Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken zur Charakterisierung verwendet Ende Reduktions (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz (en) von Heteroxylane. De-gestärkten Weizen Endosperm Zellwände wurden als Alkohol unlösliche Rückstand (AIR) 1 und der Reihe nach mit Wasser (W-sol Fr) und 1 M KOH , die 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) extrahiert isoliert , wie von Ratnayake et beschrieben al. (2014) 2. Zwei verschiedene Ansätze (siehe Zusammenfassung in Abbildung 1) angenommen werden . In der ersten werden intakte W-sol AXs mit 2AB behandelt, um die ursprüngliche RE Hauptkette Zuckerrest zu markieren, und dann mit einem Endoxylanase behandelt, um eine Mischung aus 2AB-markiertem RE und inneren Bereich Reduktions Oligosaccharide zu erzeugen, respectively. In einem zweiten Ansatz wird die KOH-sol Fr mit Endoxylanase hydrolysiert, zuerst eine Mischung von Oligosacchariden zu erzeugen, die mit 2AB anschließend markiert sind. Die enzymatisch veröffentlicht ((un) markiert) Oligosaccharide aus beidenW- und KOH-sol Frs sind dann methyliert und die detaillierte Strukturanalyse sowohl die nativen und methylierte Oligosaccharide erfolgt eine Kombination von MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS und ESI-MS n verwenden. Endoxylanase verdaut KOH-sol AXs werden auch durch kernmagnetische Resonanz gekennzeichnet (NMR), die auch Informationen über die anomere Konfiguration liefert. Diese Techniken können auf andere Klassen von Polysacchariden angewendet werden, um die entsprechenden endo-Hydrolasen verwendet.
Introduction
Heteroxylane sind eine Familie von Polysacchariden , die die vorherrschenden nicht-cellulosischen Polysacchariden der Primärwänden von Gräsern und den sekundären Wänden aller Angiospermen 3-6 sind. Die Xylan - Backbones unterscheiden sich in ihren Typen und Muster der Substitution mit Glykosyl (Glucuronsäure (GlcA), Arabinose (Araf)) und nicht-Glycosyl (O-acetyl, Ferulasäure) -Reste je nach Gewebetyp, Entwicklungsstadium und Art 7.
Wände aus Weizen (Triticum aestivum L.) Endosperm bestehen hauptsächlich aus Arabinoxylane (AXs) (70%) und (1 → 3) (1 → 4) zusammengesetzt -β-D-Glucane (20%) mit geringen Mengen an Cellulose und heteromannans (je 2%) 8. Die Xylan-Rückgrat kann verschieden un-substituiert sein und überwiegend mono-substituierte (hauptsächlich O-2-Position und in einem geringeren Ausmaß O-3 Position) und di-substituierte (O-2 und O-3-Positionen) mit α-L-Ara f Reste 9. Das Reduktions Ende (RE) von heteroXylane aus dikotylen Pflanzen (beispielsweise Arabidopsis thaliana) 10 und Gymnospermen (beispielsweise Fichte (Picea abies)) 11 enthält eine charakteristische Tetrasaccharid Glycosyl - Sequenz; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Um zu verstehen, heteroxylan Biosynthese und Funktion (biologische und Industrie), ist es wichtig, um vollständig die Xylan-Hauptsequenz die Typen und die Muster der Substitutionen sowie die Sequenz des reduzierenden Ende (RE) zu verstehen.
Spezifische Techniken zur strukturellen Charakterisierung von reduzierenden Ende (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz (en) von Heteroxylane sind in diesem Manuskript beschrieben. Die Techniken beruhen auf Fluorophore (mit 2 Aminobenzamid (2AB)) das reduzierende Ende (RE) der heteroxylan Kette vor der enzymatischen (Endoxylanase) Hydrolyse Tagging. Dieser Ansatz, insbesondere für die RE Sequenzierung wurdezuerst vom Labor Yorker berichtet 10,12-13 aber jetzt sind der innere Bereich Sequenzierung erweitert und ist eine Kombination von etablierten Techniken, die für alle Heteroxylane unabhängig von ihrer Quelle der Isolation ebenso anpaßbar ist. Dieser Ansatz kann auch auf andere Klassen von Polysacchariden verwendet (soweit verfügbar) die entsprechenden endo-Hydrolasen angewendet werden.
In der vorliegenden Studie de-gestärkte wheat endosperm Zellwände wurden als ein in Alkohol unlösliche Rückstand (AIR) und der Reihe nach mit Wasser (W-sol Fr) und 1 M KOH , enthaltend 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) extrahiert wie beschrieben isoliert in Ratnayake et al. (2014) 2. Die freigesetzten Oligosaccharide von beiden W- und KOH-sol Frs dann methyliert und die detaillierte Strukturanalyse von sowohl den nativen und methylierte Oligosaccharide erfolgt mit einer Kombination von MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-Verbindung mit HPLC mit der Verwendung Online chromatographische Trennung einer RP C-18-Säule unter Verwendung vonund ESI-MS n. Endoxylanase verdaut KOH-sol AXs auch durch magnetische Kernresonanz (NMR) charakterisiert wurde.
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Protocol
1. Kennzeichnung des reduzierenden Ende (RE) Zuckerrest von W-sol AXs mit 2-Aminobenzamid (2AB)
- Inkubieren W-sol AXs mit 2AB (0,2 M) in Gegenwart von 1 M NaBH 3 CN (Natriumcyanoborhydrid) (pH 5,5) für 2 Stunden bei 65 ° C , um die reduzierenden Enden der Polysaccharid - Hauptketten in ihre fluoreszierenden Derivate umzuwandeln.
ACHTUNG: Der folgende Schritt sollte im Abzug durchgeführt werden , wie NaBH 3 CN frei giftige Zyanid Gas , wenn es mit Wasser in Kontakt ist.- Abwiegen NaBH 3 CN (62,8 mg) und in Wasser (1 ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) lösen , um eine 1 M NaBH 3 CN - Lösung herzustellen. Auflösen 2AB - Reagenz (27,2 mg) in 1 M NaBH 3 CN - Lösung (1 ml) durch Erhitzen auf 65 ° C und den pH - Wert des Reaktionsgemisches (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) bis pH 5,5 mit 10% Essigsäure eingestellt werden .
