Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

doi: 10.3791/53748 Published: March 24, 2016

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקות הספציפיות משמשות לאפיו של צמצום הסוף (RE) ורצף glycosyl באיזור הפנימי (ים) של heteroxylans. קירות התא חיטה האנדוספרם-מעומלנים דה בודדו כמו שאריות אלכוהול מסיס (AIR) 1 ברצף חילוץ עם מים (W-סול ו') ו 1 M KOH המכיל 1% 4 NaBH (Koh-סול ו') כפי שתואר על ידי ראת'נייקה et al. (2014) 2. שתי גישות שונות (ראו סיכום באיור 1) יאומצו. בחלק הראשון, ללא פגע W-סול AXS מטופלים עם 2AB לתייג את שאריות סוכר שרשרת עמוד שדרת RE המקוריות ולאחר מכן שטופל endoxylanase כדי ליצור תערובת של RE 2AB שכותרתו באיזור הפנימי הפחתת אוליגוסכרידים, בהתאמה. בגישה השנייה, Koh-סול ו'הוא הידרוליזה עם endoxylanase לייצר הראשון תערובת של אוליגוסכרידים אשר מסומנים ובהמשך עם 2AB. שוחרר enzymically ((un) מתויג) אוליגוסכרידים משניפ-ו FRS-סול KOH אז הם מפוגל בניתוח מבני מפורט של שני אוליגוסכרידים יליד מפוגל מתבצע באמצעות שילוב של MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS ו- ESI-MS n. Endoxylanase מתעכל KOH-סול AXS מאופיינים גם על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כי גם מספק מידע על תצורת anomeric. ניתן ליישם טכניקות אלה לשיעורים אחרים של סוכרים באמצעות אנדו-hydrolases המתאים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heteroxylans הם משפחה של סוכרים כי הם סוכרים שאינם מתאית השולט של הקירות העיקרי של עשבים הקירות משני של כל מכוסי הזרע 3-6. על גבותיהם xylan נבדלים סוגים שלהם ואת דפוסי התחלופה עם glycosyl (חומצה גלוקורונית (GlcA), arabinose (עראף)) והלא-glycosyl (O-אצטיל, חומצה ferulic) שאריות בהתאם לסוג הרקמה, השלב ההתפתחותי ומינים 7.

חומות מחיטה האנדוספרם (Triticum aestivum L.) מורכבים בעיקר של arabinoxylans (AXS) (70%) ו- (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucans (20%) עם כמויות קטנות של תאית heteromannans (2% כל אחת) 8. עמוד השדרה xylan עשוי להיות שונות בלתי להחליף ו בעיקר מונו מחליפים (בעיקר O-2 עמדה ובמידה פחותה O-3 עמדה) ו di-להחליף (O-2 ו- O-3 עמדות) עם α-L-ערה f שאריות 9. סוף הצמצום (RE) של הטרוxylans מ dicots (למשל, thaliana ארבידופסיס) 10 ו חשופי הזרע (למשל, אשוחית (אַשׁוּחַ Picea)) 11 מכיל רצף glycosyl tetrasaccharide מאפיין; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-RHA p - (1 → 2) -α-D-גל p A- (1 → 4) -D-Xyl p. כדי להבין heteroxylan ביוסינתזה ותפקוד (ביולוגי ותעשייתיים), חשוב שממפה את עמוד השדרה xylan מלא להבין את סוגי ואת דפוסי החלפות וכן רצף של סוף צמצום (RE).

טכניקות ספציפיות משמשות לאפיו המבניים של צמצום הסוף (RE) ורצף glycosyl באיזור הפנימי (ים) של heteroxylans מתוארות בכתב היד הזה. הטכניקות להסתמך על fluorophore תיוג (עם 2 aminobenzamide (2AB)) את צמצום סוף (RE) של שרשרת heteroxylan לפני הידרוליזה אנזימטית (endoxylanase). גישה זו, במיוחד עבור רצף RE, היהדיווח לראשונה על ידי מעבדת יורק 10,12-13 אך מוארך בשלב זה לכלול את הרצף באזור הפנימי הוא שילוב של טכניקות נקבעו כי ניתן להתאמה לכל במידה שווה heteroxylans העצמאית של מקור בידודם. גישה זו יכולה לחול גם על סוגים אחרים של סוכרים אלקטרוניים (בהתאם היצע) את אנדו-hydrolases המתאים.

במחקר הנוכחי, קירות התא האנדוספרם חיטה מעומלנים דה בודדו כמו שאריות אלכוהול מסיס (AIR) ברצף חילוץ עם מים (W-סול ו') ו 1M KOH המכיל 1% 4 NaBH (Koh-סול ו') כמתואר ב ראת'נייקה et al. (2014) 2. אוליגוסכרידים שוחררו משני פ-ו FRS-סול KOH אז הם מפוגלים בניתוח המבנים המפורט של שני אוליגוסכרידים היליד המפוגלים מתבצע באמצעות שילוב של MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS מצמיד עם HPLC עם הפרדת chromatographic באינטרנט באמצעות טור RP C-18ו ESI-MS n. Endoxylanase מתעכל KOH-סול AXS אופיינה גם תהודה מגנטית גרעינית (NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תוויות של סוף צמצום (RE) שאריות סוכר של AXS W-סול עם 2-aminobenzamide (2AB)

