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Chemistry

संयंत्र दीवार Heteroxylans का अनुक्रमण Enzymic, रासायनिक (मेथिलिकरण) और शारीरिक (मास स्पेक्ट्रोमेट्री, परमाणु चुंबकीय अनुनाद) तकनीकों का प्रयोग

Published: March 24, 2016 doi: 10.3791/53748
Automatic Translation
1, 1, 1
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

Abstract

इस प्रोटोकॉल विशिष्ट अंत (आरई) और heteroxylans के आंतरिक क्षेत्र glycosyl अनुक्रम (ओं) को कम करने के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल की तकनीक का वर्णन है। डी-रस्मी गेहूं एण्डोस्पर्म सेल दीवारों एक शराब अघुलनशील अवशेषों (एआईआर) 1 और क्रमिक रूप से पानी (डब्ल्यू-प फादर) के साथ निकाली गई और 1 एम KOH 1% NaBH 4 (KOH-प फादर) युक्त रूप रत्नायके एट द्वारा वर्णित के रूप में अलग थे अल। (2014) 2। दो अलग अलग दृष्टिकोण (चित्रा 1 में सारांश देखें) अपनाया जाता है। पहले में, अक्षत डब्ल्यू प AXS मूल आरई रीढ़ श्रृंखला चीनी अवशेषों को टैग करने 2AB के साथ इलाज किया और फिर एक endoxylanase के साथ इलाज किया 2AB लेबल आरई और आंतरिक क्षेत्र oligosaccharides क्रमश: कम करने का एक मिश्रण उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। एक दूसरे दृष्टिकोण में, कोह-प फादर endoxylanase साथ hydrolyzed है पहले oligosaccharides जो बाद में 2AB के साथ चिह्नित कर रहे हैं का एक मिश्रण उत्पन्न करते हैं। enzymically जारी ((संयुक्त राष्ट्र) में टैग) दोनों से oligosaccharidesडब्ल्यू और कोह-प Frs तो methylated और दोनों देशी और मिथाइल oligosaccharides की विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण MALDI-TOF एमएस, आरपी-एचपीएलसी-ईएसआई-QTOF-एमएस और ईएसआई एमएस n का एक संयोजन का उपयोग किया जाता है। Endoxylanase पचा KOH-प AXS भी परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) भी है कि anomeric विन्यास बारे में जानकारी प्रदान की विशेषता है। इन तकनीकों में उचित एंडो-हाइड्रोलिसिस का उपयोग कर polysaccharides के अन्य वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

Heteroxylans polysaccharides कि घास के प्राथमिक दीवारों और सभी वनस्पतियों 3-6 के माध्यमिक दीवारों का प्रमुख गैर cellulosic polysaccharides हैं के एक परिवार के हैं। Xylan अनिवार्य जरूरतों उनके प्रकार और glycosyl (glucuronic एसिड (GlcA), arabinose (Araf)) और गैर-glycosyl (ओ-एसिटाइल, ferulic एसिड) ऊतक प्रकार, विकास मंच और प्रजातियों के आधार पर 7 अवशेषों के साथ प्रतिस्थापन के पैटर्न में मतभेद है।

गेहूं से दीवारों (ट्रिटिकम aestivum एल) एण्डोस्पर्म मुख्य रूप से arabinoxylans (AXS) (70%) और (1 → 3) से बना रहे हैं (1 → 4) -β-D-glucans (20%) सेलूलोज और heteromannans की मामूली मात्रा के साथ (2% प्रत्येक) 8। xylan रीढ़ विभिन्न संयुक्त राष्ट्र के एवजी और मुख्य रूप से मोनो प्रतिस्थापित (मुख्य रूप से O-2 की स्थिति है और एक हद तक कम करने हे -3 स्थिति) और di-प्रतिस्थापित α एल आरा के साथ (ओ -2 और हे-3 पदों) हो सकता है एफ अवशेषों 9। को कम करने के अंत (आरई) असमलैंगिक कीडाइकोटों से xylans (उदाहरण के लिए, Arabidopsis thaliana) 10 और जिम्नोस्पर्म (उदाहरण के लिए, सजाना (Picea एबीस)) 11 एक विशेषता tetrasaccharide glycosyl अनुक्रम होता है; -β-D-Xyl पी - (1 → 3) -α एल Rha पी - (1 → 2) -α-D-लड़की पी ए (1 → 4) डी-Xyl पी। heteroxylan जैवसंश्लेषण और समारोह (जैविक और औद्योगिक) को समझते हैं, यह पूरी तरह से प्रकार और प्रतिस्थापन के पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से कम करने के अंत (आरई) के अनुक्रम को समझने के लिए रीढ़ की हड्डी xylan अनुक्रम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

अंत (आरई) और heteroxylans के आंतरिक क्षेत्र glycosyl अनुक्रम (ओं) को कम करने के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल विशिष्ट तकनीक इस पांडुलिपि में वर्णित हैं। तकनीक fluorophore टैगिंग पर भरोसा heteroxylan श्रृंखला एंजाइमी (endoxylanase) हाइड्रोलिसिस से पहले कम करने के अंत (आरई) (2 aminobenzamide (2AB) के साथ)। यह दृष्टिकोण, विशेष रूप से आरई अनुक्रमण के लिए किया गया था,पहले यॉर्क प्रयोगशाला 10,12-13 द्वारा सूचना दी, लेकिन अब आंतरिक क्षेत्र अनुक्रमण शामिल करने के लिए बढ़ाया और है की स्थापना की तकनीकों का एक संयोजन है कि समान रूप से अलगाव के अपने स्रोत के स्वतंत्र सब heteroxylans के लिए अनुकूल है। यह दृष्टिकोण भी (जहां उपलब्ध हो) उचित एंडो-हाइड्रोलिसिस का उपयोग कर polysaccharides के अन्य वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, de-रस्मी गेहूं एण्डोस्पर्म सेल दीवारों के रूप में वर्णित एक शराब अघुलनशील अवशेषों (एआईआर) और क्रमिक रूप से पानी (डब्ल्यू-प फादर) के साथ निकाली रूप में अलग थे और 1M KOH युक्त 1% NaBH 4 (KOH-प फादर) रत्नायके में एट अल। (2014) 2। दोनों डब्ल्यू और कोह-प Frs ​​से रिहा oligosaccharides तो methylated और दोनों देशी और मिथाइल oligosaccharides की विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण MALDI-TOF एमएस, साथ एचपीएलसी साथ ईएसआई-QTOF-MS-युग्मित का एक संयोजन का उपयोग किया जाता है ऑनलाइन chromatographic जुदाई एक आरपी सी -18 स्तंभ का उपयोगऔर ईएसआई एमएस एन। Endoxylanase पचा KOH-प AXS भी परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) की विशेषता थी।

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Protocol

1. कम करना समाप्ति की लेबलिंग (आरई) चीनी डब्ल्यू प AXS के 2-aminobenzamide साथ छाछ (2AB)