- In 200 ul Reaktionsmischung (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) zu W-sol AXs (1 mg) in einem Glasrohr mit einer Kappe und mischen Sie einen Vortexer. Inkubieren für 2 h bei 65 ° C in einem Abzug. Man kühlt die Suspension auf RT und fügen 4 Bde. absolutem Ethanol.
- Platzieren Sie die Suspension in einem Kältespeicher (4 ° C) O / N auszufällen Polysaccharide.
- Zentrifuge (1500 xg, 10 min, RT) Überstand zu entfernen. Waschen des Pellets extensiv mit absolutem Ethanol (4 x), Aceton (1x) und Methanol (1x), zwischen jeder Wasch Zentrifugieren. Vakuum trocken bei 40 ° CO / N.
Hinweis: gründliches Waschen entfernt auch Rest 2AB.
2. Erzeugung von Xylo-Oligosaccharide aus 2 AB Labelled W-sol AXs
- Auflösen 2AB W-sol AXs (1 mg) in 500 & mgr; l Natriumacetat-Puffer (100 mM, pH 5) in einem Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) markiert. In 4 Einheiten Endoxylanase (GH 11, [M1]) und Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden.
- Zerstören Sie die Enzymaktivität durch die Reaktion mixt Heizungure für 10 min in einem kochenden Wasserbad. Man kühlt die Suspension auf RT und Transfer zum Glasrohr mit einer Kappe. In 4 Bde. absolutem Ethanol gelöst und die Suspension in einem Kühllager Ort (4 ° C) O / N keine unverdaute Polysaccharide auszufällen.
- Zentrifuge (1500 xg, 10 min, RT) unverdaute Polysaccharide (Pellet) und Endoxylanase erzeugt Xylo-Oligosaccharide (Überstand) zu trennen. Dekantieren Überstand in ein sauberes Glasröhrchen und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad (40 ° C).
- Man dampft das Ethanol unter einem Strom von Stickstoffgas zu einem Endpunkt Volumen (~ 500 & mgr; l). Frieren Sie den Überstand bei -80 ° C für 4 Stunden und Trocknen des gefrorenen Überstand in einem Gefriertrockner Xylo-Oligosaccharide zu erholen.
3. Erzeugung von Xylo-Oligosaccharide aus KOH-sol AXs und 2AB Kennzeichnung
- Behandeln KOH-sol AXs mit Endoxylanase (GH 11, [M1]) Xylo-Oligosaccharide zu erzeugen, wie oben (Abschnitte 2.1-2.4) beschrieben.
- Treat Endoxylanase erzeugt Xylo-Oligosaccharide aus KOH-sol AXs mit 2AB Reaktionsgemisch (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) , wie oben (Abschnitte 1.1.1-1.1.2) beschrieben.
- Dekantieren Überstand in ein sauberes Glasröhrchen und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad (40 ° C). Man dampft das Ethanol unter einem Strom von Stickstoffgas zu einem Endpunkt Volumen (~ 500 & mgr; l). Frieren Sie den Überstand bei -80 ° C für 4 Stunden und Trocknen des gefrorenen Überstand in einem Gefriertrockner Xylo-Oligosaccharide zu erholen.
4. MALDI-TOF-MS
- Herstellung von MALDI-Matrix-Lösung
- Eine kleine Kugel 2, 5-dihydroxbenzoic Säure (DHB) bis 50% Acetonitril (500 ml), enthaltend 0,1% Ameisensäure in einem Rohr (MALDI-Matrix-Lösung). Mischen Sie einen Wirbel verwenden, wenn es sich schnell auflöst, fügen Sie eine weitere kleine Kugel DHB. Hinweis: Ideal Konzentration von MALDI-Matrix - Lösung beträgt 10 ug / ul -1.
- Herstellung von MALDI-Zielplatte
- Hinterlegung der aqueouns Oligosaccharid (nativ) Proben (5-10 ug) (W-Sol und / oder KOH-sol) auf eine MALDI-Zielplatte. Zugabe von 0,3 ul MALDI-Matrix-Lösung eine separate Spitze mit und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Lassen Sie die Mischung bei RT trocknen.
Hinweis: Richtig getrockneten Proben von langen nadelförmigen Kristallen bestehen sollte in Richtung der Mitte des Flecks zeigt. Wenn die Ablagerung klebriger ist und / oder schmierige die Probe entweder zu konzentriert sein kann, oder aus Salzen sind solche Ablagerungen unwahrscheinlich gute Spektren zu erzeugen, und die Probe sollte weiter gereinigt werden. - Führen Sie die Zielplatte in die MS Quelle und arbeiten in positiver (+ ive) Ionenmodus. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 19,0 kV bei Ionenquelle 1 und 16,3 kV bei Ionenquelle 2. Stellen Sie die Laserleistung auf mehr als 70%. Wählen Sie den Probenpunkt auf der MALDI-Zielplatte und klicken Sie auf Start Laserschüssen zu beginnen.
Hinweis: Alle Bereiche des Ziel werden keine Signale ergeben. Eine bestimmte Stelle wird nur ein Signal für ein paar Laserschüsse aufgrund entweder gebenAbreicherung der Probe / Matrix-Mischung oder Eigenschaften des Kristalls.- Bewegen Sie den Laser auf verschiedene Bereiche des Targets während der Erfassung und durchschnittlich etwa 200 Zufalls Spektren zufriedenstellendes Signal-zu-Rauschen zu erhalten.
- Hinterlegung der aqueouns Oligosaccharid (nativ) Proben (5-10 ug) (W-Sol und / oder KOH-sol) auf eine MALDI-Zielplatte. Zugabe von 0,3 ul MALDI-Matrix-Lösung eine separate Spitze mit und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Lassen Sie die Mischung bei RT trocknen.
5. ESI-QTOF-MS
- Analysieren Endoxylanase-generierte Oligosaccharide (nativ) unter Verwendung von Nano-HPLC gekoppelt mit einem Elektrospray-Ionisation (ESI) Quadrupol-Flugzeit (QTOF) MS-Gerät mit Online-chromatographische Trennung unter Verwendung einer RP C-18-Säule (75 & mgr; m × 150 mm; 3,5 & mgr; m Wulst Größe).