  1. דגירה W-סול AXS עם 2AB (0.2 M) בנוכחות של 1 M NaBH 3 CN (נתרן cyanoborohydride) (pH 5.5) עבור שעה 2 ב 65 מעלות צלזיוס כדי להמיר את הקצוות צמצום של הרשתות עמוד השדרה פוליסכריד לנגזרות הניאון שלהם.
    זהירות: הצעד הבא צריך להתבצע במנדף כמו NaBH 3 CN משחרר גז ציאניד רעיל כאשר הוא בא במגע עם מים.
    1. תשקלי NaBH 3 CN (62.8 מ"ג) ו להתמוסס במים (1 מ"ל) בצינור microcentrifuge (1.5 מ"ל) כדי להכין פתרון 1 M NaBH 3 CN. ממיסים מגיב 2AB (27.2 מ"ג) ב 1 M NaBH 3 פתרון CN (1 מ"ל) על ידי חימום על 65   מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH של תערובת התגובה (0.2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) ל -5.5 pH עם 10% חומצה אצטית.
    2. הוסף 200 μl של תערובת התגובה (0.2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) ל W-כךAXS l (1 מ"ג) בתוך שפופרת זכוכית עם מכסה ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת. דגירה עבור שעה 2 ב 65   ° C במנדף. מצננים את ההשעיה RT ולהוסיף 4 כרכים. של אתנול אבסולוטי.
    3. מניחים את ההשעיה בתוך בקירור (4 מעלות צלזיוס) O / N כדי לזרז סוכרים.
    4. צנטריפוגה (1,500 XG, 10 דקות, RT) כדי להסיר supernatant. שטפו את הכדור בהרחבה עם אתנול אבסולוטי (4x), אצטון (1x) מתנול (1x), צנטריפוגה בין כל שטיפה. יבש אבק ב 40 ° CO / N.
      הערה: כביסה נרחבת גם מסירה 2AB שיורית.

דור 2. Xylo-אוליגוסכרידים מ 2 AB Labelled W-סול AXS

  1. ממיסים 2AB שכותרתו W-סול AXS (1 מ"ג) ב 500 μl של חיץ נתרן אצטט (100 מ"מ, pH 5) בצינור microcentrifuge (1.5 מ"ל). להוסיף 4 יחידות של endoxylanase (11 GH, [M1]) ו לדגור על 37   ° C במשך 16 שעות.
  2. להשמיד פעילות האנזים על ידי חימום mixt התגובהיור במשך 10 דקות באמבט מים רותחים. מצננים את ההשעיה RT ולהעביר שפופרת זכוכית עם מכסה. הוסף 4 כרכים. של אתנול אבסולוטי ומניחים ההשעיה בתוך בקירור (4 מעלות צלזיוס) O / N כדי לזרז כל סוכרים מעוכלים.
  3. צנטריפוגה (1,500 XG, 10 דקות, RT) להפריד סוכרים מעוכלים (גלולה) ואת endoxylanase שנוצר-אוליגוסכרידים Xylo (supernatant). למזוג supernatant לתוך צינור זכוכית נקי ומניחים אותו לתוך אמבט מים חמים (40 מעלות צלזיוס).
  4. לאדות את אתנול תחת זרם של גז חנקן נפח נקודת הסיום (~ 500 μl). להקפיא את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ולייבש את supernatant קפוא בתוך מייבש הקפאת להתאושש-אוליגוסכרידים Xylo.

דור 3.-אוליגוסכרידים Xylo מ- Koh-סול AXS ו תוויות 2AB

  1. פנקו KOH-סול AXS עם endoxylanase (11 GH, [M1]) כדי ליצור-אוליגוסכרידים Xylo כמתואר לעיל (סעיפים 2.1-2.4).
  2. פנקו endoxylanase שנוצר-אוליגוסכרידים Xylo מ- Koh-סול AXS עם תערובת התגובה 2AB (0.2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) כמתואר לעיל (סעיפים 1.1.1-1.1.2).
  3. למזוג supernatant לתוך צינור זכוכית נקי ומניחים אותו לתוך אמבט מים חמים (40 מעלות צלזיוס). לאדות את אתנול תחת זרם של גז חנקן נפח נקודת הסיום (~ 500 μl). להקפיא את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ולייבש את supernatant קפוא בתוך מייבש הקפאת להתאושש-אוליגוסכרידים Xylo.

4. MALDI-TOF-MS

  1. הכנת פתרון MALDI-מטריקס
    1. הוספת סקופ קטן של 2, חומצה 5-dihydroxbenzoic (DHB) 50 אצטוניטריל% (500 מ"ל) המכיל חומצה פורמית 0.1% בתוך שפופרת (פתרון MALDI-מטריקס). מערבבים בעזרת מערבולת, אם זה מתמוסס מהר, להוסיף עוד סקופ קטן של DHB. הערה: ריכוז אידיאלי של פתרון MALDI-מטריקס הוא 10 מיקרוגרם / μl -1.
  2. הכנת פלייט MALDI-היעד
    1. להפקיד את aqueoלנו oligosaccharide (מקורי) דגימות (5-10 מיקרוגרם) (W-סול ו / או Koh-סול) לצלחת MALDI-היעד. להוסיף 0.3 μl פתרון MALDI-מטריקס באמצעות קצה נפרד ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. אפשר לתערובת להתייבש ב RT.
      הערה: דגימות מיובשות כראוי צריכות להיות מורכבות של גבישי מחט בצורה ארוכים מצביעים לכיוון המרכז של המקום. אם הפיקדון הוא דביק ו / או מרווח המדגם יכול להיות מרוכז מדי או מורכב של מלחים, פיקדונות כאלה צפויים לייצר ספקטרה טובה המדגם צריך להיות מטוהרים נוספים.
    2. הצג את צלחת היעד למקור MS ולהפעיל במצב יון חיובי (+ ive). התאם את המתח המאיץ 19.0 ק ו ב יון מקור 1 ו 16.3 ק במקור יון 2. התאם את כוח הליזר כדי יותר מ -70%. בחר את המקום מדגם על הצלחת MALDI-היעד ולחץ על התחל כדי להתחיל יריות לייזר.
      הערה: כל תחומי היעד לא יניבו אותות. בנקודה מסוימת יהיה רק ​​לתת איתות במשך כמה יריות לייזר או בשלדלדול של תערובת מדגם / מטריקס או מאפיינים של הגביש.
      1. הזז את הליזר לאזורים שונים של היעד במהלך הרכישה ממוצעת כ 200 ספקטרה אקראי לקבל אות לרעש משביעת רצון.