  1. 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम NaBH 3 सीएन (सोडियम cyanoborohydride) (5.5 पीएच) 2 घंटे के लिए की उपस्थिति में 2AB (0.2 एम) के साथ डब्ल्यू प AXS सेते उनकी फ्लोरोसेंट डेरिवेटिव के लिए polysaccharide रीढ़ की चेन को कम करने के सिरों को परिवर्तित करने के लिए।
    चेतावनी: निम्नलिखित कदम धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में NaBH 3 सीएन जहरीला साइनाइड गैस विज्ञप्ति जब यह पानी के साथ संपर्क में है।
    1. वजन NaBH 3 चीन (62.8 मिलीग्राम) और पानी में भंग एक microcentrifuge ट्यूब (1.5 मिलीलीटर) में (1 मिलीलीटर) एक 1 एम NaBH 3 सीएन समाधान तैयार करने के लिए। 65 में 1 एम NaBH 3 सीएन समाधान (1 मिलीलीटर) हीटिंग द्वारा में 2AB अभिकर्मक (27.2 मिलीग्राम) भंग   डिग्री सेल्सियस और प्रतिक्रिया मिश्रण (0.2 एम 2AB, 1 एम NaBH 3 सीएन) 10% एसिटिक एसिड के साथ 5.5 पीएच का पीएच को समायोजित।
    2. डब्ल्यू, तो कुछ प्रतिक्रिया मिश्रण के 200 μl (0.2 एम 2AB, 1 एम NaBH 3 सीएन) जोड़ेंएक टोपी के साथ एक ग्लास ट्यूब में एल AXS (1 मिलीग्राम) और एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर मिश्रण। 65 में 2 घंटे के लिए सेते   एक धूआं हुड में सी °। आरटी के लिए निलंबन कूल और 4 खंड जोड़ें। पूर्ण इथेनॉल की।
    3. (4 डिग्री सेल्सियस) हे / polysaccharides वेग एन एक कोल्ड स्टोरेज में निलंबन रखें।
    4. अपकेंद्रित्र (1500 XG, 10 मिनट, आरटी) सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पूर्ण इथेनॉल (4x), एसीटोन (1x) और मेथनॉल (1x) के साथ बड़े पैमाने पर गोली धो लें, प्रत्येक धोने के बीच centrifuging। 40 डिग्री सीओ / एन वैक्यूम सूखी।
      नोट: व्यापक धुलाई भी अवशिष्ट 2AB हटा।

2 एबी लेबल से जाइलो-oligosaccharides के 2. पीढ़ी डब्ल्यू प AXS

  1. भंग 2AB एक microcentrifuge ट्यूब में सोडियम एसीटेट बफर के 500 μl (100 मिमी, पीएच 5) (1.5 मिलीलीटर) में डब्ल्यू प AXS (1 मिलीग्राम) लेबल। endoxylanase की 4 इकाइयों (जीएच 11, [एम 1]) जोड़ें और 37 पर सेते   16 घंटे के लिए सें।
  2. प्रतिक्रिया mixt हीटिंग द्वारा एंजाइम गतिविधि को नष्टएक उबलते पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए Ure। आरटी के लिए निलंबन शांत और एक टोपी के साथ ग्लास ट्यूब के लिए स्थानांतरण। 4 खंड जोड़ें। पूर्ण इथेनॉल की और एक कोल्ड स्टोरेज में निलंबन जगह (4 डिग्री सेल्सियस) हे / एन किसी भी पचाया polysaccharides वेग।
  3. अपकेंद्रित्र (1500 XG, 10 मिनट, आरटी) पचाया polysaccharides (गोली) को अलग करने और endoxylanase उत्पन्न जाइलो-oligosaccharides (सतह पर तैरनेवाला)। एक साफ ग्लास ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला छानना और एक गर्म पानी से स्नान (40 डिग्री सेल्सियस) में जगह।
  4. एक अंत बिंदु मात्रा (~ 500 μl) के लिए नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत इथेनॉल लुप्त हो जाना। 4 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला रुक और जाइलो-oligosaccharides ठीक करने के लिए एक फ्रीज ड्रायर में जमे हुए सतह पर तैरनेवाला सूखी।

3. कोह-प AXS और 2AB लेबलिंग से जाइलो-oligosaccharides की पीढ़ी

  1. endoxylanase साथ KOH-प AXS (जीएच 11, [एम 1]) के इलाज के रूप में (वर्गों 2.1-2.4) ऊपर वर्णित जाइलो-oligosaccharides उत्पन्न करते हैं।
  2. endox समझोylanase 2AB प्रतिक्रिया मिश्रण (0.2 एम 2AB, 1 एम NaBH 3 सीएन) (वर्गों 1.1.1-1.1.2) ऊपर वर्णित के रूप में साथ KOH-प AXS से उत्पन्न जाइलो-oligosaccharides।
  3. एक साफ ग्लास ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला छानना और एक गर्म पानी से स्नान (40 डिग्री सेल्सियस) में जगह। एक अंत बिंदु मात्रा (~ 500 μl) के लिए नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत इथेनॉल लुप्त हो जाना। 4 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला रुक और जाइलो-oligosaccharides ठीक करने के लिए एक फ्रीज ड्रायर में जमे हुए सतह पर तैरनेवाला सूखी।

4. MALDI-TOF एमएस

  1. MALDI-मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
    1. 2, 5-dihydroxbenzoic एसिड (DHB) के एक छोटे स्कूप 50% acetonitrile (500 मिलीलीटर) एक ट्यूब (MALDI-मैट्रिक्स समाधान) में 0.1% फार्मिक एसिड से युक्त करने के लिए जोड़ें। एक भंवर का उपयोग मिक्स, अगर इसे जल्दी घुल, DHB का एक और छोटा सा स्कूप जोड़ें। नोट: MALDI-मैट्रिक्स समाधान के आदर्श एकाग्रता 10 माइक्रोग्राम है / μl -1।
  2. MALDI-लक्ष्य थाली की तैयारी
    1. aqueo जमाहमें (देशी) के नमूने (5-10 माइक्रोग्राम) oligosaccharide (डब्ल्यू-सोल और / या कोह-प) एक MALDI लक्ष्य थाली पर। 0.3 μl MALDI-मैट्रिक्स समाधान के लिए एक अलग टिप का उपयोग कर जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण। मिश्रण आरटी पर सूखे की अनुमति दें।
      नोट: ठीक से सूख नमूने लंबी सुई के आकार का क्रिस्टल स्थान के केंद्र की ओर इशारा करते हुए से मिलकर चाहिए। यदि जमा चिपचिपा और / या मैला है नमूना या तो बहुत ध्यान केंद्रित किया जा सकता है या लवण से मिलकर बनता है, इस तरह की जमा अच्छा स्पेक्ट्रा का उत्पादन करने की संभावना नहीं है और नमूना आगे शुद्ध किया जाना चाहिए।
    2. एमएस स्रोत में लक्ष्य थाली परिचय और धनात्मक (+ ive) आयन मोड में कार्य करते हैं। आयन स्रोत 1 में 19.0 केवी और आयन स्रोत 2. पर 16.3 केवी त्वरक वोल्टेज समायोजित अधिक से अधिक से अधिक 70% करने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें। MALDI लक्ष्य थाली पर नमूना स्थान का चयन करें और लेजर दृश्यों शुरू करने के लिए प्रारंभ क्लिक करें।
      नोट: लक्ष्य के सभी क्षेत्रों का संकेत नहीं निकलेगा। एक विशेष स्थान पर केवल कुछ ही लेजर करने के लिए या तो की वजह से शॉट के लिए एक संकेत दे देंगेनमूना / मैट्रिक्स मिश्रण या क्रिस्टल की विशेषताओं की कमी।
      1. संतोषजनक संकेत करने वाली शोर प्राप्त करने के लिए लगभग 200 यादृच्छिक स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण और औसत के दौरान लक्ष्य के विभिन्न क्षेत्रों के लिए लेजर ले जाएँ।