- Übertragen Sie die Endoxylanase-generierte wässrigen Oligosaccharide Mischung in ein Fläschchen aufnehmen und in die HPLC-Autosampler. Programmieren des Elutionsgradienten von 5-80% mit den mobilen Phasen 0,1% (v / v) Ameisensäure in Wasser und 0,1% (v / v) Ameisensäure in Acetonitril jeweils über 60 min.
- Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 ml / min. Stellen Sie den Positiv-Ionen-Modus im Scan-Bereichvon 300-1,600 m / z und einer Scan-Geschwindigkeit von 0,5 Scans / Sekunde die ESI - Quelle Bedingungen wie folgt: Vorhanggas 10, GS1 4, Quellentemperatur 100 ° C, Ionensprayspannung 2300 V, und de-Clustering Potential 50 V. Führen Sie das LC-chromatographischen Programm und elute Oligosaccharide. Die sich ergebende Gesamt Ionenchromatogramm (TIC) automatisch durch die Software gespeichert.
- Öffnen Sie die gespeicherte TIC und wählen Extrakt Chromatogramm. Geben Sie die erwarteten Massen (zB 271, 403, 535, 667, 799 und 931 m / z) in der Befehlszeile. Scan-Chromatogramm durch Eingabe klicken. Verarbeiten Sie die ausgewählten Ionen Scans der ESI-MS QTOF Chromatogrammdaten unter Verwendung von Software gemäß den Anweisungen des Herstellers 14.
6. ESI-MS n
- Legen 1 bis 2 & mgr; l per-O-methylierten Oligosaccharid (methyliert , wie durch Pettolino et al. 1) Probe in 50% Acetonitril in eine Nanospray - Spitze mit einer Spritze. Trimmendie Nano-Spritzdüse ein Glasschneider in der diskreten Nanospray Halter an der MS angebracht zu passen.
- Stellen Sie die Masse entsprechend der erwarteten Massenbereich (200-1.500 m / z) und Vorhanggas bis 10, Ionensprayspannung bei 1.900 V und Polarität positiv.
- Drücken Sie die Taste acquire entsprechende Fenster zu öffnen, geben Sie Datendateiname eine Gesamtionen Scan (ESI-MS 1) zu erhalten. Dann drücken Sie die STOP-Taste.
- Ändern Sie Scan-Typ von Produkt-Ion einen Spitzenwert von Interesse zu fragmentieren. Geben Sie die Masse von Interesse (zB 885 m / z) zu fragmentieren und stellen Sie den Massenbereich (200 bis 900 m / z). Drücken Sie die Taste Erfassen und stellen Sie die Kollisionsenergie ( nach oben und / oder unten in der Verbindung tab) gesamte Fragmentierung der Elternionen (885 m / z) zu erzielen und ein Fragment - Ion - Scan (ESI-MS 2) erwerben.
- Geben Sie die Masse von Fragment - Ionen von Interesse (zB 711 m / z) und stellen Sie den Massenbereich (200 bis 720 m / z). Drücken Sie die Taste ein acquired die Kollisionsenergie einzustellen gesamte Fragmentierung der Vorläuferionen (711 m / z) und erwerben ein Fragment - Ion zu erreichen scan (ESI-MS 3).
7. H 1 NMR - Spektroskopie
- Man löst Endoxylanase erzeugte Mischung von Oligosacchariden (KOH-sol, nativen Form) (~ 500 ug) in D 2 O (1,0 ml, 99,9%) in einem Kunststoff - Teströhrchen (15 ml). Fixieren Sie die Suspension bei -80 ° C für 4 Stunden und trocknen Sie die gefrorene Suspension in einem Gefriertrockner Xylo-Oligosaccharide zu erholen.
- Wiederholen 7.1 zweimal , um voll und ganz die H 2 O mit D 2 O austauschen
- Auflösen getrocknet Oligosaccharide in D 2 O (0,6 ml, 99,9%) und mit 0,5 & mgr; l Aceton (5% in D 2 O) als interner Standard. Übertragen Sie die deuterierten Oligosaccharide in der NMR-Probenröhrchen.
- Halten Sie das NMR-Röhrchen enthaltenden Probe von oben und legen Sie die Probenröhrchen in einem Kunststoff-Spinner. Legen Sie die Spinner in der Probe Tiefenmesser. Eiterh oder ziehen Sie die Probenröhrchen, die Tiefe der Probe anzupassen, um sicherzustellen, dass die Mittellinie der Probe oberen und unteren Tiefenmesser gleich sind.
- Entfernen Sie den Tiefenmesser und legen Sie die Probe in den Autosampler zu einem 600-MHz-NMR-Spektrometer mit einer Kryo-Sonde ausgestattet angebracht.
- Anmeldung und offene Spektrometer Steuerungssoftware. Geben Sie die Beispieldateinamen. Öffnen Sie eine vorhandene Datensatzes und verwenden Sie dann den "edc" Befehl, es zu speichern, um unter einem neuen Namen. Geben Sie die Positionsnummer der Probe im Autosampler und drücken Sie "ENTER".
Hinweis: Durch Drücken der Taste "ENTER" wird das Probenröhrchen sanft auf die Magnetöffnung fallen, wo sie an der Spitze der Sonde positioniert werden. - Stellen Sie die gewünschte Probentemperatur durch "versehenes Werkzeug" in der Befehlszeile eingeben. Warten für die Probentemperatur den gewünschten Wert erreicht hat, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Geben Sie "sperren" in der Befehlszeile ein und wählen Sie geeigneten Lösungsmittel (D 2 O). Warten Sie auf die & #34; verriegeln fertig "Meldung am unteren Rand des Fensters angezeigt werden.
- Geben Sie "ATMM" in der Befehlszeile und klicken Sie auf "optimieren" an der Spitze des ATMM Menüleiste. Wählen Sie für Tuning und Anpassung der Sonde für den gewählten Kanal (1 H in diesem Fall) zu starten.
- Geben Sie "topshim" in der Befehlszeile für den Shim-Prozess, in dem kleinere Anpassungen an das Magnetfeld vorgenommen werden, bis eine einheitliche Magnetfeld um das sample.Acquire das Signal durch Eingabe von "zg" in der Befehlszeile erreicht wird, und tritt ein.