5. ESI-QTOF-MS

  1. לנתח אוליגוסכרידים שנוצר endoxylanase (מקורי) באמצעות-HPLC ננו בשילוב עם יינון electrospray (ESI) זמן quadrupole של מחווני טיסה (QTOF) MS עם הפרדה chromatographic באינטרנט באמצעות RP C-18 טור (75 מיקרומטר x 150 מ"מ; 3.5 מיקרומטר חרוז גודל).
    1. מעביר את תערובת אוליגוסכרידים מימיים שנוצר endoxylanase לתוך בקבוקון ולמקם לתוך סמפלר האוטומטי HPLC. לתכנת את שיפוע elution של 5-80% עם שלבים ניידים 0.1% (v / v) חומצה פורמית במים ו -0.1% (v / v) חומצה פורמית ב אצטוניטריל, בהתאמה, מעל 60 דקות.
    2. התאם את קצב הזרימה 0.2 μl / min. כיוון המצב החיובי היון בטווח הסריקהשל 300-1,600 מ '/ z ו-קצב סריקה של 0.5 סריקות / שני באמצעות תנאי מקור ESI כדלקמן: גז וילון 10, 4 GS1, מקור טמפרטורת 100 מעלות צלזיוס, מתח ספריי יון 2,300 V, ודה-clustering פוטנציאל 50 V. הפעל את תוכנית chromatographic LC ו אוליגוסכרידים elute. הכרומתוגרמה יון הכולל כתוצאה (TIC) נשמר באופן אוטומטי על ידי התוכנה.
    3. פתח את TIC הציל ובחר הכרומתוגרמה לחלץ. הקלד את ההמונים הצפויים (למשל, 271, 403, 535, 667, 799 ו 931 מ '/ z) על שורת הפקודה. הכרומתוגרמה סריקה על ידי לחיצה על Enter. לעבד את סריקות יון הנבחרים הנתונים הכרומתוגרמה ESI-QTOF MS באמצעות תוכנה על פי הוראות היצרן 14.

6. ESI-MS n

  1. הכנס 1 עד 2 μl של oligosaccharide שידורי O-מפוגל (מפוגל כפי שתואר על ידי Pettolino et al. 1) מדגם ב אצטוניטריל 50% לתוך טיפ nanospray באמצעות מזרק. מְטוּפָּחקצה ננו-ספריי באמצעות חתכי זכוכית להשתלב בעל ננו-ספריי הדיסקרטיים מצורף MS.
  2. הגדר את המונית על פי הטווח המוני הצפוי (200-1,500 מ '/ z) וילון הגז ל -10, מתח ionspray ב 1,900 V ו- הקוטבי לחיובי.
  3. לחץ על לחצן לרכוש לפתוח חלון רלוונטי, זן שם קובץ נתונים להשיג סריקת יון כוללת (ESI-MS 1). ואז ללחוץ על כפתור STOP.
  4. שנה את סוג הסריקה מתוך יון המוצר לפצל לשיא של עניין. הזן את המסה של עניין (למשל, 885 מ '/ z) להתפרק לרסיסים להתאים את טווח המוני (200-900 מ' / z). לחץ על לחצן לרכוש ולהתאים את אנרגית ההתנגשות (מעלה / או למטה בכרטיסייה דריבית) כדי להשיג פיצול שלם של יון הורה (885 מ '/ z) ולרכוש סריקת יון שבר (2 ESI-MS).
  5. הזן את מסתו של יון שבר של עניין (למשל, 711 מ '/ z) ולהתאים את טווח המוני (200-720 מ' / z). לחץ על כפתור הרכישהd להתאים את אנרגית ההתנגשות להשיג פיצול שלם של יון מבשר (711 מ '/ z) ולרכוש סריקת יון שבר (ESI-MS 3).

ספקטרוסקופיה 7. H 1 NMR

  1. ממיסים תערובת שנוצר endoxylanase של אוליגוסכרידים (Koh-סול, טופס מקורי) (~ 500 מיקרוגרם) ב D 2 O (1.0 מ"ל, 99.9%) בצינור פלסטיק הבדיקה (15 מ"ל). להקפיא את ההשעיה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ולייבש את ההשעיה הקפואה בתוך מייבש הקפאה להתאושש-אוליגוסכרידים Xylo.
  2. חזרו על 7.1 פעמים כדי במלואה להחליף את H 2 O עם D 2 O.
  3. ממיסים אוליגוסכרידים מיובש D 2 O (0.6 מ"ל, 99.9%) ולהוסיף 0.5 μl של אצטון (5% ב O D 2) כסטנדרט פנימי. מעביר את אוליגוסכרידים deuterated לתוך צינור מדגם NMR.
  4. החזק את המדגם המכיל צינור NMR ידי העליון והכנס את צינור המדגם טווה פלסטיק. מניחים את טווה את מד עומק המדגם. מוּגלָהh או למשוך את הצינור המדגם כדי לכוונן את העומק של המדגם כדי להבטיח את קו האמצע של העליון המדגם ומדידי עומק תחתונים שווה.
  5. הסר את מד העומק והכנס את המדגם לתוך סמפלר האוטומטי המצורפת ספקטרומטר תמ"ג 600 MHz מצויד חללית-קריו.
  6. התחברות תוכנות שליטת ספקטרומטר פתוחה. הזן את שם הקובץ לדוגמה. פתח במערך קיים ולאחר מכן להשתמש בפקודה "EDC" כדי לשמור אותו תחת שם חדש. הקלד את העמדה מספרת את הדוגמא סמפלר האוטומטי ולחץ "ENTER".
    הערה: לחיצה על כפתור ה "ENTER" ירד הצינור מדגם בעדינות כדי השחלת המגנט איפה זה יהיה ממוקם בחלק העליון של החללית.
  7. הגדר את הטמפרטורה מדגם הרצוי על ידי הקלדת "edte" בשורת הפקודה. חכה הטמפרטורה מדגם להגיע לערך הרצוי לפני שתמשיך לשלב הבא. זן "לנעול" בשורת הפקודה ובחר ממס מתאים (D 2 O). חכה & #34; לנעול הודעה מוגמרת "להופיע בתחתית החלון.
  8. הקלד "atmm" בשורת הפקודה ולחץ על "מטב" בחלק העליון של סרגל התפריטים atmm. בחר להתחיל כוונון והתאמה של החללית עבור הערוץ הנבחר (1 H במקרה זה).
  9. הקלד "topshim" בשורת הפקודה לתהליך shimming שבו שינויים קלים נעשים השדה המגנטי עד שדה מגנטי אחיד מושגת סביב sample.Acquire האות על ידי הקלדת "ZG" בשורת הפקודה והזן.
  10. לנתח ספקטרום באמצעות תוכנה 15 על פי הוראות היצרן עם המשמרת כימית 1 H פנייה אל תקן פנימי של אצטון ב 2.225 ppm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עיכול Endoxylanase של 2AB שכותרתו W-סול AXS מייצר תערובת של אוליגוסכרידים RE שכותרתו 2AB וסדרה שכותרתו האו"ם (ללא תווית 2AB) אוליגוסכרידים נגזרו האזורים הפנימיים של שרשרת xylan (איור 1; מ ראת'נייקה et al. 2). סדרת גישות chromatographic מועסקת ואז fractionate מהתערובת המורכבת של איזומרים. לבסוף, טכניקות MS מנוצלים כדי לזהות את המבנים isomeric כי הם רצף אז על ידי MS n טכניקות. כאן אנו מציגים נציג, ולא מקיפה, דוגמא לגישה.