5. ईएसआई-QTOF एमएस

  1. विश्लेषण endoxylanase जनित oligosaccharides (देशी) नैनो एचपीएलसी एक electrospray आयनीकरण (ईएसआई) उड़ान ऑनलाइन chromatographic जुदाई के साथ (QTOF) एमएस साधन के quadrupole समय एक आर.पी. का उपयोग के साथ मिलकर का उपयोग करते हुए सी -18 स्तंभ (75 माइक्रोन x 150 मिमी, 3.5 माइक्रोन मनका आकार)।
    1. एक शीशी में endoxylanase जनित जलीय oligosaccharides मिश्रण स्थानांतरण और एचपीएलसी ऑटो पारखी में जगह है। acetonitrile में क्रमश: मोबाइल चरणों 0.1% (v / v) पानी में फार्मिक एसिड और 0.1% (वी / वी) फार्मिक एसिड के साथ 5-80% की क्षालन ढाल, 60 मिनट से अधिक कार्यक्रम।
    2. 0.2 μl / मिनट के लिए प्रवाह दर को समायोजित करें। सीमा स्कैन में सकारात्मक आयन मोड समायोजितपर्दा गैस 10, जीएस 1 4, स्रोत तापमान 100 डिग्री सेल्सियस, आयन स्प्रे वोल्टेज 2300 वी, और डी-क्लस्टरिंग संभावित 50: 300-1,600 मी / z और 0.5 स्कैन / दूसरे ईएसआई स्रोत शर्तों का उपयोग के रूप में निम्नानुसार के स्कैन-दर की वी भागो नियंत्रण रेखा chromatographic कार्यक्रम और Elute oligosaccharides। उसके एवज में कुल आयन chromatogram (घरेलू) सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से सहेजा जाता है।
    3. बचाया घरेलू खोलें और निकालने वर्णलेख का चयन करें। कमांड लाइन पर उम्मीद जनता (जैसे, 271, 403, 535, 667, 799 और 931 मी / z) टाइप करें। दर्ज क्लिक करके स्कैन वर्णलेख। ईएसआई-QTOF एमएस वर्णलेख निर्माता के निर्देशों के अनुसार 14 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा के चयनित आयन स्कैन प्रक्रिया।

6. ईएसआई एमएस n

  1. प्रति-ओ-मिथाइल oligosaccharide के 1 से 2 μl डालें (methylated के रूप में Pettolino एट अल। 1 से वर्णित) एक सिरिंज का उपयोग कर एक nanospray टिप में नमूना 50% acetonitrile में। ट्रिमनैनो स्प्रे एक गिलास कटर का उपयोग टिप असतत नैनो स्प्रे धारक एमएस करने के लिए संलग्न में फिट करने के लिए।
  2. 1,900 वी पर उम्मीद जन रेंज (200-1,500 मी / z) और पर्दे गैस 10, ionspray वोल्टेज और polarity सकारात्मक करने के लिए के अनुसार बड़े पैमाने पर सेट करें।
  3. , प्रासंगिक विंडो खोलने कुल आयन स्कैन (ईएसआई एमएस 1) प्राप्त करने के लिए डेटा फ़ाइल नाम दर्ज करने के लिए अधिग्रहण बटन दबाएँ। फिर रोक बटन दबाएँ।
  4. उत्पाद आयन प्रकार स्कैन बदले ब्याज की एक चोटी टुकड़ा करने के लिए। ब्याज की बड़े पैमाने पर दर्ज (उदाहरण के लिए, 885 मी / z) टुकड़ा और जन रेंज (200-900 मी / z) को समायोजित करने के लिए। अधिग्रहण बटन दबाएं और माता पिता के आयन की पूरी विखंडन (885 मी / z) को प्राप्त करने और एक टुकड़ा आयन स्कैन (ईएसआई एमएस 2) के अधिग्रहण की टक्कर ऊर्जा को समायोजित (अप और / या नीचे यौगिक टैब में)।
  5. ब्याज (जैसे, 711 मी / z) का टुकड़ा आयन की बड़े पैमाने पर प्रवेश और बड़े पैमाने पर सीमा समायोजित (200-720 मी / z)। अधिग्रहण के बटन एक प्रेसघ अग्रदूत आयन की पूरी विखंडन (711 मी / z) को प्राप्त करने और एक टुकड़ा आयन स्कैन (ईएसआई एमएस 3) प्राप्त करने के लिए टक्कर ऊर्जा को समायोजित।

7. एच 1 एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. एक प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब में (1.0 मिलीलीटर, 99.9%) (15 एमएल) डी ओ 2 में oligosaccharides के endoxylanase उत्पन्न मिश्रण (KOH-प, देशी फार्म) (~ 500 माइक्रोग्राम) भंग। 4 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन रुक और जाइलो-oligosaccharides ठीक करने के लिए एक फ्रीज ड्रायर में जमे हुए निलंबन सूखी।
  2. आदेश में पूरी तरह से डी 2 ओ के साथ एच 2 ओ का आदान-प्रदान करने के लिए दो बार दोहराएँ 7.1
  3. (0.6 मिलीलीटर, 99.9%) डी ओ 2 में सूखे oligosaccharides भंग और एक आंतरिक मानक के रूप में एसीटोन के 0.5 μl (डी में 2 ओ 5%) जोड़ें। एनएमआर नमूना ट्यूब में deuterated oligosaccharides स्थानांतरण।
  4. शीर्ष द्वारा एनएमआर ट्यूब युक्त नमूना पकड़ो और एक प्लास्टिक स्पिनर में नमूना ट्यूब डालें। नमूना गहराई नापने का यंत्र में स्पिनर रखें। मवादएच या नमूना ट्यूब खींच सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना ऊपर और नीचे गहराई गेज की मध्य रेखा के बराबर हैं नमूना की गहराई को समायोजित करने के लिए।
  5. हटाये गहराई नापने का यंत्र और ऑटो एक 600 मेगाहर्ट्ज एनएमआर एक क्रायो जांच के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़ी पारखी में नमूना डालें।
  6. लॉग इन और खुली स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर। नमूना फाइल नाम दर्ज करें। एक मौजूदा डाटासेट खोलें और फिर एक नए नाम के तहत करने के लिए इसे बचाने के लिए "EDC" कमांड का उपयोग करें। ऑटो पारखी में नमूने की स्थिति संख्या टाइप करें और "Enter" दबाएँ।
    नोट: "प्रवेश" बटन दबाने चुंबक बोर जहां यह जांच के शीर्ष पर तैनात किया जाएगा करने के लिए धीरे नमूना ट्यूब छोड़ देंगे।
  7. कमांड लाइन पर "edte" टाइप करके वांछित नमूना तापमान सेट करें। नमूना तापमान के लिए प्रतीक्षा अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले वांछित मूल्य तक पहुंचने के लिए। दर्ज कमांड लाइन पर "ताला" और उचित विलायक चयन (डी ओ 2)। के लिए इंतजार " समाप्त "संदेश ताला विंडो के तल पर दिखाई देते हैं।
  8. कमांड लाइन पर "atmm" टाइप करें और atmm मेनू पट्टी के शीर्ष पर "अनुकूलन" पर क्लिक करें। ट्यूनिंग और चयनित चैनल (इस मामले में 1 एच) के लिए जांच के मिलान के लिए शुरू चुनें।
  9. shimming की प्रक्रिया में जो मामूली समायोजन के चुंबकीय क्षेत्र के लिए किया जाता है जब तक वर्दी चुंबकीय क्षेत्र कमांड लाइन पर "ZG" टाइप और दर्ज करके sample.Acquire चारों ओर संकेत हासिल की है के लिए कमांड लाइन पर "topshim" टाइप करें।
  10. 1 एच रासायनिक 2.225 पीपीएम पर एसीटोन की एक आंतरिक मानक को संदर्भित बदलाव के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 15 स्पेक्ट्रा विश्लेषण।