- Analysieren Spektren unter Verwendung von Software 15 gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 1 H chemische Verschiebung auf einen internen Standard Aceton bei 2,225 ppm referenziert.
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Representative Results
Endoxylanase Verdau von 2AB-markiertem W-sol AXs eine Mischung aus 2AB-markiertem RE Oligosaccharide erzeugt , und eine Reihe von nicht-markiertem (ohne 2AB label) Oligosaccharide von den inneren Regionen der Xylan - Kette abgeleitet (1; von Ratnayake et al. 2). Eine Reihe von chromatographischen Vorgehensweisen wird dann die komplexe Mischung von Isomeren zu fraktionieren eingesetzt. Schließlich werden MS - Techniken die isomeren Strukturen zu identifizieren verwendet , die dann von MS n Techniken sequenziert werden. Hier präsentieren wir einen Vertreter, sondern als umfassende, Beispiel für den Ansatz.
Die Signale in der MALDI-TOF-MS - Spektrum von Oligosacchariden aus 2AB-markiertem nativen W-sol AXs (2A) abgeleitet sind , umfassen eine hoch reichlich Pseudomolekülionenreihe bei m / z 701, 833, und 965 repräsentiert eine Reihe von unmarkiertem neutral interneRegion Oligosacchariden mit 5-7 Pentosylreste (P 5-7), respectively. Eine Reihe von Signalen bei m / z 745, 877, und 1009 bezeichnen , daß ein unmarkiertes sauren Oligosaccharid - Serie, mit P + 4-6 HexA 1 (Hexuronsäure), ist auch in dieser Fraktion (Abbildung 2A). Pseudo-Molekülionen bei m / z 821 und 953 zeigen die Anwesenheit des 2AB-markiertem original RE Oligosaccharide P 5-6 + 2AB, respectively.
Die ESI-QTOF-MS - Analyse für die nativen Oligosaccharide mit einer On-line chromatographische Fraktionierung von Oligosacchariden durch RP C-18 - HPLC wird dann durchgeführt. 2B und 2C zeigt die ausgewählten Ionen Scans, extrahiert aus ESI-QTOF-MS - Ionenquellen Chromatogramm (TIC), von Oligosacchariden durch Endoxylanase von W-sol Fr AXs freigegeben. Die Signale umfassen eine Pseudo-Molekülionen Serie zugeordnet , wie [M + NH 4] + bei m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224 und 1356 eine Reihe von inneren Bereich neutralen Oligosaccharide mit 5-10 Pentosylreste (P 5-10), bzw. (2B) darstellt. Mehrere isomeren Strukturen sind möglich für ein Oligosaccharid einer definierten Masse (siehe unten ESI-MS n Analyse). Daher die mehrere Peaks für jedes der Molekülion - Scans sind möglich , wie in 2B beobachtet. Pseudo-Molekülionen zugeordnet , wie [M + H] + bei m / z 271, 403, 535, 667, 799 und 931 zeigen das Vorhandensein eines 2AB markiert RE Oligosaccharid Serie P 1-6 + 2AB, bzw. (2C) . Die Signale detektiert , wie [M + H] + Ionen bei m / z 613, 745, 877, 1009, 1141 und 1273 zeigen die Gegenwart eines sauren Oligosacchariden mit P + 3-8 HexA 1, bzw. (2C). In den commelenid monocots kann das Xylan Rückgrat auch mit Phenolsäuren ersetzt werden,primär Ferulasäure (und auch p -coumaric Säure), die die gleiche Molekülmasse wie Glucuronsäure und kann in W-sol AXs Weizen - Endosperm - Zellwand erkannt werden. Doch eine weitere Analyse von W- und KOH-sol AXs mit ESI-MS n (und Analysen der Zusammensetzung von GC-MS von TMS - Derivaten folgende Methanolyse, hier nicht gezeigt) bestätigen die sauren Oligosacchariden mit P 3-8 + HexA 1 in Weizen Endosperm AXs.
Die Signale zugeordnet , wie [M + H] + Ionen von ESI-Q-TOF Scan - Spektrum der Bereich zwischen 3,10 bis 3,48 min (2D) umfasst die Reihe von 2AB markiert RE Oligosaccharide: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063 und 1195 (P 1-8 + 2AB, respectively). Eine Reihe von pseudo-Molekülionen in der ESI-Q-TOF Scan - Spektrum der Bereich zwischen 3,59 bis 4,05 min (2E) stellen die interne Region saure Oligosaccharide beobachtend sowohl als [M + Na] + Ionen: m / z 613, 745, 877, 1009 und 1141 (P + 3-7 HexA 1, jeweils) und [M + NH 4] + Ionen: m / z 740, 872, 1004, 1136 und 1268 (P 4-8 + HexA 1, respectively).
Um die einzelnen Oligosaccharide zu sequenzieren, führten wir ESI-MS n auf die pro-O-methylierte Oligosaccharide und nicht auf den nativen Oligosaccharide aus W-sol und KOH-sol AXs erhalten , da es eindeutig ist eine Herausforderung an Strukturen zuweisen durch Sequenzierung nativen Oligosaccharide . Darüber hinaus erfordert auch größere Mengen an Material. Methylierungs der Oligosaccharide wurde durchgeführt , wie beschrieben von Pettolino et al. 1. Die ESI-MS n auf den RE neutralen Oligosaccharid Alditole durchgeführten Untersuchungen abgeleitet von KOH-sol AXs und 2AB markiert neutral RE Oligosaccharid abgeleitet von W-sol AXs belo beschrieben werdenw als ein Beispiel bei der Interpretation der Spektren und die abgeleitete Strukturen zu unterstützen. Der gleiche Ansatz kann aus enzymatischer Hydrolyse erzeugt alle Oligosaccharide aufgebracht werden. Die Fragmentionen in der ESI-MS n - Spektren wurden als Y und B - Ionen identifiziert gemäß Domon & Costello. 16 Un-methylierten Hydroxylgruppe (n) erzeugt , während der Gasphasen Fragmentierung der per-O-methyliert Oligosaccharide in MS n stellt eine 14Da Massendifferenz "Narbe" , die verwendet werden , um das Verzweigungsmuster und die Glycosyl - Sequenzen zu identifizieren. 12-13 Jede Narbe durch die Fragmentierung Ereignis wird als eine durchgezogene Linie markiert (3 und 4). Da mehrere isomere Strukturen möglich, dass eine definierte Masse, dann in diesen isomeren Strukturen, Y und B-Ionen werden in rot markiert bzw. Schwarz.