האותות בספקטרום MALDI-TOF-MS של אוליגוסכרידים נגזר שכותרתו 2AB יליד W-סול AXS (איור 2 א) כוללים סדרה יון פסאודו-מולקולרי בהיקף נרחב ביותר ב m / z 701, 833, ו 965 מייצג סדרה של תווית נייטרלי פנימיאוליגוסכרידים באזור עם 5-7 שאריות pentosyl (P 5-7), בהתאמה. סדרת אותות ב m / z 745, 877, ו 1009, לקבוע כי סדרת oligosaccharide חומצי ללא תווית, עם P 4-6 + ששה 1 (חומצה Hexuronic), נוכחת גם חלק זה (איור 2 א). יונים פסיאודו מולקולרית בבית m / z 821 ו 953 להעיד על נוכחות של P אוליגוסכרידים RE המקורי שכותרתו 2AB 5-6 + 2AB, בהתאמה.

ניתוח ESI-QTOF-MS עבור אוליגוסכרידים ילידים עם חלוקת on-line chromatographic של אוליגוסכרידים ידי RP C-18 HPLC מבוצע מכן. איור 2B ו 2C, מציג את סריקות יון שנבחרו, המופקות יון הכולל ESI-QTOF-MS הכרומתוגרמה (TIC), של אוליגוסכרידים שוחרר על ידי endoxylanase מ W-סול ו'AXS. האותות כוללים סדרה יון מולקולרי פסאודו מוקצה כמו [M + NH 4] + ב מ/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, ו 1356 מייצג שורה של אוליגוסכרידים ניטראלי באיזור הפנימי עם 5-10 שאריות pentosyl (P 5-10), בהתאמה (איור 2 ב). מבני isomeric כמה אפשריים עבור oligosaccharide של מסה מוגדרת (ראה להלן ESI-MS n ניתוח). מכאן הפסגות המרובות עבור כל הסריקות המולקולריות היון אפשריות כפי שנצפו באיור 2B. יונים פסיאודו מולקולרית מוקצה כמו [M + H] + ב m / z 271, 403, 535, 667, 799, ו 931 להעיד על נוכחות של 2AB שכותרתו RE oligosaccharide סדרת P 1-6 + 2AB, בהתאמה (איור 2 ג) . האותות זוהה כמו [M + H] + יונים בבית m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, ו 1273 מצביעים על נוכחות של אוליגוסכרידים חומצי עם P 3-8 + ששה 1, בהתאמה (איור 2 ג). בשנות ה monocots commelenid, עמוד השדרה xylan ניתן גם להחליף עם חומצות פנוליות,בעיקר חומצה ferulic (וגם חומצה p -coumaric), אשר כוללת את המסה המולקולרית כמו חומצה גלוקורונית ויכול להתגלות W-סול AXS של קירות התא האנדוספרם חיטה. עם זאת, ניתוח נוסף של AXS פ-ו Koh-סול באמצעות ESI-MS n (ואת ההלחנה מנתח ידי GC-MS נגזרים TMS הבאים methanolysis; לא מוצג כאן) לאשר את אוליגוסכרידים חומצי עם P 3-8 + ששה 1 ב האנדוספרם חיטה AXS.

האותות המוקצים כמו [M + H] + יונים של ספקטרום סריקה מלא ESI-Q-TOF של האזור בין 3.10-3.48 דקות (2D האיור) כולל ההסדרה של 2AB שכותרתו אוליגוסכרידים RE: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, ו 1195 (P 1-8 + 2AB, בהתאמה). סדרת יונים-מולקולרי פסאודו בספקטרום ESI-Q-TOF הסריקה המלא של האזור בין 3.59-4.05 דקות (2E איור) מייצגת את אוליגוסכרידים חומצי באיזור הפנימי להתבונןד הן [M + Na] + יונים: m / z 613, 745, 877, 1009, ו 1141 (P 3-7 + ששה 1, בהתאמה) ו [M + NH 4] + יונים: m / z 740, 872, 1004, 1136, ו 1268 (P 4-8 + שש 1, בהתאמה).