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Representative Results

के Endoxylanase पाचन 2AB लेबल डब्ल्यू प AXS 2AB लेबल आरई oligosaccharides का एक मिश्रण है और संयुक्त राष्ट्र लेबल (2AB लेबल के बिना) xylan श्रृंखला (चित्रा 1 के आंतरिक क्षेत्रों से निकाली गई oligosaccharides की एक श्रृंखला उत्पन्न करता है, से रत्नायके एट अल। 2)। chromatographic दृष्टिकोण की एक श्रृंखला है तो isomers का जटिल मिश्रण fractionate के लिए कार्यरत है। अंत में, एमएस तकनीक समाजिक संरचना है कि तब एमएस n तकनीक द्वारा अनुक्रम कर रहे हैं की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। यहाँ हम नहीं बल्कि व्यापक दृष्टिकोण के उदाहरण से एक प्रतिनिधि उपस्थित थे।

2AB लेबल मूल निवासी डब्ल्यू प AXS (2A चित्रा) से व्युत्पन्न oligosaccharides के MALDI-TOF एमएस स्पेक्ट्रम में संकेतों मीटर की ऊंचाई पर एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में छद्म आणविक आयन श्रृंखला / Z 701, 833, और 965 लेबल हटाया गया की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व शामिल तटस्थ आंतरिक5-7 pentosyl अवशेषों (पी 5-7), क्रमशः के साथ इस क्षेत्र oligosaccharides। मी / z 745, 877, और 1009 में संकेतों की एक श्रृंखला है, कि एक लेबल हटाया गया अम्लीय oligosaccharide श्रृंखला नामित पी 4-6 + Hexa 1 (Hexuronic एसिड) के साथ भी इस अंश (2A चित्रा) में मौजूद है। मी / z 821 और 953 पर छद्म आणविक आयनों 2AB लेबल मूल आरई oligosaccharides पी 5-6 + 2AB की उपस्थिति, क्रमशः संकेत मिलता है।

आरपी सी -18 एचपीएलसी द्वारा oligosaccharides के एक ऑन लाइन chromatographic विभाजन के साथ देशी oligosaccharides के लिए ईएसआई-QTOF-एमएस विश्लेषण तो किया जाता है। चित्रा 2 बी और -2 सी, चयनित आयन स्कैन, ईएसआई-QTOF एमएस कुल आयन से निकाला चलता chromatogram (घरेलू), डब्ल्यू प फादर AXS से endoxylanase द्वारा जारी oligosaccharides की। संकेतों को एक छद्म आणविक आयन के रूप में [एम + एनएच 4] + मीटर की ऊंचाई पर सौंपा श्रृंखला में शामिल/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, और 1356 में 5-10 pentosyl अवशेषों (पी 5-10) क्रमश: (चित्रा 2 बी) के साथ आंतरिक क्षेत्र तटस्थ oligosaccharides की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व। कई समाजिक संरचनाओं एक परिभाषित द्रव्यमान का एक oligosaccharide (ईएसआई एमएस n विश्लेषण नीचे देखें) के लिए संभव हो रहे हैं। इसलिए आणविक आयन स्कैन से प्रत्येक के लिए कई चोटियों संभव के रूप में चित्रा 2 बी में मनाया जाता है। छद्म आणविक रूप [एम एच] + मीटर की ऊंचाई पर / z 271, 403, 535, 667, 799, और 931 सौंपा आयनों से संकेत मिलता है एक 2AB की उपस्थिति लेबल आरई oligosaccharide श्रृंखला पी 1-6 + 2AB, क्रमशः (चित्रा -2) । संकेतों के रूप में पहचान [एम एच] + M / Z 613, 745, 877, 1009, 1141, और 1273 में आयनों पी 3-8 + 1 hexa, क्रमशः (चित्रा 2 सी) के साथ एक अम्लीय oligosaccharides की उपस्थिति का संकेत। commelenid monocots में, xylan रीढ़ की हड्डी भी phenolic एसिड के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है,मुख्य रूप से ferulic एसिड (और भी पी -coumaric एसिड), जो glucuronic एसिड के रूप में ही आणविक द्रव्यमान है और गेहूं एण्डोस्पर्म सेल दीवारों के डब्ल्यू प AXS में पता लगाया जा सकता है। हालांकि, ईएसआई एमएस n का उपयोग डब्ल्यू और कोह-प AXS के आगे के विश्लेषण (और compositional methanolysis निम्नलिखित टीएमएस डेरिवेटिव के जीसी एमएस द्वारा विश्लेषण करती है, यहाँ नहीं दिखाया गया है) गेहूं एण्डोस्पर्म में पी 3-8 + 1 Hexa साथ अम्लीय oligosaccharides पुष्टि AXS।

संकेत के रूप में [एम एच] + 3.10-3.48 मिनट के बीच क्षेत्र के ईएसआई-क्यू-TOF पूरा स्पेक्ट्रम स्कैन के आयनों (चित्रा 2 डी) भी शामिल है 2AB की श्रृंखला आरई oligosaccharides लेबल सौंपा: मी / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, और 1195 (पी 1-8 + 2AB, क्रमशः)। (चित्रा 2 ई) 3.59-4.05 मिनट के बीच क्षेत्र के ईएसआई-क्यू-TOF पूरा स्पेक्ट्रम स्कैन में छद्म आणविक आयनों की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व आंतरिक क्षेत्र अम्लीय oligosaccharides निरीक्षणडी दोनों [एम + एनए] + आयनों के रूप में: मी / z 613, 745, 877, 1009, और 1141 (पी 3-7 + 1 hexa, क्रमशः) और [एम + एनएच 4] + आयनों: मी / z 740, 872, 1004, 1136, और 1268 (पी 4-8 + 1 hexa, क्रमशः)।