Die ESI-MS 2, ESI-MS 3 und ESI-MS 4 spectra von pro-O-methylierte RE neutral Oligo-Glycosyl Alditol erzeugt aus der Fragmentierung des Pseudo-Molekül - Ion m / z 885 (P 4 + Xyl ol) ist in Abbildung 3 dargestellt. Die ESI-MS 2 Spektrum umfasst die reichlich vorhandene Y Ionen bei m / z 711, 551 und 391 durch den Verlust von ein, zwei und drei , Pentosylreste erzeugt bzw. aus dem Stammion. Die reichliche m / z 711 - Ion kann entweder durch den Verlust eines nicht-reduzierenden terminalen Ende Xyl - Rest oder durch den Verlust eines terminalen Seitenketten - Ara - Rest erzeugt werden. Die diagnostische Y m / z 391 - Ion in dem resultierenden Spektrum kann aus dem Verlust von drei erzeugten nicht-reduzierenden Ende Xyl Rückstände aus der RE Oligosaccharid , das auf dem RE Xyl ol - Rest oder die RE Oligosaccharid mit einer Seitenkette Ara - Rest aufweist , der eine hat Seitenkette Ara Rückstand auf dem 2. Xyl Rückstand aus der RE Xyl ol Rückstand. Zwar gibt es eine formale Möglichkeit, daß andere Strukturen, wie beispielsweiseXYL 4 -Xyl ol und (Ara) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ol Anlass zu dieser würde Fragmention Diese Strukturen werden aus der Betrachtung als die Spezifität der endo-Xylanase verwendet, ausgenommen das Polysaccharid entweder spalten würde abzuspalten abbauen oder nicht an der glycosidischen Bindung benachbart zu einem Verzweigungspunkt, respectively. Entsprechend kann die Diagnose Y m / z 551 - Ion aus dem Verlust der beiden erzeugt werden , nicht reduzierenden Ende Xyl Rückstände aus der RE Oligosaccharid , das an der Seitenkette Ara - Rest entweder der RE Xyl ol - Rest oder die RE Oligosaccharid , das an der Seite hat Kette Ara Rückstand auf dem vorletzten Xyl Rückstand. Somit können vier möglichen isomeren Strukturen vorgeschlagen werden (Figur 3: I, II, III und IV). Das reichlich vorhandene Y - Ionen m / z 377 (siehe Abbildung 3: Ia und IIa) und B - Ionen m / z 503 (siehe Abbildung 3: Ia, Ib, IVa und IVb) von einer weiteren Fragmentierung der isomeren Vorläufer m erzeugt/ z 711 - Ion sind auch in diesem Spektrum beobachtet. Die ESI-MS 3 - Spektrum (Figur 3) durch die Fragmentierung von isomeren Vorläufers aufgezeichnet m / z 711 - Ionen bei m / z 537 einen Hauptpeak enthalten (Y Ionen P 2 + Xyl ol mit zwei Narben; erzeugt aus dem Precursor ion Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa und IVb) und m / z 391 (Y Ionen von P 1 + Xyl ol mit einer Narbe, aus dem Vorläufer erzeugten Ionen IIb, IIIa, IIIb, IVa und IVb). Diese zwei Hauptpeaks (m / z 537 und m / z 391) aus der Fragmentierung des pseudo von der isomeren Vorläufers m / z 711 - Ion erzeugt , die durch den Verlust von ein und zwei nicht-reduzierenden terminalen Xyl Reste jeweils erzeugt werden -Molekular Elternion m / z 885 (P 4 + Xyl ol) während ESI-MS 2. Relativ niedriger Abundanz Peaks bei m / z 377 (Y Ionen von P 1 + Xyl ol mit zwei Narben; erzeugt aus dem precursor Ion Ia und IIa) und 551 (Y - Ionen von P 2 + Xyl ol mit einer Narbe, erzeugt aus dem Vorläufer - Ionen - Ib und IIb) wurden ebenfalls in diesem Spektrum beobachtet.
Die ESI-MS 4 der Fragmentierung des isomeren Vorläufers m / z 551 - Ionen bei m / z 377 einen Hauptpeak enthalten (Y Ionen von P 1 + Xyl ol mit zwei Narben) und m / z 391 (Y Ionen von P 1 + Xyl ol mit einer Narbe) aus dem Vorläufer - Ionen von Strukturen erzeugt I und II. Daher schlug die kollektive Beweise dafür , dass die RE Glycosyl - Sequenz der an den RE Xyl ol Rückstand (m / z 885 → 711 → 551 → 391 Diagnose Fragmentierung Weg; Abbildung 3II) angebracht Ara Seitenkette besteht, Ara - Seitenkette an beide RE Xyl ol und das vorletzte (1 st Xyl Rückstand aus RE Xyl ol) Xyl Rückstand (Diagnose Fragmentierung Weg m / z 885 → 711 → 537 → 391, Figur 3I) und die, Fig 3III), Ara - Seitenkette an der vorletzten (1 st Xyl von RE Xyl ol) Xyl Rückstand (diagnostische Fragmentierungs Stoffwechselweg m / z 885 → 711 → 537 → 377 befestigt Ara - Seitenkette am 2. Xyl Rückstand aus der RE Xyl ol (Abbildung 3IV) angebracht ist .
Das Vorhandensein dieser Ionen bestätigt die vorgeschlagene isomeren Strukturen I, II, III und IV und die neutrale RE Oligosaccharid Struktur: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p.
Die ESI-MS 2 Spektrum von pro-O-methylierte 2AB markiert RE Oligosaccharid aus dem fragm erzeugtentation des quasi-molekularen [M + Na] + -Ion bei m / z 871 (P 4 + 2AB) ist in Figur 4 Dieses Spektrum umfasst das häufigste Y Ion bei m / z 697 (P 3 + 2AB mit einer gezeigt Narbe), m / z 537 (P 2 + 2AB mit einer Narbe) und m / z 377 (P 1 + 2AB mit einer Narbe), die durch den Verlust von entweder erzeugt, zwei oder drei nicht-reduzierenden Pentosylreste, respectively. Die m / z 697 - Ion kann entweder durch den Verlust eines nicht-reduzierenden terminalen Ende Xyl - Rest oder durch den Verlust eines terminalen Ara - Rest , während die m / z 537 - Ion nur erzeugt werden kann , durch den Verlust der beiden endständigen Xyl Rückstände erzeugt werden , . Der diagnostische Fragmentierungs Stoffwechselweg (m / z 871 → 697 → 537 → 377) vorgeschlagen , daß das Vorhandensein von linearen unverzweigten Xylan - Rückgrat Oligosaccharid (s) an der RE an die quasi-molekulares Ion m / z 871 (P 4 + 2AB entspricht ). Jedoch ist die lineare unverzweigte Xylosyl- Rückgrat (P 4 + 2AB) ist susceptible auf ortsspezifische Endoxylanase für die weitere Verdauung. Daher zwei isomeren m / z 697 Ionen existieren. Dementsprechend zwei möglichen isomeren Strukturen vorgeschlagen (Abbildung 4: I und II). In diesen isomeren Strukturen Y und B-Ionen werden in rot und schwarz markiert, respectively. Die ESI-MS 3 - Spektrum von der Fragmentierung von isomeren Vorläufers m / z aufgezeichnet 697 Ionen erzeugt m / z 523 - Ion (Y Ionen P 2 + 2AB mit zwei Narben, Figur 4, Strukturen Ia, Ib, IIa und IIb), m / z 363 - Ion (Y Ionen von P 1 + 2AB mit zwei Narben, Figur 4, die Struktur IIa) und Y - Ions bei m / z 377 (P 1 + 2AB mit einer Narbe, Figur 4, Strukturen Ia und Ib). Das Fragment-Ion bei m / z 377 kann nur von der vorgeschlagenen Struktur entstehen I und das Fragment-Ion bei m / z 363 nur aus der vorgeschlagenen Struktur II entstehen können. Die gleichzeitige Anwesenheit dieser beiden Ionen bestätigt die vorgeschlagenen Strukturen I und II. Somit ist die RE Glycosyl - Sequenz der Xylan - Kette von Weizen - Endosperm AXs bestehen aus einem Ara Zweig zum Xyl RE angebracht Rückstand (Fragmentierungs Stoffwechselweg m / z 871 → 697 → 523 → 363) und / oder vorletzten Xyl Rückstand (Fragmentierungs Stoffwechselweg m / z 871 → 697 → 523 → 377).
NMR-Analyse des AXs
MS-basierten Analysen liefern keine Informationen entweder an der anomeren Konfiguration (α / β) oder der D / L - Konfiguration der Zucker , die durch andere Methoden erreicht werden müssen, einschließlich enzymatischer und physikalische (beispielsweise NMR). Für Heteroxylane mit der charakteristischen RE reduziert Tetrasaccharid (Xyl-Rha-GalA-Xyl ol) enthält das NMR - Spektrum anomeren Signale auf die Identifizierung und Sequenzierung dieses RE Oligosaccharids führt. Wir beschreiben die Verwendung von 600 MHz 1D- 1 H-NMR - Spektroskopie als Einzelschritt - Methode detERMINE die vollständige Glycosyl-Sequenz des Weizen Endosperm AX RE Oligosaccharid auf dem KOH-sol Fr, einschließlich der anomeren Konfiguration (α / β) und dem D / L-Konfiguration der Zucker. Resonanzen wurden auf Grundlage der veröffentlichten Zuordnungen von Weizen AX Oligosaccharide zugeordnet 17-18 (Figur 5, Tabelle 1). Das 1 H-NMR - Spektrum des AX aus Weizen - Endosperm extrahiert wird von den anomeren chemischen Verschiebungen dominiert bei 5,39, 5,27 und 5,22 ppm, die dem Proton der terminalen α-L-Ara f Rest zugeordnet sind, die an O-3 Position (T-α-L-Ara f → 3 S) der einfach verzweigten (1,4) -β-Xyl p - Backbone - Reste und beide O-3 und O-2 - Positionen (T-α-L-Ara f → 3 D und T-α-L-Ara f → 2 D) des doppelt verzweigten (1,4) -β-Xyl p - Backbone - Reste, bzw. (Figur 5 und Tabelle 1).
f → 3 S + D) H1 Signal von α-L-Ara f Seitenkette an die O-3 - Position des einfach verzweigten β-D-Xyl p Rest gebunden doppelt verzweigten β-D-Xyl p mit angrenzendem. Das Signal bei 5,29 auf dem zugewiesenen (T-α-L-Ara f → 3 D + D) H1 - Signal von α-L-Ara f Seitenkette an der O-3 Position des zweifach verzweigten β-D-Xyl p Rückstand mit angrenzenden doppelt verzweigten β-D-Xyl p. das Signal bei 5,24 zugewiesen ist dem (T-α-L-Ara f → 2 D + D) H1 - Signal von α-L-Ara f Seitenkette auf die anhänge O-2 - Position des doppelt verzweigten β-D-Xyl p Rückstand mit angrenzenden doppelt verzweigten β-D-Xyl p.
Abbildung 2. MALDI-TOF - MS (A) und ESI-MS QTOF (B - E) Analyse der nativen Oligosaccharide durch Endoxylanase von 2AB freigegeben markiert W-sol AXs wie in Abbildung 1 MALDI-TOF - MS - Spektrum skizziert: (A) ( die Signale a Re als [M + Na] + Addukt - Ionen) identifiziert; Ausgewählte Ionen - Scans des ESI-MS QTOF Chromatogramme: B = P 5-10 abgeleitet aus dem internen Bereich Oligosaccharide (Die Signale werden identifiziert als [M + NH 4] + Addukt - Ionen); C = P 1-6 + 2AB von RE abgeleitet D = ESI-Q-TOF voll; Oligosacchariden & P 3-8 G aus sauren Oligosaccharide (Die Signale werden identifiziert als [M + Na] + Addukt - Ionen) abgeleitet (Die Signale werden als [M + H] + Addukt - Ionen identifiziert) Scan - Spektrum: Bereich zwischen 3,10 bis 3,48 min, E = ESI-Q-TOF - Scan - Spektrum: Bereich zwischen 3,59 bis 4,05 min (Die Signale identifiziert werden , da beide [M + Na] + und [M + NH 4] + Addukt - Ionen ); P = Pentosyl Einheit (entweder Ara oder Xyl); G = uronosyl Rückstand (GIcA); RE = reduzierende Ende Oligosaccharide; 2AB = 2 aminobenzamid; EIC: extrahiert Ionenchromatogramms. ad / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die ESI-MS 2, ESI-MS 3 und ESI-MS 4 Spektren pro-O-methylierte RE neutral Glycosyl Alditol (P 4 + Xyl ol) - m / z 885. Die Signale zugewiesen werden als [M + Na] + pseudo-Molekülion - Addukte. Da mehrere isomere Strukturen für eine definierte Masse möglich sind dann in isomeren Strukturen Y und B-Ionen werden in rot und schwarz, jeweils markiert. Jede "Narbe", die durch die Fragmentierung Ereignis wird als eine durchgezogene Linie gekennzeichnet. X = Xylosyl- Rest; A = Arabinosyl- Rückstand. Die ESI-MS 3 Spektren wurde mit freundlicher Genehmigung von Ratnayake et al reproduziert worden. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die ESI-MS 2 und MS 3 ESI-Spektren von per-O-methyliert 2AB markiert neutral RE Oligosaccharid (P 4 + 2AB) - m / z 871. Die Signale als das [M + Na] + zugeordnet sind pseudo -Molekular Ion-Addukte. Da mehrere isomere Strukturen für eine definierte Masse möglich sind, in isomeren Strukturen, Y und B-Ionen sind jeweils in rot und schwarz markiert. Jede "Narbe", die durch die Fragmentierung Ereignis wird als eine durchgezogene Linie gekennzeichnet. X = Xylosyl- Rest; A = Arabinosyl- Rückstand. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Ratnayake et al wiedergegeben. (2014) 2. Bitte klicken Sie hier einen größeren vers zu sehenIon dieser Figur.
Abbildung 5. Anomere Bereich des 600 - MHz - 1D 1 H-NMR - Spektrum der AX - Oligosaccharide , die durch Endoxylanase Behandlung des KOH- Sol Fr. 1 H chemische Verschiebung auf einen internen Standard Aceton bei 2,225 ppm referenziert. T-α-L-Ara f → 3 S: H1 - Signal von α-L-Ara Kette f Seite an der O-3 Position des einfach verzweigten β-D-Xyl p - Rest; T-α-L-Ara f → 2 D: H1 - Signal von α-L-Ara Kette f Seite an dem O-2 - Position des doppelt verzweigten β-D-Xyl p - Rest; T-α-L-Ara f → 3 D: H1 - Signal von α-L-Ara Kette f Seite an der O-3 Position des zweifach verzweigten β-D-Xyl p - Rest; T-α-L-Ara f → 3 S + D: H1 - Signal von α-L-Ara f Seitenkette an der O-3 Position des einfach verzweigten β-D-Xyl p Rückstand mit angrenzendem doppelt verzweigten β-D- Xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: H1 - Signal von α-L-Ara Kette f Seite an dem O-2 - Position des doppelt verzweigten β-D-Xyl p Rückstand mit angrenzendem doppelt verzweigten β-D -Xyl p; T-α-L-Ara f → 3 D + D: H1 - Signal von α-L-Ara Kette f Seite an der O-3 Position des zweifach verzweigten β-D-Xyl p Rückstand mit angrenzendem doppelt verzweigten β-D -Xyl p; 2-α-L-Ara f → 3 S: H1 Signal von 2-α-L-Ara f Seitenkettenrest an der O-3 - Position des einfach verzweigten β-D-Xyl p - Rest; Bitte klicken Sie hier zu seheneine größere Version dieser Figur.
| Unter Zuckerresten | H-1 / C-1 | H-2 / C-2 | H-3 / C-3 | H-4 / C-4 | H-5 eq / C-5 | H-5 ax / C-5 |
| T-α-L-Araf → 3 S | 5.396 / 107,6 | 4.16 | 3.95 | 4.3 | 3,82 | 3,72 |
| T-α-L-Araf | 5.415 / | 4.18 | 3.95 | |||
| → 3 S + D | ||||||
| T-α-L-Araf → 2 D | 5.223 / | 4.16 | 3,97 | 3,82 | 3,74 | |
| T-α-L-Araf → 2 D + D | 5.243 / | 4.16 | 3,98 | |||
| T-α-L-Araf → 3 D | 5,272 / 108,9 | 4.18 | 3.96 | 4.26 | 3.79 | 3,74 |
| T-α-L-Araf → 3 D + D | 5.298 / | 4.18 | 3.96 | |||
| 2-α-L-Araf → 3 S | 5.548 / 106,4 | 4.27 | 4.06 | 4.3 | 3,82 | |
| a-Xylp (Verringerung) | 5,185 / 91,9 | 3.55 | 3,72 | |||
| ß-Xylp (Verringerung) | 4,580 / 96,6 | 3.29 | 3,48 | 3,64 | 4.06 | 3,38 |
| β-4-Xylp | 4.470 / | 3.32 | 3,58 | |||
| ß -4-Xylp + S | 4,461 | 3.31 | 3.56 | 3,75 | 4.08 | 3,36 |
| β-4-Xylp + D | 4,448 | 3.31 | 3.56 | 3,75 | 4.08 | 3,36 |
| ß-3,4-Xylp | 4.518 / | 3,44 | 3.85 | |||
| S + β-3,4-Xylp | 4,514 / | 3,47 | 3,75 | 3,86 | 4.14 | 3.43 |
| D + β-3,4-Xylp | 4,505 | |||||
| ß-3,4-Xylp + S | 4,492 | 3,45 | 3,74 | |||
| β-3,4-D + Xylp | 4,482 | 3,45 | 3,74 | |||
| ß-2,3,4-Xylp | 4,638 | |||||
| S + β-2,3,4-Xylp | 4,627 | 3.59 | 3,87 | 3.88 | ||
| D + β-2,3,4-Xylp | 4,616 | |||||
| ß-2,3,4-Xylp + S | 4,593 | |||||
| β-2,3,4-Xylp + D | 4,593 | |||||
| Die chemischen Verschiebungen im Verhältnis zu melden sind, interne Aceton, & delta; 2,225. | ||||||
| S = Singly β-Xylp verzweigten | ||||||
| S + D = Singly verzweigte β-Xylp + doppelt verzweigte β-Xylp | ||||||
| D = doppelt β-Xylp verzweigten | ||||||
| D + D = doppelt verzweigte β-Xylp + doppelt verzweigte β-Xylp | ||||||
Tabelle 1. 1 H-NMR - Signale der Xylo-Oligosaccharide , die durch Endoxylanase Behandlung des Weizens Endosperm KOH-sol Fr.
