阿拉˚F→2 D:附着到双支链β-D-木糖p残基的O-2位α-L-阿拉F侧链的H1信号; T-α-L-阿拉˚F→3 D:附着到双支链β-D-木糖p残基的O-3位α-L-阿拉F侧链的H1信号; ŧ-α-L-阿糖胞苷˚F→3 S + D:附着到单独支链β-D-木糖p残基的O-3位置α-L-阿拉F侧链的H1信号毗连双重支链β-D-木糖 ; T-α-L-阿拉˚F→2 D)+(D:附着到双支链β-D-木糖p残基的O-2位置用α-L-阿拉F侧链的H1信号毗连双重支链β-D- -Xyl ; T-α-L-阿拉˚F→3 D + D:附着到双支链β-D-木糖p残基的O-3位置α-L-阿拉F侧链的H1信号毗连双重支链β-D- -Xyl ; 2-α-L-阿拉˚F→3 S:附着在单支β-D-木糖p残留的O-3位2-α-L-阿拉F侧链残基H1信号, 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。

糖残基 H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-4 / C-4 H-5 当量 / C-5 H-5 AX / C-5
T-α-L-阿拉伯糖→3 S 5.396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-阿拉伯糖 5.415 / 4.18 3.95
→3 S + D
T-α-L-阿拉伯糖→2 D 5.223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-阿拉伯糖→2 D + D 5.243 / 4.16 3.98
T-α-L-阿拉伯糖→ 三维 5.272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-阿拉伯糖→ 三维+ D 5.298 / 4.18 3.96
2-α-L-阿拉伯糖→3 S 5.548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
α-Xylp(减少) 5.185 / 91.9 3.55 3.72
β-Xylp(减少) 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4- Xylp 4.470 / 3.32 3.58
β-4- Xylp + S 4.461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4- Xylp + D 4.448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-3,4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
S +β-3,4-Xylp 4.514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
(D)+β-3,4-Xylp 4.505
β-3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4.482 3.45 3.74
β-2,3,4- Xylp 4.638
S +β-2,3,4- Xylp 4.627 3.59 3.87 3.88
(D)+β-2,3,4- Xylp 4.616
β-2,3,4- Xylp + S 4.593
β-2,3,4- Xylp + D 4.593
化学位移相对于内部丙酮报道,δ2.225。
S =单支β-Xylp
S + D =单支β-Xylp +双支β-Xylp
D =双支β-Xylp
D + D =双支β-Xylp +双支β-Xylp

表1. 由小麦胚乳的KOH溶胶Fr的木聚糖内切治疗产生的低聚木糖的 1 H-NMR信号

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Discussion

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大多数基质相细胞壁多糖似乎已经无规取代的主链(有两个糖基和非糖基残基),根据植物物种,发育阶段和组织类型3是高度可变的。由于多糖是次级基因产物的序列没有模板产生的,因此没有单一的分析方法,例如存在对于核酸和蛋白质,它们的测序。纯化的特定键的水解酶的可用性提供了一个有力的工具来降解多糖寡糖然后,可以是色谱分馏,和结合的化学和物理技术使用时完全测序。面临的挑战是,然后重新组装这些复杂混合物成原来的多糖序列 - 一个是仍是成功的解决。

这里我们介绍一种方法(应用钙的秩序n为变化),它依赖于建立的酶,化学和两个还原端(RE)和heteroxylans的内部区域的糖基序列(多个)的结构表征物理技术的融合。这里不作说明一个额外的补充技术,该技术已被证明是非常有用表征低聚糖是由杜普里19组开发PACE(由碳水化合物凝胶电泳的多糖分析),它可以很容易地融入了这个协议,如果该设备可用。此外,在LC色谱变化也可能是有用的,如随后通过RP色谱串联联亲水性相互作用色谱(HILIC)提供在一个单一的步骤中分离出两个未标记/标记的寡糖的可能性。该技术依赖于之前的酶(木聚糖酶)水解heteroxylan链的标记(与2氨基苯甲酰胺(2AB))还原性末端(RE)。两种不同的方法(见汇总图1)通过。在第一,完整的W-溶胶AXS用2AB处理来标记原始RE主链糖残基,然后用木聚糖内切处理,以生成2AB标记的RE和内部区域分别还原的低聚糖,的混合物。在第二种方法中所述的KOH溶胶星期五与内木聚糖酶水解成第一生成其随后用2AB标记的寡糖的混合物。在后一种情况下的KOH溶胶AX的原始RE不会与2AB标记,因为它已经包含还原剂,硼氢化钠(NaBH 4还原)碱提取过程中被还原为糖基-糖醇。因此,2AB标记的寡糖生成后的木聚糖酶消化,将来自“内部”的寡糖和原稀土寡糖发起将包含未经2AB标记在RE糖醇(参见图1)。这种方法还可以应用到其它类多糖的U唱(如果有的话),相应的内切水解酶。

基于MS的方法是显著的寡糖的甲基化木聚糖酶处理后生成的增强,因为在MS每-O甲基化低聚糖的气相碎裂过程中产生的n个未甲基羟基(S)提供了一个14Da质量差“伤痕“可用于帮助分支图案的标识和糖基序列5-6的戊糖的 ​​残基(和任何糖残基)的身份不能从单独的MS数据制成,但来自具有的知识分子的组合物;其中,这是不可用,相关的单糖和联动分析必须先于质谱使这些任务来执行。另外对应于RE酸性寡糖的糖醇,来自KOH溶胶星期五产生的信号(的Xyl 3 -MeGlcA-木糖醇:M / Z 761)和通道aracteristic双子叶木聚糖RE糖基序列(的Xyl 2 -RHA-GALA-木糖醇:M / Z 761),如果存在的话,不能够被区分为两个已在天然形式相同的分子量,但可以从他们的MS裂解来区分( MS N)谱是在甲基化低聚糖最好的执行。最后,基于MS的技术不能提供在任一异头的配置信息(α/β)的糖苷键或sugars-的D / L构的这必须通过其他方法,其中包括确定酶和物理(如 NMR)。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

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References

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使用酶法,化学(甲基化)和物理(质谱,核磁共振)技术,植物墙Heteroxylans测序
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Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

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