כדי לרצף את אוליגוסכרידים הפרט, ביצענו ESI-MS n על שידורי O-מפוגל אוליגוסכרידים ולא על אוליגוסכרידים יליד המתקבל W-סול KOH-סול AXS שכן הוא מאתגר להקצות מבנים חד משמעית על ידי רצף אוליגוסכרידים הילידים . בנוסף, זה גם דורש כמות גדולה יותר של חומר. מתילציה של אוליגוסכרידים בוצע כפי שתואר על ידי Pettolino et al. 1. ESI-MS n חקירות שבוצעו על alditols oligosaccharide נייטרלי RE נגזר KOH-סול AXS, ו 2AB שכותרתו oligosaccharide RE נייטרלי נגזר W-סול AXS מתוארים בלוw כדוגמה לסייע בפרשנות של הספקטרום ומבנים מוסק. אותה הגישה ניתן ליישם כל אוליגוסכרידים המופקים הידרוליזה enzymic. היונים שבר של ESI-MS n ספקטרה זוהו יונים Y ו- B על פי Domon & קוסטלו. 16 קבוצת הידרוקסיל Un-מפוגל (ים) שנוצר במהלך הפיצול-שלב הגז של אוליגוסכרידים שידורי O-מפוגל ב- MS n מספק 14Da המוני ההבדל "צלקת", שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את דפוס הסתעפות ואת רצפי glycosyl. 12-13 כל צלקת שנוצר על ידי האירוע הפיצול מסומן כקו יציב (איורים 3 ו -4). כמו כמה מבני isomeric אפשריים עבור מסה מוגדרת, אז במבני isomeric אלה, יוני Y ו- B מסומנים באדום ושחור, בהתאמה.

2 ESI-MS, ESI-MS 3 ו ESI-MS 4 SPECTra של שידורי O-מפוגל RE נייטרלי אוליגו-glycosyl alditol שנוצר מן הפיצול של פסאודו-מולקולרי יון m / z 885 (P 4 + Xyl ol) מוצג באיור 3. הספקטרום ESI-MS 2 כולל את Y בשפע יונים בבית m / z 711, 551, ו 391 שנוצרו על ידי האובדן של אחד, שתיים או שלוש שאריות pentosyl, בהתאמה, מתוך יון ההורה. יון בשפע m / z 711 יכול להיווצר על ידי או אובדן של שאריות Xyl סוף מסוף הלא צמצום או על ידי אובדן של שאריות ערה שרשרת הצד סופנית. מ 'Y אבחון / z 391 יון בספקטרום וכתוצאה מכך יכול להיווצר מאובדן שלושה שחקנים חוץ-הפחתת שאריות סוף Xyl מן oligosaccharide RE אשר יש שאריות ערה שרשרת הצד על שאריות ol RE Xyl או oligosaccharide RE אשר יש שאריות ערה שרשרת הצד על שאריות 2 nd Xyl מן ol שאריות RE Xyl. למרות שיש אפשרות רשמית כי מבנים אחרים, כגוןXyl 4 ol -Xyl, ו (ערה) ol Xyl-Xyl-Xyl-Xyl תוליד זה שבר יון מבנים אלה אינם נכללים שיקול כמו הספציפיות של xylanase-אנדו המשמש לבקע פוליסכריד היה גם לבזות או לא לדבוק בבית הצמדה glycosidic סמוך לנקודה הסניף, בהתאמה. במקביל, יון אבחון Y מ '/ z 551 יכול להיות שנוצר מאובדן שתי הלא צמצום סוף שאריות Xyl מן oligosaccharide RE אשר יש לו את שאריות ערה שרשרת הצד משני שאריות RE Xyl ol או oligosaccharide RE אשר יש לו את הצד שאריות שרשרת ער על שאריות Xyl הלפני האחרונות. לפיכך, ארבעה מבני isomeric אפשריים ניתן להציע (איור 3: I, II, III ו- IV). הנפוץ Y יון m / z 377 (ראה איור 3: Ia ו IIa) ו- B יון m / z 503 (ראה איור 3: Ia, איב, איווה IVb) המופק פיצול נוסף של מ 'מבשר isomeric/ z 711 יון גם הם נצפו הספקטרום הזה. ספקטרום 3 ESI-MS (איור 3) שרשם הפיצול של מ 'מבשר isomeric / z 711 יונים כללו לשיא גדול ב m / z 537 (יון Y של P 2 + Xyl ol עם שתי צלקות; המופק מבשר יון Ia , איב, IIa, IIb, IIIa, IIIb, איווה IVb) ו- m / z 391 (יון Y של ol P 1 + Xyl עם צלקת אחת; המופק מבשר יון IIb, IIIa, IIIb, איווה IVb). שני אלה פסגות הגדולות (m / z 537 ו m / z 391) יכול להיווצר על ידי אובדן של אחד ושני הלא הפחתת שאריות מסוף Xyl, בהתאמה, מתוך מ מבשר isomeric / z 711 יון שנוצר מן הפיצול של פסאודו מ 'יון הורה -molecular / z 885 (P 4 + ol Xyl) במהלך ESI-MS 2. יחסית פסגות שפע נמוך ב m / z 377 (יון Y של P 1 + Xyl ol עם שתי צלקות; המופק precursor יון Ia ו IIa) ו 551 (יון Y של P 2 + Xyl ol עם צלקת אחת; המופק מבשר יון איב IIb) נצפו גם הספקטרום הזה.

ESI-MS 4 של הפיצול של מבשר m / z isomeric 551 יונים כללו לשיא גדול ב m / z 377 (יון Y של P 1 + ol Xyl עם שתי צלקות) ו- m / z 391 (Y יון של P 1 + ol Xyl עם צלקת אחת) המופק מבשר יון של מבנים I ו- II. לכן הראיות הקולקטיביות הציעו רצף RE glycosyl המורכב של שרשרת ערה בצד הצמודה שאריות RE Xyl ol (מ 'מסלול פיצול אבחון / z 885 → 711 → 551 → 391; האיור 3II), שרשרת הצד הערה המצורפת הוא RE Xyl ol ואת הלפני האחרון (1 שאריות רח Xyl שייך לפלוגת RE Xyl) שאריות Xyl (מסלול פיצול אבחון m / z 885 → 711 → 537 → 391; איור 3III), שרשרת הצד ערה המצורפת הלפני אחרון (1 st Xyl שייכים לפלוגה RE Xyl) שאריות Xyl (מסלול הפיצול אבחון m / z 885 → 711 → 537 → 377; איור 3I) ואת שרשרת ערה בצד צמודות על שאריות 2 nd Xyl מן ol RE Xyl (איור 3iV).