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Discussion
Die meisten Matrixphase Zellwandpolysaccharide scheinbar zufällig haben Backbones substituierte (mit sowohl Glycosyl und nicht-Glycosyl - Reste) , die sehr variabel in Abhängigkeit von der Pflanzenart, Entwicklungsstadium und Gewebetyp 3 sind. Da Polysaccharide wird sekundären Genprodukten ihre Reihenfolge sind Vorlage nicht abgeleitet und es gibt daher keinen einzigen analytischen Ansatz, wie Nukleinsäuren und Proteinen besteht, für ihre Sequenzierung. Die Verfügbarkeit von gereinigten gestänge spezifische hydrolytische Enzyme hat ein leistungsfähiges Werkzeug zum Abbau von Polysacchariden, Oligosacchariden zu versehen, die dann chromatographisch fraktioniert werden kann, und wenn sie in Kombination mit chemischen und physikalischen Techniken vollständig sequenziert verwendet. Die Herausforderung besteht darin dann diese komplexen Mischungen in die ursprüngliche Polysaccharid sequenz ein neu zusammenstellen, die noch angegangen zu sein, ist erfolgreich.
Hier haben wir einen Ansatz (deren Reihenfolge der Anwendung ca beschreibenn variiert werden), die auf der Integration von etablierten enzymatischer, chemischer und physikalischer Verfahren zur strukturellen Charakterisierung von (s) von Heteroxylane sowohl reduzierenden Ende (RE) und inneren Bereich Glycosyl-Sequenz beruht. Eine zusätzliche ergänzende Technik hier nicht beschrieben , die sehr nützlich erwiesen hat , durch die Dupree 19 Gruppe entwickelte Oligosaccharide zur Charakterisierung ist PACE (Polysaccharid Analyse durch Kohlenhydrat - Gelelektrophorese) , und es könnte leicht in dieses Protokoll integriert werden , wenn das Gerät zur Verfügung steht. Weiterhin Variationen des LC-Chromatographie kann auch nützlich sein, wie beispielsweise Tandem-inline hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie (HILIC) durch RP-Chromatographie die Möglichkeit bietet sowohl unmarkierte Trenn- / getaggt Oligosaccharide in einem einzigen Schritt. Die Techniken beruhen auf Tagging (mit 2 Aminobenzamid (2AB)) reduzierenden Ende (RE) der heteroxylan Kette vor der enzymatischen (Endoxylanase) Hydrolyse. Zwei verschiedene Ansätze (siehe Zusammenfassung inAbbildung 1) angenommen werden . In der ersten werden intakte W-sol AXs mit 2AB behandelt, um die ursprüngliche RE Hauptkette Zuckerrest zu markieren, und dann mit einem Endoxylanase behandelt, um eine Mischung aus 2AB-markiertem RE und inneren Bereich Reduktions Oligosaccharide zu erzeugen, respectively. In einem zweiten Ansatz wird die KOH-sol Fr mit Endoxylanase hydrolysiert, zuerst eine Mischung von Oligosacchariden zu erzeugen, die mit 2AB anschließend markiert sind. In diesem letzteren Szenario wäre die ursprüngliche RE des KOH-sol AX nicht mit 2AB markiert werden , da sie auf den Glycosyl-alditol während der Alkaliextraktion, die das Reduktionsmittel enthielten reduziert worden war, wurde Natriumborhydrid (NaBH 4). Daher sind die 2AB-markierten Oligosaccharide erzeugt post-Xylanase Verdauung wird von "internen" Oligosaccharide und die ursprüngliche RE Oligosaccharid stammen wird ein RE Alditol ohne 2AB - Tag enthalten (siehe Abbildung 1). Dieser Ansatz kann auch auf andere Klassen von Polysacchariden angewendet werden usingen (wo verfügbar) die entsprechenden endo-Hydrolasen.
Die MS-basierten Ansatz wird durch die Methylierung der Oligosaccharide erzeugt nach Endoxylanase Behandlung , da die un-methylierten Hydroxylgruppe (n) , die während der Gasphase Fragmentierung der pro-O-methylierte Oligosaccharide in MS n stellt eine 14Da Massendifferenz "Narbe deutlich verbessert "das kann verwendet werden , bei der Identifizierung des Verzweigungsmuster und der Glykosyl - Sequenz zu unterstützen. 5-6 die Identität der Pentosylreste (und jeder Zuckerrest) nicht aus den MS - Daten allein gemacht werden , sondern kommt aus dem Wissen über die mit Zusammensetzung des Moleküls; wo diese nicht verfügbar ist , dann müssen die entsprechenden Monosaccharid und Kopplungsanalysen zur Herstellung dieser Aufgaben in MS n vor durchgeführt werden. Weiterhin werden die Signale an die RE sauren Oligosaccharid Alditol, erzeugt aus KOH-sol Fr entsprechenden (Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) und die characteristic dicot Xylan RE Glycosyl - Sequenz (Xyl 2 -RHA-GalA-Xylitol: m / z 761), falls vorhanden, sind nicht in der Lage , da beide haben kann die gleiche Molekülmasse in nativer Form zu unterscheiden, sondern von ihrer MS - Fragmentierung zu unterscheiden ( MS n) Spektren , die am besten auf den methylierten Oligosaccharide durchgeführt wird. Schließlich MS-basierte Techniken nicht in der Lage sind , auf Informationen , um entweder die anomere Konfiguration (α / β) der glycosidischen Bindung oder D / L - Konfiguration des sugars- muss dies durch andere Verfahren bestimmt werden, einschließlich enzymatischer und physikalische (zB NMR).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
- Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