आदेश में अलग-अलग oligosaccharides अनुक्रम करने में, हम ईएसआई एमएस प्रदर्शन किया n पर प्रति-ओ-methylated oligosaccharides बजाय डब्ल्यू सोल और कोह-प AXS से प्राप्त के बाद से यह स्पष्ट मूल निवासी oligosaccharides अनुक्रमण द्वारा संरचनाओं आवंटित करने के लिए चुनौती दे रहा है मूल निवासी oligosaccharides पर की तुलना । इसके अलावा, यह भी माल की अधिक से अधिक मात्रा की आवश्यकता है। Oligosaccharides के मेथिलिकरण के रूप में Pettolino एट अल द्वारा वर्णित किया गया। 1। ईएसआई एमएस n आरई तटस्थ oligosaccharide KOH-प AXS से निकाली गई alditols पर प्रदर्शन जांच, और 2AB लेबल तटस्थ आरई oligosaccharide डब्ल्यू प AXS से निकाली गई बेलो वर्णित हैंw के रूप में एक उदाहरण स्पेक्ट्रा और deduced संरचनाओं की व्याख्या में सहायता करते हैं। एक ही दृष्टिकोण सभी enzymic हाइड्रोलिसिस से उत्पन्न oligosaccharides के लिए लागू किया जा सकता है। ईएसआई एमएस n स्पेक्ट्रा में टुकड़ा आयनों प्रति-ओ-methylated oligosaccharides एमएस में Domon और कॉस्टेलो के अनुसार Y और बी आयनों के रूप में पहचान की गई। 16 अन methylated हाइड्रॉक्सिल समूह (एस) की गैस चरण विखंडन के दौरान उत्पन्न n एक प्रदान करता है 14Da बड़े पैमाने पर अंतर "निशान" है कि शाखाओं में बंटी पैटर्न और glycosyl दृश्यों। 12-13 विखंडन घटना से उत्पन्न प्रत्येक निशान की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक ठोस लाइन के रूप में चिह्नित है (आंकड़े 3 और 4)। कई समाजिक संरचनाओं एक परिभाषित जन के लिए संभव हो रहे हैं, तो इन समाजिक ढांचे में, वाई और बी आयनों लाल और काले रंग में, चिह्नित कर रहे हैं क्रमशः।

ईएसआई एमएस 2, ईएसआई एमएस 3 और ईएसआई एमएस 4 spectप्रति-ओ-मिथाइल आरई तटस्थ oligo-glycosyl छद्म आणविक आयन मी / z 885 के विखंडन से उत्पन्न alditol के आर ए (पी 4 + Xyl राजभाषा) में 3 चित्र में दिखाया गया है। ईएसआई एमएस 2 स्पेक्ट्रम प्रचुर मात्रा में वाई शामिल मी / z 711, 551, और 391 पर आयनों, एक, दो और तीन pentosyl अवशेष, क्रमशः के नुकसान से उत्पन्न माता पिता आयन से। प्रचुर मात्रा में मी / z 711 आयन या तो एक गैर को कम करने टर्मिनल अंत Xyl अवशेषों की हानि या एक टर्मिनल पक्ष श्रृंखला आरा अवशेषों के नुकसान के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। नैदानिक ​​Y मी / z 391 आयन जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रम में की कमी से उत्पन्न किया जा सकता तीन गैर कम करने आरई oligosaccharide जो फिर Xyl राजभाषा छाछ या आरई oligosaccharide जो एक है पर एक पक्ष श्रृंखला आरा अवशेषों है से अंत Xyl के अवशेष आरई Xyl राजभाषा अवशेषों से 2 एन डी Xyl अवशेषों पर पक्ष श्रृंखला आरा अवशेषों। हालांकि वहाँ एक औपचारिक संभावना है कि इस तरह के रूप में अन्य संरचनाओं,Xyl 4 -Xyl राजभाषा, और (ए आर ए) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl राजभाषा इस को जन्म देना होगा इन संरचनाओं आयन टुकड़ा एंडो-xylanase polysaccharide नीचा या तो होता है या नहीं क्रमश: आसन्न glycosidic लिंकेज एक शाखा बात करने पर फोड़ना फोड़ना करने के लिए इस्तेमाल की विशिष्टता के रूप में विचार से बाहर रखा गया है। तदनुसार, नैदानिक ​​Y मी / z 551 आयन के नुकसान से उत्पन्न किया जा सकता दो गैर कम करने आरई oligosaccharide जो या तो फिर Xyl राजभाषा छाछ या आरई oligosaccharide जो पक्ष है पर पक्ष श्रृंखला आरा अवशेषों है से अंत Xyl के अवशेष अंत से पहले Xyl अवशेषों पर श्रृंखला आरा अवशेषों। इस प्रकार, चार संभव समाजिक संरचनाओं का प्रस्ताव रखा जा सकता है (चित्रा 3: मैं, द्वितीय, तृतीय और चतुर्थ)। प्रचुर मात्रा में वाई आयन मी / z 377 (चित्रा 3 देखें: आइए और आईआईए) और बी आयन मी / z 503 (चित्रा 3 देखें: आइए, आईबी, इवा और IVB) समाजिक अग्रदूत मीटर के आगे विखंडन से उत्पन्न/ z 711 आयन भी इस स्पेक्ट्रम में मनाया जाता है। ईएसआई एमएस 3 स्पेक्ट्रम (चित्रा 3) समाजिक अग्रदूत मीटर के विखंडन द्वारा दर्ज / z 711 मीटर की ऊंचाई पर आयनों के एक प्रमुख शिखर शामिल / z 537 (पी वाई के आयन 2 + Xyl दो निशान के साथ राजभाषा; आइए आयन अग्रदूत से उत्पन्न , आईबी, आईआईए, आईआईबी, IIIA, IIIb, IVA और IVB) और एम / Z 391 (एक निशान के साथ पी 1 + Xyl राजभाषा के वाई आयन, आयन आईआईबी, IIIA, IIIb, इवा अग्रदूत से उत्पन्न होता है और IVB)। इन दो प्रमुख चोटियों (मी / z 537 और एम / Z 391) समाजिक अग्रदूत मी / z 711 आयन छद्म के विखंडन से उत्पन्न से, एक और दो ​​गैर को कम करने के लिए टर्मिनल Xyl अवशेष, क्रमशः के नुकसान से उत्पन्न किया जा सकता -molecular माता पिता आयन मी / z 885 (पी 4 + Xyl राजभाषा) ईएसआई एमएस 2 के दौरान। मीटर की ऊंचाई पर अपेक्षाकृत कम बहुतायत चोटियों / z 377 (पी वाई के आयन 1 + Xyl दो निशान के साथ राजभाषा; precurso से उत्पन्नआर आयन आइए और आईआईए) और 551 (एक निशान के साथ पी 2 + Xyl राजभाषा के वाई आयन, आईबी और IIb आयन अग्रदूत से उत्पन्न) भी इस स्पेक्ट्रम में मनाया गया।

समाजिक अग्रदूत मी / z के विखंडन के ईएसआई एमएस 4 551 मीटर की ऊंचाई पर आयनों के एक प्रमुख शिखर शामिल / z 377 (पी वाई के आयन दो निशान के साथ 1 + Xyl राजभाषा) और एम / Z 391 (पी 1 के वाई आयन एक निशान के साथ Xyl राजभाषा) संरचनाओं के अग्रदूत आयन मैं और द्वितीय से उत्पन्न +। इसलिए सामूहिक सबूत सुझाव दिया है कि फिर glycosyl अनुक्रम (नैदानिक ​​विखंडन मार्ग मी / z 885 → 711 → 551 → 391, चित्रा 3II) आरा पक्ष श्रृंखला आरई Xyl राजभाषा अवशेषों से जुड़ी होते हैं, आरा पक्ष श्रृंखला दोनों से जुड़ी आरई Xyl राजभाषा और अंत से पहले (आरई Xyl राजभाषा से 1 सेंट Xyl छाछ) Xyl छाछ (नैदानिक ​​विखंडन मार्ग मी / z 885 → 711 → 537 → 391, चित्रा 3I) और, चित्रा 3III), आरा पक्ष श्रृंखला अंत से पहले आरई Xyl राजभाषा से (1 सेंट Xyl) Xyl छाछ (नैदानिक ​​विखंडन मार्ग मी / z 885 → 711 → 537 → 377 से जुड़ी आरा पक्ष श्रृंखला आरई Xyl राजभाषा (चित्रा 3IV) से 2 एन डी Xyl अवशेषों पर संलग्न।