הנוכחות של יונים אלה מאשרת מבני isomeric המוצעים I, II, III ו- IV ואת מבנה oligosaccharide RE הניטראלי של: - [ערה f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [ערה f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [ערה f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p.

הספקטרום 2 ESI-MS של 2AB שידורי O-מפוגל שכותרתו oligosaccharide RE המופק fragmentation של [Na M +]-מולקולרי מעין + יון ב m / z 871 (P 4 + 2AB) מוצג באיור 4. ספקטרום זה כולל את יון Y הנפוץ ביותר ב m / z 697 (P 3 + 2AB עם אחד צלקת), מ '/ z 537 (P 2 + 2AB עם צלקת אחת) ו- m / z 377 (P 1 + 2AB עם צלקת אחת), שנוצר על ידי אובדן של אחד מהם, שניים או שלושה שאריות pentosyl הלא צמצום, בהתאמה. יון m / z 697 יכול להיווצר על ידי או אובדן של שאריות Xyl סוף מסוף הלא צמצום או על ידי אובדן של שאריות מסוף ערה ואילו m / z 537 יון יכול להיווצר רק על ידי אובדן של שתי שאריות Xyl מסוף . מסלול הפיצול אבחון (m / z 871 → 697 → 537 → 377) הציע את קיומו של oligosaccharide עמוד השדרה xylan ליניארי un הקנים (ים) בבית RE המתאים מ יון מולקולרי מעין / z 871 (P 4 + 2AB ). עם זאת את עמוד השדרה ליניארית un הקנים xylosyl (P 4 + 2AB) הוא susceלאתר ptible endoxylanase הספציפי לעיכול נוסף. לכן שני יונים isomeric m / z 697 יכולים להתקיים. לפיכך שני מבני isomeric אפשריים מוצעים (איור 4: I ו- II). במבני isomeric אלה יוני Y ו- B מסומנים באדום ושחור, בהתאמה. הספקטרום 3 ESI-MS שנרשם בגין הפיצול של isomeric מבשר m / z 697 יון מייצר m / z 523 יון (יון Y של P 2 + 2AB עם שתי צלקות; איור 4, מבנים Ia, איב, IIa ו IIb), מ ' יון / z 363 (Y יון של P 1 + 2AB עם שתי צלקות; איור 4, מבנה IIa) ו- Y יון ב m / z 377 (P 1 + 2AB עם אחד צלקת; איור 4, מבנים Ia ואיב). היון שהבר ב m / z 377 יכול לנבוע רק מן המבנה המוצע שאני ואת היון שהבר ב m / z 363 יכולים לנבוע רק מן המבנה המוצע השני. הנוכחות בו זמנית של שני יונים אלה מאשרת את המבנים המוצעים I ו- II. לכן רצף RE glycosyl של שרשרת xylan של AXS האנדוספרם חיטה מורכב סניף ערה המצורף שאריות RE Xyl (מ 'מסלול פיצול / z 871 → 697 → 523 → 363) ו / או שאריות Xyl הלפני אחרונות (מ' מסלול פיצול / z 871 → 697 → 523 → 377).

ניתוח התמ"ג של AXS

ניתוחים מבוססי MS אינם מספקים מידע משני בתצורת anomeric (α / β) או בתצורת D / L של סוכרים כי חייב להיות מושגת על ידי גישות אחרות, כולל enzymic והפיזית (למשל, NMR). לקבלת heteroxylans עם tetrasaccharide מאפיין RE מופחת (ol Xyl-RHA-Gala-Xyl), ספקטרום NMR מכיל אותות anomeric המוביל לזיהוי רצף של oligosaccharide RE זה. אנו מתארים את השימוש של 600 מגה-הרץ 1D 1 ספקטרוסקופיה H-NMR כשיטה צעד אחד כדי Det סמור רצף glycosyl המלא של oligosaccharide RE חיטת האנדוספרם AX על ו'KOH-הסול, כולל תצורת anomeric (α / β) ואת תצורת D / L של הסוכרים. רזוננסים חולקו על בסיס הקצאות פרסם של אוליגוסכרידים חיטה AX 17-18 (איור 5, לוח 1). 1 H-NMR הספקטרום של AX שחולץ מן האנדוספרם חיטה נשלט בידי המשמרות הכימיות anomeric ב 5.39, 5.27 ו 5.22 ppm מוקצי הפרוטון של שאריות מסוף α-L-ערה f, מצורפים O-3 עמדה (T-α-L-ערה f → 3 S) של קנים ביחידים (1,4) -β-Xyl שאריות p עמוד השדרה ושניהם O-3 ו- O-2 עמדות (T-α-L-ערה f → 3 D ו- T-α-L-ערה f → 2 D) של הקנים כפליים (1,4) -β-Xyl שאריות עמוד השדרה p, בהתאמה (איור 5 ולוח 1).

= "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> האותות ב 5.41 מוקצים (T-α-L-ערה f → 3 S + D) H1 אות של α-L-ערה f שרשרת צד מצורפת למצב O-3 של β-D-Xyl p השאריות המסועפות ביחידים עם הסמוך מסועף כפליים β-D-Xyl p. האות ב 5.29 מוקצה (T-α-L-ערה f → 3 D + D) אות H1 של שרשרת הצד α-L-ערה f המצורפת למצב O-3 של קנים כפליים β-D-Xyl שאריות p עם הסמוך מסועף כפליים β-D-Xyl p. האות ב 5.24 מוקצה (T-α-L-ערה f → 2 D + D) H1 אות של שרשרת הצד α-L-ערה f המצורפת עמדת O-2 של שאריות p מסועף כפליים β-D-Xyl עם הסמוך מסועף כפליים β-D-Xyl p.

איור 1

<p class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 1. סיכום של גישה ניסויית סיכום של האסטרטגיה המועסקים הייצור, מטהרים רצף סוף צמצום (RE) ו אוליגוסכרידים באיזור פנימי. arabinoxylans האנדוספרם חיטה (AXS) מוצג. נתון זה שוחזר באישור ואח ראת'נייקה. (2014) 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. MALDI-TOF MS (א) ו ESI-QTOF MS (B - E) ניתוח של אוליגוסכרידים יליד שפורסמו על ידי endoxylanase מ 2AB שכותרתו W-סול AXS כמתואר באיור 1. MALDI-TOF ספקטרום MS: (א) ( א האותות מחדש מזוהה [M + Na] + יוני adduct); סריקות יון נבחרים של chromatograms MS ESI-QTOF: B = P 5-10 נגזר אוליגוסכרידים באיזור פנימי (האותות מזוהים [M + NH 4] + יונים adduct); C = P 1-6 + 2AB נגזר RE אוליגוסכרידים (האותות מזוהים [M + H] + יוני adduct) & P 3-8 G נגזרה אוליגוסכרידים חומצי (האותות מזוהים [M + Na] + יוני adduct); D = ESI-Q-TOF מלא ספקטרום סריקה: אזור שבין 3.10-3.48 דקות, E = ESI-Q-TOF ספקטרום סריקה מלא: אזור שבין 3.59-4.05 דקות (האותות מזוהים הוא [M + Na] + ו- [M + NH 4] + יוני adduct ); יחידת P = pentosyl (או ערה או Xyl); G = uronosyl שאריות (GlcA); RE = צמצום אוליגוסכרידים סוף; 2AB = 2 aminobenzamide; EIC: הכרומתוגרמה יון חילוץ. המודעה / 53,748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. 2 ESI-MS, ESI-MS 3 ו ESI-MS 4 ספקטרום של שידורי O-מפוגל RE נייטרלי glycosyl alditol (P 4 + ol Xyl) - m / z 885. האותות מוקצים כמו [M + Na] + adducts יון מולקולרי פסאודו. כמו כמה מבני isomeric עבור מסה מוגדרת אפשריים ואז במבני isomeric יוני Y ו- B מסומנים באדום ושחור, בהתאמה. כל "צלקת" שנוצרה על ידי אירוע הפיצול מסומן כקו יציב. X = Xylosyl שאריות; שאריות A = Arabinosyl. ספקטרה 3 ESI-MS שוחזרה באישור ראת'נייקה et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. 2 ESI-MS ו- ESI-MS 3 ספקטרום של שידורי O-מפוגל 2AB שכותרתו oligosaccharide RE נייטרלי (P 4 + 2AB) - m / z 871. האותות מוקצים כמו [M + Na] + פסאודו adducts יון -molecular. כמו כמה מבני isomeric עבור מסה מוגדרת אפשריים במבני isomeric, יוני Y ו- B מסומנים באדום ושחור בהתאמה. כל "צלקת" שנוצרה על ידי אירוע הפיצול מסומן כקו יציב. X = Xylosyl שאריות; שאריות A = Arabinosyl. נתון זה שוחזר באישור ואח ראת'נייקה. (2014) 2. אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדוליון של נתון זה.

איור 5
באזור איור 5. Anomeric של הספקטרום 1D 1 600 MHz H-NMR של אוליגוסכרידים AX שנוצר על ידי טיפול endoxylanase של KOH- סול האב 1 שינוי כימי H הפניה אל תקן פנימי של אצטון ב 2.225 ppm. T-α-L-ערה f → 3 S: H1 אות של שרשרת הצד α-L-ערה f המצורפת למצב O-3 של שאריות p מסועף ביחידים β-D-Xyl; T-α-L-ערה f → 2 D: H1 אות של שרשרת צד α-L-ערה f המצורפת למצב O-2 של השאריות מסועפות כפליים β-D-Xyl p; T-α-L-ערה f → 3 D: H1 אות של שרשרת צד α-L-ערה f המצורפת למצב O-3 של השאריות מסועפות כפליים β-D-Xyl p; T-α-L-ערה f → 3 S + D: אות H1 של שרשרת הצד f α-L-ערה המצורפת למצב O-3 של שאריות p מסועף ביחידים β-D-Xyl עם מחוברים מסועף כפליים β-D- Xyl p; T-α-L-ערה f → 2 D + D: אות H1 של שרשרת צד α-L-ערה f המצורפת למצב O-2 של השאריות מסועפות כפליים β-D-Xyl p עם מחוברים מסועפים כפליים β-D p -Xyl; T-α-L-ערה f → 3 D + D: אות H1 של שרשרת צד α-L-ערה f המצורפת למצב O-3 של השאריות מסועפות כפליים β-D-Xyl p עם מחוברים מסועפים כפליים β-D p -Xyl; 2-α-L-ערה f → 3 S: אות H1 של שאריות שרשרת 2-α-L-ערה f בצד צמודות למצב O-3 של שאריות p מסועף ביחידים β-D-Xyl; אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שאריות סוכר H-1 / ג -1 H-2 / C-2 H-3 / ג -3 H-4 / C-4 ח -5 EQ / C-5 H-5 גרזן / C-5
T-α-L-עראף → 3 S 5.396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-עראף 5.415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-עראף → 2 D 5.223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-עראף → 2 D + D 5.243 / 4.16 3.98
T-α-L-עראף → 3 D 5.272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-עראף → 3 D + D 5.298 / 4.18 3.96
2-α-L-עראף → 3 S 5.548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
אלפא-Xylp (צמצום) 5.185 / 91.9 3.55 3.72
בטא Xylp (צמצום) 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
בטא -4-Xylp + S 4.461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4.448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
בטא 3,4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
S + β-3,4-Xylp 4.514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D + β-3,4-Xylp 4.505
בטא 3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4.482 3.45 3.74
בטא-2,3,4-Xylp 4.638
S + β-2,3,4-Xylp 4.627 3.59 3.87 3.88
D + β-2,3,4-Xylp 4.616
בטא-2,3,4-Xylp + S 4.593
β-2,3,4-Xylp + D 4.593
המשמרות כימיות מתועדות ביחס אצטון פנימי, δ 2.225.
S = ביחידים מסועף β-Xylp
S + D = ביחידים מסועפים β-Xylp + כפלים מסועפים β-Xylp
D = מסועף כפלים β-Xylp
D + D = כפלים מסועפים β-Xylp + כפלים מסועפים β-Xylp