[आरा एफ - - (1 → 3)] (+/-) -Xyl पी - (1 → 4): इन आयनों की मौजूदगी प्रस्तावित समाजिक संरचनाओं मैं, द्वितीय, तृतीय और चतुर्थ और तटस्थ आरई oligosaccharide संरचना की पुष्टि - [आरा एफ - (1 → 3)] (+/-) -Xyl पी - (1 → 4) - [आरा एफ - (1 → 3)] (+/-) -Xyl पी।

प्रति-ओ-methylated 2AB के ईएसआई एमएस 2 स्पेक्ट्रम लेबल fragm से उत्पन्न आरई oligosaccharideमीटर की ऊंचाई पर अर्ध आणविक [एम + एनए] का प्रलेखन + आयन / z 871 (पी 4 + 2AB) चित्रा 4. इस स्पेक्ट्रम मी / z 697 (पी 3 + 2AB एक साथ कम से सबसे प्रचुर मात्रा में वाई आयन भी शामिल है में दिखाया गया है निशान), मी / z 537 (पी 2 + 2AB एक निशान) और एम / Z 377 (पी 1 + 2AB एक निशान के साथ साथ), क्रमशः, या तो एक, दो या तीन गैर कम करने pentosyl अवशेषों के नुकसान से उत्पन्न। मी / z 697 आयन या तो एक गैर को कम करने टर्मिनल अंत Xyl अवशेषों की या जबकि मी / z 537 आयन एक टर्मिनल आरा अवशेषों के नुकसान से नुकसान के द्वारा उत्पन्न की जा सकती है, केवल दो टर्मिनल Xyl अवशेषों के नुकसान से उत्पन्न किया जा सकता । नैदानिक ​​विखंडन मार्ग (मी / z 871 → 697 → 537 → 377) / Z 871 (पी सुझाव दिया है कि फिर से रेखीय संयुक्त राष्ट्र के branched xylan रीढ़ oligosaccharide (एस) के अस्तित्व अर्ध आणविक आयन मीटर करने के लिए इसी 4 + 2AB )। हालांकि संयुक्त राष्ट्र के रैखिक शाखाओं xylosyl रीढ़ की हड्डी (पी 4 + 2AB) susce हैआगे पाचन के लिए ptible साइट के लिए विशिष्ट endoxylanase। इसलिए दो समाजिक मी / z 697 आयनों मौजूद कर सकते हैं। तदनुसार दो संभव समाजिक संरचनाओं का प्रस्ताव कर रहे हैं (चित्रा 4: मैं और द्वितीय)। इन समाजिक संरचनाओं में Y और बी आयनों लाल और काले रंग में क्रमश: लेबल रहे हैं। ईएसआई एमएस 3 स्पेक्ट्रम समाजिक अग्रदूत मी / z के विखंडन से दर्ज की गई 697 आयन मी / z 523 आयन (पी 2 + 2AB के वाई आयन दो निशान के साथ, चित्रा 4, संरचनाओं आइए, आईबी, आईआईए और IIb) उत्पन्न करता है, मीटर / z 363 आयन (दो निशान के साथ पी 1 + 2AB के वाई आयन, चित्रा 4, संरचना आईआईए) और एम / Z 377 में वाई आयन (पी 1 + 2AB एक निशान के साथ, चित्रा 4, संरचनाओं आइए और आईबी)। मी / z 377 पर टुकड़ा आयन केवल प्रस्तावित संरचना मैं और मी / z 363 पर टुकड़ा आयन केवल प्रस्तावित संरचना द्वितीय से उत्पन्न कर सकते से पैदा कर सकते हैं। इन दो आयनों की एक साथ उपस्थिति की पुष्टि प्रस्तावित संरचनाओं मैं और द्वितीय। इस प्रकार गेहूं एण्डोस्पर्म AXS की xylan श्रृंखला की फिर glycosyl अनुक्रम आरई Xyl छाछ (विखंडन मार्ग मी / z 871 → 697 → 523 → 363) और / या अंत से पहले Xyl छाछ (विखंडन मार्ग मी / z से जुड़ी एक आरा शाखा से मिलकर बनता है 871 → 697 → 523 → 377)।

AXS के एनएमआर विश्लेषण

MS-आधारित विश्लेषण या तो anomeric विन्यास (α / β) या शर्करा कि enzymic और शारीरिक (जैसे, एनएमआर) सहित अन्य तरीकों से प्राप्त किया जाना चाहिए डी / एल विन्यास के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते। विशेषता आरई कम हो tetrasaccharide (Xyl-Rha-पर्व-Xyl राजभाषा) के साथ heteroxylans के लिए, एनएमआर स्पेक्ट्रम anomeric पहचान और यह फिर oligosaccharide का अनुक्रमण के लिए अग्रणी संकेतों में शामिल है। हम एक भी कदम विधि के रूप में 600 मेगाहर्ट्ज -1 डी 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करने के लिए detकोह-प फादर पर गेहूं एण्डोस्पर्म कुल्हाड़ी आरई oligosaccharide, anomeric विन्यास (α / β) और शर्करा की डी / एल विन्यास के साथ पूरा glycosyl अनुक्रम एमिन। अनुनादों गेहूं कुल्हाड़ी oligosaccharides 17-18 से प्रकाशित कार्य (चित्रा 5, 1 टेबल) के आधार पर सौंपा गया। कुल्हाड़ी गेहूं एण्डोस्पर्म से निकाले का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम 5.39, 5.27 और 5.22 पीपीएम है कि एक टर्मिनल α एल आरा च अवशेषों की प्रोटॉन के लिए आवंटित कर रहे हैं, हे-3 की स्थिति से जुड़ी पर anomeric रासायनिक पारियों का बोलबाला है (टी α एल आरा च → 3 एस) अकेले branched (1,4) -β-Xyl पी रीढ़ अवशेषों की और दोनों ओ-3 और हे-2 पदों (टी α एल आरा च → 3 डी और दोगुना शाखाओं (1,4) -β-Xyl पी रीढ़ की हड्डी के अवशेष, क्रमशः (चित्रा 5 और 1 टेबल) की टी-α एल आरा च → 2 डी)।

च → 3 एस + डी) के α एल आरा एफ एच 1 संकेत पक्ष श्रृंखला दोगुना branched β-D-Xyl पी आसपास के साथ अकेले branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-3 की स्थिति से जुड़ी। 5.29 पर सिग्नल को सौंपा है (टी α एल आरा च → 3 डी + डी) α एल आरा च पक्ष श्रृंखला दोगुना branched β-D-Xyl की O-3 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत दोगुना branched β-D-Xyl पी सटे साथ पी अवशेषों। 5.24 पर सिग्नल को सौंपा है (टी α एल आरा च → 2 डी + डी) α एल आरा च पक्ष श्रृंखला के एच 1 संकेत से जुड़ी दोगुना branched β-D-Xyl पी सटे साथ दोगुना branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-2 की स्थिति।

आकृति 1

<पी वर्ग = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> चित्रा 1. प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का सारांश पैदा करने, सफ़ाई और कम करने के अंत (आरई) अनुक्रमण में नियोजित रणनीति का एक सारांश और आंतरिक क्षेत्र oligosaccharides। गेहूं की एण्डोस्पर्म arabinoxylans (AXS) दिखाया गया है। यह आंकड़ा रत्नायके एट अल से अनुमति के साथ reproduced किया गया है। (2014) 2। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. MALDI-TOF एमएस (ए) और ईएसआई-QTOF एमएस (बी - ई) मूल निवासी लेबल डब्ल्यू प AXS 2AB से endoxylanase द्वारा जारी oligosaccharides के विश्लेषण के रूप में चित्रा 1. MALDI-TOF एमएस स्पेक्ट्रम में उल्लिखित: (ए) ( संकेतों को एक के रूप में [एम + ना] + अभिवर्तन आयनों) की पहचान कर रहे हैं; के ईएसआई-QTOF एमएस chromatograms मिटाए आयन स्कैन: बी = पी 5-10 आंतरिक क्षेत्र oligosaccharides से निकाली गई (संकेतों के रूप में [एम + एनएच 4] + अभिवर्तन आयनों की पहचान कर रहे हैं), सी पी = 1-6 + 2AB आरई से निकाली गई डी = ईएसआई-क्यू-TOF पूर्ण; oligosaccharides एंड पी 3-8 जी अम्लीय oligosaccharides से निकाली गई (संकेतों के रूप में [एम + ना] + अभिवर्तन आयनों की पहचान कर रहे हैं) (संकेतों के रूप में [एम एच] + अभिवर्तन आयनों की पहचान कर रहे हैं) स्कैन स्पेक्ट्रम: 3.59-4.05 मिनट के बीच क्षेत्र (संकेतों दोनों [एम + ना] और [एम + एनएच 4] + अभिवर्तन आयनों के रूप में पहचाने जाते हैं: 3.10-3.48 मिनट, ई = ईएसआई-क्यू-TOF पूरा स्पेक्ट्रम स्कैन के बीच क्षेत्र ); पी = pentosyl इकाई (या तो आरा या Xyl); जी = uronosyl छाछ (GlcA); अंत oligosaccharides को कम = आरई; 2AB = 2 aminobenzamide; ईआईसी: निकाले आयन chromatogram। विज्ञापन / 53748 / 53748fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ईएसआई एमएस 2, ईएसआई एमएस 3 और ईएसआई एमएस प्रति-ओ-मिथाइल आरई तटस्थ glycosyl alditol के 4 स्पेक्ट्रा (पी 4 + Xyl राजभाषा) - मी / z 885. संकेतों के रूप में [एम आवंटित कर रहे हैं + ना] + छद्म आणविक आयन adducts। एक परिभाषित जन के लिए कई समाजिक संरचनाओं समाजिक ढांचे में तो संभव हो रहे हैं के रूप में y और बी आयनों, काले, लाल और में चिह्नित कर रहे हैं क्रमशः। प्रत्येक "निशान" विखंडन घटना से उत्पन्न एक ठोस लाइन के रूप में चिह्नित है। एक्स = Xylosyl अवशेषों; एक = Arabinosyl अवशेषों। ईएसआई एमएस 3 स्पेक्ट्रा रत्नायके एट अल से अनुमति के साथ reproduced किया गया है। (2014) 2।748fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. ईएसआई एमएस 2 और ईएसआई एमएस 3 प्रति-ओ-methylated 2AB के स्पेक्ट्रा लेबल तटस्थ आरई oligosaccharide (पी 4 + 2AB) - मी / z 871. संकेतों के रूप में [एम + एनए] आवंटित कर रहे हैं + छद्म -molecular आयन adducts। एक परिभाषित जन के लिए कई समाजिक संरचनाओं समाजिक ढांचे में संभव हो रहे हैं के रूप में, वाई और बी आयनों लाल और काले रंग में क्रमश: लेबल रहे हैं। प्रत्येक "निशान" विखंडन घटना से उत्पन्न एक ठोस लाइन के रूप में चिह्नित है। एक्स = Xylosyl अवशेषों; एक = Arabinosyl अवशेषों। यह आंकड़ा रत्नायके एट अल से अनुमति के साथ reproduced किया गया है। (2014) 2। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के आयन।

चित्रा 5
चित्रा 5. Anomeric कुल्हाड़ी oligosaccharides के 600 मेगाहर्ट्ज -1 डी 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम KOH- सोल फादर की endoxylanase उपचार द्वारा उत्पन्न की क्षेत्र 1 एच रासायनिक पारी 2.225 पीपीएम पर एसीटोन की एक आंतरिक मानक के लिए संदर्भित। टी-α एल आरा च → 3 एस: α एल आरा च पक्ष श्रृंखला अकेले branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-3 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत; टी-α एल आरा च → 2 डी: α एल आरा च पक्ष श्रृंखला दोगुना branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-2 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत; टी-α एल आरा च → 3 डी: α एल आरा च पक्ष श्रृंखला दोगुना branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-3 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत; टी-α एल आरा च → 3 एस + डी: α एल आरा च पक्ष श्रृंखला के साथ अकेले branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-3 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत दोगुना branched सटे β-डी Xyl p; टी-α एल आरा च → 2 डी + डी: α एल आरा च पक्ष श्रृंखला के साथ दोगुना branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-2 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत दोगुना branched सटे β-डी -Xyl p; टी-α एल आरा च → 3 डी + डी: α एल आरा च पक्ष श्रृंखला के साथ दोगुना branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-3 की स्थिति से जुड़ी एच 1 संकेत दोगुना branched सटे β-डी -Xyl p; 2-α एल आरा च → 3 S: 2-α एल आरा च पक्ष श्रृंखला अकेले branched β-D-Xyl पी अवशेषों की O-3 की स्थिति से जुड़ी अवशेषों की एच 1 संकेत; देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चीनी अवशेषों एच-1 / C-1 एच 2 / C-2 एच 3 / सी -3 एच -4 / C-4 एच-5 EQ / सी -5 एच-5 कुल्हाड़ी / सी -5
टी-α एल Araf → 3 S 5.396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
टी-α एल Araf 5.415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
टी-α एल Araf → 2 डी 5.223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
टी-α एल Araf → 2 डी + डी 5.243 / 4.16 3.98
टी-α एल Araf → 3 डी 5.272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
टी-α एल Araf → 3 डी + डी 5.298 / 4.18 3.96
2-α एल Araf → 3 S 5.548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
अल्फा-Xylp (कम) 5.185 / 91.9 3.55 3.72
बीटा Xylp (कम) 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
बीटा -4-Xylp + S 4.461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4.448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
बीटा-3,4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
एस + β-3,4-Xylp 4.514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
डी + β-3,4-Xylp 4.505
बीटा-3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4.482 3.45 3.74
बीटा-2,3,4-Xylp 4.638
एस + β-2,3,4-Xylp 4.627 3.59 3.87 3.88
डी + β-2,3,4-Xylp 4.616
बीटा-2,3,4-Xylp + S 4.593
β-2,3,4-Xylp + D 4.593
रासायनिक बदलाव के आंतरिक एसीटोन के सापेक्ष रिपोर्ट कर रहे हैं, 2.225 δ।
एस = अकेले branched β-Xylp
एस + डी = अकेले branched β-Xylp + दोगुना branched β-Xylp
डी = दोगुना branched β-Xylp
डी + डी = दोगुना branched β-Xylp + दोगुना branched β-Xylp

तालिका 1. 1 एच एनएमआर गेहूं एण्डोस्पर्म KOH-प फादर की endoxylanase उपचार द्वारा उत्पन्न जाइलो-oligosaccharides के संकेतों

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Discussion

अधिकांश मैट्रिक्स चरण कोशिका दीवार polysaccharides मालूम होता है बेतरतीब ढंग से कि अत्यधिक चर रहे प्रजातियों के पौधे, विकास मंच और ऊतक प्रकार 3 पर निर्भर करता है (दोनों glycosyl और गैर-glycosyl अवशेषों के साथ) प्रतिस्थापित किया है अनिवार्य जरूरतों। चूंकि polysaccharides माध्यमिक जीन उत्पादों रहे हैं उनके अनुक्रम प्राप्त नहीं टेम्पलेट है और वहाँ इसलिए कोई भी विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण है, इस तरह के रूप में न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के लिए मौजूद उनकी अनुक्रमण के लिए। शुद्ध लिंकेज-विशिष्ट hydrolytic एंजाइमों की उपलब्धता oligosaccharides को polysaccharides कि तब chromatographically fractionated हो सकता नीचा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान की गई है, और जब रासायनिक और भौतिक तकनीक के साथ संयोजन में इस्तेमाल पूरी तरह से अनुक्रम। चुनौती तो मूल polysaccharide अनुक्रम एक अभी भी है कि सफलतापूर्वक हो को संबोधित में इन जटिल मिश्रण को फिर से इकट्ठा करने के लिए है।

यहाँ हम एक दृष्टिकोण (आवेदन सीए की जिसका आदेश का वर्णनn विविध जा सकता है) कि स्थापित enzymic, रासायनिक और दोनों को कम करने के अंत (आरई) और heteroxylans के आंतरिक क्षेत्र glycosyl अनुक्रम (ओं) के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए शारीरिक तकनीकों के एकीकरण पर निर्भर करता है। यहाँ वर्णित नहीं एक अतिरिक्त पूरक तकनीक है कि oligosaccharides निस्र्पक के लिए बहुत उपयोगी साबित हुआ है पेस (कार्बोहाइड्रेट जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा polysaccharide विश्लेषण) Dupree 19 समूह द्वारा विकसित की है और यह आसानी से इस प्रोटोकॉल में एकीकृत किया जा सकता है अगर उपकरण उपलब्ध है। इसके अलावा, नियंत्रण रेखा क्रोमैटोग्राफी में बदलाव भी इस तरह के संगठनों ने मिलकर इनलाइन हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HILIC) आरपी क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा दोनों को अलग untagged / एक भी कदम में टैग oligosaccharides संभावना की पेशकश के रूप में उपयोगी हो सकता है। तकनीक heteroxylan श्रृंखला एंजाइमी (endoxylanase) हाइड्रोलिसिस से पहले (2 aminobenzamide (2AB) के साथ) को कम करने के अंत (आरई) टैगिंग पर भरोसा करते हैं। दो अलग अलग दृष्टिकोण (सारांश देखने मेंचित्रा 1) अपनाया जाता है। पहले में, अक्षत डब्ल्यू प AXS मूल आरई रीढ़ श्रृंखला चीनी अवशेषों को टैग करने 2AB के साथ इलाज किया और फिर एक endoxylanase के साथ इलाज किया 2AB लेबल आरई और आंतरिक क्षेत्र oligosaccharides क्रमश: कम करने का एक मिश्रण उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। एक दूसरा दृष्टिकोण में KOH-प फादर endoxylanase साथ hydrolyzed है पहले oligosaccharides जो बाद में 2AB के साथ चिह्नित कर रहे हैं का एक मिश्रण उत्पन्न करते हैं। इस बाद के परिदृश्य में KOH-प कुल्हाड़ी के मूल आरई 2AB के साथ लेबल नहीं होगा, क्योंकि यह क्षार निष्कर्षण कि कम करने, सोडियम borohydride (NaBH 4) निहित दौरान glycosyl-alditol को कम कर दिया गया था। इसलिए, 2AB लेबल oligosaccharides के बाद xylanase पाचन उत्पन्न, "आंतरिक" oligosaccharides और मूल आरई oligosaccharide से उत्पन्न एक 2AB टैग के बिना एक फिर alditol में शामिल होंगे जाएगा (चित्रा 1 देखें)। यह दृष्टिकोण भी polysaccharides यू के अन्य वर्गों के लिए लागू किया जा सकतागाना (जहां उपलब्ध हो) उचित एंडो-हाइड्रोलिसिस।

MS-आधारित दृष्टिकोण काफी oligosaccharides के मेथिलिकरण द्वारा बढ़ाया है endoxylanase उपचार के बाद उत्पन्न के बाद से संयुक्त राष्ट्र के methylated हाइड्रॉक्सिल समूह (एस) एन एमएस में प्रति-ओ-मिथाइल oligosaccharides की गैस चरण विखंडन के दौरान उत्पन्न एक 14Da बड़े पैमाने पर अंतर "निशान प्रदान करता है "है कि अकेले एमएस डेटा से नहीं बनाया जा सकता शाखाओं में बंटी पैटर्न की पहचान और glycosyl अनुक्रम में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 5-6 pentosyl अवशेषों (और किसी भी चीनी छाछ) की पहचान की है, लेकिन का ज्ञान होने से आता है अणु की संरचना; जहां यह उपलब्ध नहीं है तो प्रासंगिक मोनोसैकराइड और लिंकेज विश्लेषण एमएस n में इन कार्य करने से पहले किया जाना चाहिए। इसके अलावा संकेतों आरई अम्लीय oligosaccharide alditol, कोह-प फादर से उत्पन्न करने के लिए इसी (Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: मी / z 761) और चर्चाaracteristic dicot xylan आरई glycosyl अनुक्रम (Xyl 2 -Rha-पर्व-Xylitol: मी / z 761), अगर मौजूद है, न कि दोनों के रूप में प्रतिष्ठित किया जा करने में सक्षम है मूल रूप में एक ही आणविक जन हैं, लेकिन उनकी एमएस विखंडन से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ( एमएस एन) स्पेक्ट्रा जो सबसे अच्छा methylated oligosaccharides पर किया जाता है। अंत में, एमएस आधारित तकनीक या तो anomeric विन्यास के बारे में जानकारी प्रदान करने में असमर्थ रहे हैं (α / β) glycosidic लिंकेज या sugars- के डी / एल विन्यास के इस सहित वैकल्पिक तरीकों, द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए enzymic और शारीरिक (जैसे, एनएमआर)।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

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References

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रसायन विज्ञान अंक 109 सेल दीवार Heteroxylan 2 aminobenzamide Endoxylanase अंत और आंतरिक क्षेत्र oligosaccharides को कम करना मेथिलिकरण Glycosyl अनुक्रम MALDI-TOF एमएस ईएसआई-QTOF एमएस ईएसआई एमएस
संयंत्र दीवार Heteroxylans का अनुक्रमण Enzymic, रासायनिक (मेथिलिकरण) और शारीरिक (मास स्पेक्ट्रोमेट्री, परमाणु चुंबकीय अनुनाद) तकनीकों का प्रयोग
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Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A.… More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

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