טבלה 1. 1 אותות H-NMR של Xylo-אוליגוסכרידים שנוצר על ידי טיפול endoxylanase של האנדוספרם חיטה KOH-סול האב

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

רוב שלב מטריקס סוכרי דופן התא החליפו לכאורה באקראי עמוד שדרה (בשני glycosyl ושאריות שאינם glycosyl) כי הם מאוד משתנים בהתאם מיני צמחים, שלב ההתפתחותי ורקמות סוג 3. מאז סוכרים הם מוצרים משניים גן הרצף שלהם אינו תבנית נגזר ולכן אין גישה אנליטית יחידה, כגון קיימת עבור חומצות גרעין וחלבונים, עבור הסידור שלהם. הזמינות של אנזימים hydrolytic הצמדה ספציפי מטוהרים סיפקה כלי רב עוצמה כדי לבזות סוכרים כדי אוליגוסכרידים, כי אז יכול להיות chromatographically מופרדים, וכאשר נעשה שימוש בשילוב עם טכניקות כימיות ופיסיקליות שמיצו לחלוטין. האתגר הוא אז להרכיב מחדש תערובות מורכבות אלה לתוך אחד sequence- פוליסכריד המקורי כי הוא עדיין להיות התייחס בהצלחה.

כאן אנו מתארים גישה (כדי שאת של ca יישוםn להיות מגוון) המסתמך על השילוב של enzymic הוקמה, כימי וטכניקות פיסיות לאפיון המבני של שניהם בסוף הצמצום (RE) ורצף glycosyl באיזור הפנימי (ים) של heteroxylans. טכניקת משלימות נוספת שלא תוארה כאן שהוכיחה מאוד שימושי לאפיון אוליגוסכרידים היא PACE (ניתוח פוליסכריד ידי ג'ל אלקטרופורזה פחמימות) שפותח על ידי קבוצת 19 דופרי וזה יכול בקלות להשתלב פרוטוקול זה אם הציוד זמין. יתר על כן, וריאציות על כרומטוגרפיה LC יכולות גם להיות שימושיות, כגון כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי המוטבעת טנדם (HILIC) ואחריו כרומטוגרפיה RP להציע את האפשרות להפריד הן מתויגות / מתויגים אוליגוסכרידים בשלב אחד. הטכניקות להסתמך על תיוג (עם 2 aminobenzamide (2AB)) סוף צמצום (RE) של שרשרת heteroxylan לפני הידרוליזה אנזימטית (endoxylanase). שתי גישות שונות (ראו סיכוםאיור 1) יאומצו. בחלק הראשון, ללא פגע W-סול AXS מטופלים עם 2AB לתייג את שאריות סוכר שרשרת עמוד שדרת RE המקוריות ולאחר מכן שטופל endoxylanase כדי ליצור תערובת של RE 2AB שכותרתו באיזור הפנימי הפחתת אוליגוסכרידים, בהתאמה. בגישה השנייה KOH-סול ו'הוא הידרוליזה עם endoxylanase לייצר הראשון תערובת של אוליגוסכרידים אשר מסומנים ובהמשך עם 2AB. בתרחיש אחרון זה רי המקורי של AX KOH-סול לא להיות מתויג עם 2AB מאז הצטמצמה עד אל glycosyl-alditol במהלך החילוץ אלקלי שהכיל את reductant, borohydride נתרן (NaBH 4). לכן, אוליגוסכרידים שכותרתו 2AB שנוצר העיכול שלאחר xylanase, יהיה מקורן "פנימי" אוליגוסכרידים ואת oligosaccharide RE המקורי יכיל RE alditol ללא תג 2AB (ראה איור 1). גישה זו יכולה לחול גם על סוגים אחרים של סוכרים uלשיר (בהתאם היצע) את אנדו-hydrolases המתאים.

הגישה המבוססת MS היא משופר באופן משמעותי על ידי מתילציה של אוליגוסכרידים שנוצרו לאחר טיפול endoxylanase מאז קבוצת הידרוקסיל מפוגל-un (ים) שנוצרה במהלך פיצול-שלב גז של אוליגוסכרידים שידורי O-מפוגל ב- MS n מספקת פרש מסות 14Da "צלקת "שניתן להשתמש בהם כדי לסייע בזיהוי של דפוס הסתעפות ואת רצף glycosyl. 5-6 זהותו של שאריות pentosyl (וכל שאריות סוכר) לא ניתן לבצע מהנתונים MS לבד אבל מגיע מהצורך בידע של רכב של המולקולה; איפה זה אינו זמין אז ניתוחי monosaccharide והצמדה הרלוונטיים חייבות להתבצע לפני ביצוע מטלות אלה n MS. יתר על כן את האותות המתאימים alditol oligosaccharide חומצי RE, המופק KOH-סול ו'(Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) ואת chdicot xylan RE glycosyl רצף aracteristic (Xyl 2 -Rha-Gala-Xylitol: m / z 761), אם הוא קיים, אינם מסוגלים להבחין כפי שניהם באותה מסה מולקולרית בצורה המקורית אך ניתן להבחין בין הפיצול MS שלהם ( MS n) ספקטרום אשר הביצועים הטובים ביותר על אוליגוסכרידים מפוגל. לבסוף, טכניקות מבוססות MS אינן מסוגלות לספק מידע משני בתצורת anomeric (α / β) של הצמדת glycosidic או בתצורת D / L של sugars- זו צריכה להיקבע על ידי שיטות חלופיות, כולל enzymic ופיזית (למשל, NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
  2. Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
  3. Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
  4. York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
  5. Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
  6. Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
  7. Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
  8. Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82, (13), 372-377 (1980).
  9. Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
  10. Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
  11. Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
  12. Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
  13. Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22, (2012), 439-451 (2012).
  14. Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
  15. Topspin User Manual. Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
  16. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
  17. Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter