Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Published: December 17, 2015 doi: 10.3791/53749

Abstract

Filamenteuse-actine joue un rôle crucial dans la majorité des processus cellulaires, y compris la motilité et, dans les cellules immunitaires, la formation d'une interaction cellule-cellule clé connue sous le nom de la synapse immunologique. F-actine est également supposé jouer un rôle dans la régulation des distributions moléculaires à la membrane des cellules, y compris la dynamique de vésicules sous-membraneuse et le regroupement des protéines. Bien que les techniques de microscope optique standard permettent observations généralisées et limitée par la diffraction à faire, de nombreux événements cellulaires et moléculaires, y compris le regroupement et le flux moléculaire se produisent dans les populations à longueur des échelles bien en dessous du pouvoir de résolution de la microscopie optique standard. En combinant totale fluorescence par réflexion interne à la résolution d'imagerie procédé illumination structurée ultra microscopie, l'écoulement moléculaire à deux dimensions de la F-actine à la synapse immunitaire des cellules T a été notée. Spatio-temporelle spectroscopie de corrélation d'images (STICS) a ensuite été appliqué, ce qui génère resul quantifiablets sous la forme d'histogrammes de vitesse et des cartes vectorielles représentant directionnalité de l'écoulement et de l'ampleur. Ce protocole décrit la combinaison de l'imagerie et STICS techniques de super-résolution pour générer des vecteurs d'écoulement au niveau de détail sous-diffraction. Cette technique a été utilisée pour confirmer un flux d'actine qui est symétrique centripète rétrograde et tout au long de la périphérie des cellules T lors de la formation de la synapse.

Introduction

Le but de l'expérience est à l'image et de caractériser le flux moléculaire de filamentous- (F-) actine dans les cellules vivantes T, au-delà de la limite de diffraction afin d'établir le sens d'écoulement et de l'ampleur au cours synapse immunologique (IS) de la formation. Cette technique sera réalisée à l'aide d'un microscope à éclairage structurée (SIM) en mode fluorescence totale de réflexion interne (TIRF), l'imagerie de cellules T Jurkat qui font synapse artificielle sur l'activation des lamelles revêtues d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les formes se situe entre un lymphocyte T et sa cible; une cellule présentatrice d'antigène (APC) à l'récepteur des cellules T (TCR) 1,2 d'activation. Comme cela est la première étape pour déterminer si le système immunitaire adaptatif génère une réponse immunitaire à une infection, les conséquences de la réactivité aux stimuli incorrecte peut provoquer un certain nombre de maladies. L'importance de l'interaction des cellules T-APC est bien documentée, cependant, le rôle (s) de l'adulte est après si TCR initialeinternalisation gnal sont pas encore pleinement compris.

Comme le cytosquelette est pensé pour aider deux processus liés à l'activation du TCR (le mouvement des molécules à la membrane plasmique et le contrôle des molécules dépendant du cytosquelette d'actine 3,4 signalisation), de comprendre comment le cytosquelette réorganise spatialement et temporellement feront bien comprendre les étapes de la réorganisation moléculaire pendant la formation de la synapse. Le flux rétrograde de F-actine est pensé pour corral grappes TCR vers le centre de la synapse immunologique, cette translocation est considéré comme vital pour la cessation du signal et le recyclage; aidant l'équilibre délicat de l'activation des cellules T 5.

Bien que la microscopie à fluorescence standard est un outil flexible qui continue de donner un aperçu sur de nombreux événements biologiques y compris les interactions cellule-cellule, elle est limitée par la capacité du système pour résoudre avec précision de multiples fluorophores résidant plus près que la Diffrlimite d'action (≈200 nm) de l'autre. Comme de nombreux événements moléculaires dans les cellules impliquent des populations denses de molécules et présentent réarrangement dynamique soit en repos ou lors de la stimulation spécifique, la microscopie optique conventionnelle ne fournit pas une image complète.

L'utilisation de l'imagerie super-résolution a permis aux chercheurs de contourner la limite de diffraction en utilisant une variété de techniques. Seule molécule localisation microscopie (SMLM) tels que PALM et STORM 6,7 a la capacité de résoudre l'emplacement de molécules jusqu'à une précision de l'ordre de 20 nm, cependant, ces techniques reposent sur ​​des temps d'acquisition longues, construire une image sur plusieurs cadres . En général, cela nécessite des échantillons à être fixes ou pour les structures à faible mobilité présentent fluorophores si simples ne sont pas interprété comme de multiples points. Alors que l'épuisement de l'émission stimulée (STED) imagerie permet de super-résolution par le biais très sélectif confocale excitation 8, le balayage nécessaireapproche peut être lente sur des champs entiers de cellules de vue. STED démontre également phototoxicité important pour des résolutions plus élevées en raison de l'augmentation de la puissance du faisceau d'épuisement.

Structuré microscopie éclairage (SIM 9) offre une alternative à ces méthodes, capables de doubler la résolution d'un microscope à fluorescence standard et est plus compatible avec l'imagerie des cellules vivantes que les techniques de SMLM actuelles. Il utilise des puissances inférieures laser, sur un système à grand champ pour les champs de cellules entières de vue; Fournir davantage des vitesses d'acquisition, et est compatible avec l'étiquetage fluorophore standard. La nature à grand champ de la carte SIM permet également l'utilisation de la fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) pour l'excitation hautement sélectif, avec des profondeurs de pénétration dans la dimension axiale de <100 nm.

Spectroscopie de corrélation d'images (ICS) est une méthode de corrélation des fluctuations d'intensité de fluorescence. Une évolution de ICS; Im spatio-temporelleâge spectroscopie de corrélation (STICS 10) corrèle signaux fluorescents intracellulaires dans le temps et l'espace. En corrélant intensités de pixels entourant les pixels de retard dans des trames par l'intermédiaire d'une fonction de corrélation, l'information est acquise en ce qui concerne les vitesses d'écoulement et de directivité. Pour assurer objets statiques ne pas interférer avec l'analyse STICS, un filtre d'objet immobile est mis en œuvre, qui travaille en soustrayant une moyenne mobile des intensités des pixels.

La technique présentée ici est considérée comme étant la première démonstration de la spectroscopie de corrélation d'image étant appliqué à des données de microscopie super-résolution pour quantifier le flux moléculaire dans 11 des cellules vivantes. Cette méthode améliore l'imagerie par diffraction limitée des flux F-actine via une analyse STICS 12 et conviendrait chercheurs qui souhaitent déterminer le flux moléculaire en deux dimensions dans les cellules vivantes, à partir de données acquises à des résolutions spatiales au-delà de la limite de diffraction de la lumière.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Remarque: Les étapes 1 et 2 ont lieu avant le jour de l'imagerie; assurer tous les médias et les suppléments pour être utilisés avant ou le jour de l'imagerie sont équilibrées. L'équilibrage est réalisé par le réchauffement des médias et des suppléments à 37 ° C dans un incubateur réglé à 5% de CO 2. Toutes les étapes des travaux de culture cellulaire et lamelle placage se déroulent dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire.

1. transfection des cellules

  1. Transfecter les cellules T à imager 24 h avant l'expérience avec un plasmide codant pour une fusion pour construire fluorescent F-actine étiquetage de la GFP et de l'imagerie. Remarque: Les cellules doivent être séparées de 24 heures avant la transfection (48 heures avant l'imagerie) pour assurer cellules sont à une santé optimale et dans leur phase de croissance logarithmique.
    1. Placez 5 ml de supplément RPMI (RPMI 1640 plus 10% de FBS et 1% Pen-Strep (facultatif)) dans un seul puits d'une plaque à 6 puits dans l'incubateur pour équilibrer.
    2. Pastille 2 x 10 7 cellules T culterée à 37 ° C 5% de CO 2 en supplément RPMI en utilisant un tube de centrifugation à 327 g pendant 5 min et laver dans un volume égal de milieu d'électroporation préchauffé. Remarque: moyen électroporation est un milieu de sérum réduit contenant des tampons et des suppléments (voir consommables).
    3. Après re-granulation à 327 xg pendant 5 min, remettre les cellules dans 500 ul de milieu d'électroporation et ajouter lentement à une cuvette, ajouter 5 pg du plasmide dans la PCR note dH 2 O pour le marquage F-actine.
    4. Tapoter doucement la cuvette sur l'espace de travail de la hotte pour assurer l'élimination de toutes les bulles d'air dans les médias, ce qui peut provoquer un arc de l'électricité et de distribuer les cellules uniformément dans les médias.
    5. Allumez l'appareil d'électroporation et de régler la tension de 300 V et la capacité à 290 Ω. Échantillon électroporer utilisant une décroissance exponentielle pendant 20 msec. Note: L'optimisation peut être exigée pour différentes cellules et les différentes constructions plasmidiques.
    6. Une fois que le protocole de transfection estcomplets, des cellules de stocker sur la glace pendant 1 min avant de poursuivre.
    7. Soigneusement transférer les cellules de la cuvette à la plaque de 6 puits contenant 5 ml de supplément RPMI équilibrée de l'étape 1.1.1.
    8. Incuber les cellules O / N à 37 ° C + 5% CO 2.

2. lamelles de manteaux et Supplément d'imagerie pré-chaud

  1. Des lamelles de Coat avec des anticorps pour induire la stimulation des cellules T.
    1. Manteau chaque chambre d'une lamelle de 8 puits avec 1 pg / ml αCD3 et αCD28 dans 200 pi de PBS.
    2. Conserver à 4 ° CO / N. Alternativement, des lamelles de Coat 2 h avant à l'imagerie et de garder dans un incubateur à 37 ° C pour réduire la dérive pendant le processus d'imagerie en minimisant les changements de température à la lamelle.
  2. Créer un échantillon de test de lamelle avec 0,1 um sous-diffraction microsphères fluorescentes.
    1. Vortex solution stock de perles pour éviter les grumeaux.
    2. Sur une nouvelle, propre lamelle de ee même type que ceux utilisés à l'étape 2.1.1, une pipette 5 pi microsphère fluorescente solution stock sur la surface (selon les instructions du fabricant).
    3. Répandre la solution de microsphères sur la lamelle avec la pointe de la pipette.
    4. Laisser sécher, puis appliquer 200 pi de milieu de montage tels que PBS.
      Remarque: le milieu de montage doit correspondre à celui utilisé pour les échantillons de cellules d'imagerie.
  3. Equilibrer HBSS (+ 20 mM de HEPES, ci-après dénommé «HBSS supplément ') dans un tube de centrifugation en plaçant dans un incubateur à une pré-O chaud / N à 37 ° C + 5% CO 2.
    Remarque: l'ajout de HEPES est de tamponner CO 2, si vous utilisez une chambre d'incubation avec le CO 2 entrée sauter cette supplémentation.

3. Microscope Set-up

  1. Tournez sur la scène haut-incubateur du microscope et le lieu suffisamment d'eau distillée FRBR-SIM dans le réservoir du microscope pour couvrir entièrement la base de l'élément de chauffage. Permettre à l'eau à l'equilibrate à 37 ° C. Ajouter le collier de chauffage à l'objectif, également mis à 37 ° C.
    Remarque: En raison de la sensibilité du set-up, ces étapes sont effectuées la nuit avant de sorte que les composants optiques sont à une température stable avant l'imagerie.
  2. Placez la FRBR 488 bloc réseau compatible dans le trajet de la lumière du microscope et de fixer en place.
    1. Changez le mode de canal et le câble de fibre à la position «unique» sur la scène de lit et d'un microscope laser respectivement à engager le chemin optique correcte pour le mode FRBR-SIM. Remarque: Sauter cette étape va conduire à une erreur (figure 1A) dans la fenêtre du logiciel.
  3. Mettez tous les microscopes et d'ordinateurs composants et ouvrez le logiciel de commande d'acquisition.
    1. Ouvrez le panneau de OC, Ti Pad, N-SIM Pad et ND Acquisition fenêtres (figure 1B). Dans le "Panneau de OC 'sélectionnez l'option' FRBR 488 '(figure 2B, flèche jaune). Dans la fenêtre N-SIM Pad, sélectionnez la FRBR-SIM »et les paramètres« en mouvement »(figure 2C, flèches jaunes). Sélectionnez le bouton Paramètres (Figure 1C, boîte jaune) et sélectionnez «FRBR 488 (100x pour la FRBR 488nm) 'dans le menu déroulant, frappé« Appliquer »et« OK ».
    2. Définissez les paramètres de la caméra dans les «Paramètres de DU897 'à: Frame Rate 50 ms, lecture en mode, EM gain de 3 MHz à 14-bit, et EM Gain multiplicateur 300 avec un gain de conversion de 1 (figure 1C, la boîte verte).
      Remarque: voir des résultats représentatifs pour des considérations de taux de trame.
    3. Calibrer l'éclairage du microscope pour la FRBR-SIM, en sélectionnant l'objectif 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sur le «N-SIM Pad 'tourner la puissance du laser 488 nm à 10%.
      Remarque: La taille des pixels des images brutes est de 60 nm, avec un champ de vision de 512 x 512 pixels.
    4. Nettoyez l'objectif en utilisant des tissus de verre pour enlever la poussière et l'huile.
    Trouver le plan focal de la FRBR-SIM.
    1. Commencez avec l'objectif dans le plan z le plus bas possible. Placer une goutte d'huile de lentilles de l'objectif et ajouter l'échantillon de microsphères fluorescentes provenant de l'étape 2.2 de la platine du microscope.
    2. Sélectionnez la fonction Parfait Focus System (PFS) situé sur le corps du microscope.
    3. Lentement, déplacez l'objectif à travers le plan z jusqu'à ce que le bouton PFS cesse de clignoter pour confirmer le plan focal a été atteint.
    4. Passez à la vue «Live» sur le logiciel de contrôle et de l'image des microsphères pour les derniers ajustements effectués à l'aide de la roue de micro-manipulateur PFS.
  4. Observez l'éclairage uniforme sans émission de fluorescence out-of-focus-dessus de la 75 nm onde évanescente.
    Remarque: Confirmation illumination structurée est remplie par l'observation d'un motif d'éclairage fluctuant à partir de l'échantillon de microsphères fluorescentes.
  5. Mesurer l'échantillon de microsphères fluorescentes et de quantifier la résolut d'imagerie amélioréeion en observant la largeur à mi-hauteur (FWHM) du profil d'intensité.
    1. Ouvrez le logiciel Analyser (de v4.20.01), avec le module NIS-A N-SIM Analyse installé et sélectionnez "Applications" -> «Afficher la fenêtre N-SIM".
    2. Avec l'éclairage par contraste de modulation (IMC) et la suppression du bruit à haute résolution (HRNS) mis à 1 pour les ensembles de données de la FRBR-SIM (figure 2), reconstruire l'image de l'échantillon de microsphères pour générer une image reconstruite de 1024 x 1024 pixels avec une taille de pixel de 30 nm.
    3. Utilisation de l'outil de profil de ligne d'une largeur de 1 pixel (figure 3A, boîte jaune), tracer une ligne à travers le centre d'une seule microsphère.
    4. Sélectionnez le bouton FWHM (figure 3B, boîte jaune) et cliquez à l'maxima d'intensité de la distribution gaussienne, suivi par ses minima d'intensité.
    5. Confirmation de la FWHM de la microsphère est comprise dans l'intervalle de 100 nm (Figure 3C). Remarque: la résolution achlorsque l'imagerie d'échantillons biologiques ieved varieront en fonction du signal de bruit à partir de l'efficacité de marquage et la fluorescence de fond.

4. Préparation de l'échantillon pour l'imagerie

  1. Préparation lamelle.
    1. Récupérer lamelle αCD revêtu de l'étape 2.1 de réfrigérateur ou incubateur et retirer PBS contenant αCD3 et αCD28 de chaque puits.
    2. Ajouter 200 ul de HBSS supplément préchauffé provenant de l'étape 2.3 dans chaque puits de la lamelle. Laver et retirer les pour assurer un minimum de αCD3 et αCD28 est laissé en solution. Ajouter 200 ul d'un autre supplément de la HBSS pour les puits de lamelle.
    3. Nettoyez le dessous de la lamelle avec le tissu de lentille pour enlever l'huile et les particules.
  2. Position lamelle sur la platine du microscope et de trouver le plan focal de la FRBR de la lamelle en utilisant le plan z PFS que l'on trouve dans l'étape 3.4.
  3. La préparation des cellules.
    1. Introduire à la pipette 200 pi de la con de médiascontenant des cellules transfectées de l'étape 1.1.8 dans un tube de micro-centrifugeuse.
    2. Cellules de culot dans une micro-centrifugeuse à 268 g pendant 20 sec et retirer les supports de cellules.
    3. Resuspendre les cellules dans 200 pi préchauffé supplément HBSS de l'étape 2.3.

5. Les cellules d'imagerie

  1. Prendre supplément HBSS contenant des cellules au microscope et la pipette 200 ul doucement dans l'un des puits.
  2. Tout en restant dans le plan focal de la FRBR à la lamelle (en mode PFS), utiliser le microscope oculaire et l'éclairage à épifluorescence pour suivre cellules fluorescentes approchant la lamelle.
  3. Une fois que les cellules se posent sur la lamelle, passer en mode 'Live' dans la N-SIM Pad pour amener l'image sur le moniteur et vérifier les cellules sont en discussion sur l'écran de l'ordinateur.
  4. Pour un temps record des cours, ouvrir la fenêtre ND Acquisition et sélectionnez l'onglet 'Time', cliquez sur 'Ajouter' et réglez «Interval» pas de retard, 'Durée'à 10 min, 'boucles' est mis à 1.
    Remarque: La durée peut être modifiée en fonction du procédé d'intérêt; le logiciel STICS peut extraire des résultats quantitatifs avec piles d'images de ≈ 10 cadres lorsqu'il a été capturé avec 'No Delay'.
  5. Avec les réglages d'acquisition identique à l'échantillon de perles, commencer l'enregistrement des données en sélectionnant "Exécuter maintenant" dans la fenêtre ND Acquisition.

6. Reconstruction SIM Images

  1. Après l'imagerie est terminée, ouvrez le logiciel Analyser (de v4.20.01), avec le module NIS-A N-SIM Analyse installé et sélectionnez "Applications" -> «Afficher la fenêtre N-SIM".
  2. Avec l'éclairage par contraste de modulation (IMC) et la suppression du bruit à haute résolution (HRNS) mis à 1 pour les ensembles de données de la FRBR-SIM (Figure 2), de reconstruire un (ou en utilisant l'outil de lots multiples) de fichier SIM première pour produire une image reconstruite SIM.
  3. Confirmez le fichier reconstruit a une taille de pixel de 30 nm, indiqué dans lel'image barre d'état.
    Remarque: La taille du pixel ne modifie pas l'analyse des STICS mais il doit être au moins 2x plus petit en dimension à la résolution spatiale de la PSF afin d'assurer la corrélation spatiale entre les pixels.
  4. Exporter les données sous fichiers .tiff, prêt pour l'analyse STICS.

7. Analyse STICS

  1. Télécharger et extraire le STIC (C) s package logiciel Matlab (Wiseman de laboratoire; disponibles comme information supplémentaire). Le stics_vectormapping.m de script est le noyau d'une seule analyse des STICS canaux et les 30 premières lignes de code sont utilisés pour définir les paramètres d'entrée tel que défini à la section 2.1 du manuel. Ouvrez ce script et de définir les paramètres d'entrée pour la FRBR-SIM analyse des données. Il est suggéré d'ajouter aussi le dossier de S STIC (C) avec des sous-dossiers à la machine chemin Matlab locale, comme détaillé dans l'annexe du manuel.
    1. Définir les paramètres d'entrée pour l'analyse des données en modifiant les lignes correspondantes du code
    2. Pour effectuer analyse des données FRBR-SIM pour générer une carte vectorielle, définissez les paramètres temporels à sous-région temporelle dans la ligne 31 le nombre maximal de trames et le décalage temporel dans la ligne 32 à 1. Pour obtenir une série chronologique de cartes vectorielles varier ces paramètres .
    3. Pour le filtre d'élimination Immobile, régler le paramètre «filtrage» (ligne 23) à «Moyenne mobile» et régler le paramètre 'MoveAverage' (ligne 24) à 21.
      Remarque: Ce paramètre a été montré à travailler pour de grands signaux de fluorescence mouvement lent et, comme il est basé sur la soustraction cadres de série de la trame en cours d'analyse.
    4. Changer lignes 33-38 pour définir le nom des fichiers et les titres des cartes vectorielles de sortie de sortie, ainsi que le chemin du répertoire de sortie et définissent dans quel format les carte vectorielle images doivent être enregistrées.
Taille des pixels (pm) 0.03 pm Ligne 19
Frame rate (sec) 1 seconde Ligne 20
Temps de latence maximale (images) 20 images Ligne 21
Taille de la sous-région (pixels) 8 pixels Ligne 29
Espacement de la sous-région (pixels) 1 pixel Ligne 30
  1. Ouvrez les run1ChannelSTICS de script dans la fenêtre Editor Matlab. Chargez la série d'image en exécutant lignes 1-23 de ce script.
    Remarque: Ce script peut être utilisé pour charger et pré-processus série d'images, tracer les cartes vectorielles et des histogrammes de vitesse et de lancer un traitement par lots pour de nombreux fichiers. Si nécessaire, recadrer l'image pour une région d'intérêt en utilisant la ligne 24-26 de ce script.
    1. Exécuter les lignes 29-35 de run1ChannelSTICS pour commencer l'analyse STICS. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez un polygone pour indiquer une région d'intérêt (ROI), si désiré. Assurez-vous que le retour sur investissement ne se chevauchent pas avec le bord de la cellule, comme des artefacts limites se produisent lorsque STICS analyse ces rerégions.
    2. Exécuter les lignes 38-52 pour afficher la carte de vecteur. Pour tracer l'histogramme vitesse de grandeur, lignes 53-72 exécuter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Paramètres de microscope

Après avoir atteint avec succès toutes les étapes le chercheur aura éclairage structuré accompli (SIM) Imagerie du flux F-actine dans une synapse des cellules T (vidéo 1), et quantifié ce flux moléculaire par spectroscopie corrélation d'images spatio-temporelle (Figure 4 11). Avant d'enregistrer des images, assurer l'éclairage de l'échantillon est uniforme à travers les neuf images brutes et que l'éclairage structuré sous la forme de franges de moirage sont observées à l'échantillon (figure 5), ce sont les deux indicateurs de la lamelle est à plat sur ​​la scène et la TIRF- SIM set-up est correctement aligné.

Il est important de garder la puissance du laser faible (≤10%) pour assurer cellules restent en aussi bonne santé que possible durant l'expérience. Si expression fluorescente est faible, même après optimisation de til électroporation étapes, augmenter le temps d'exposition de chaque image brute au-dessus des énoncés 50 ms et / ou les paramètres de conversion Gain. Comme la FRBR-SIM nécessite 9 images brutes, 1 pour chacun des 9 orientations d'éclairage requis par image reconstruite, ce qui augmente le temps d'exposition permettra de réduire le taux de trame. Dans cette expérience, une exposition de 50 ms permet ≈1 trame reconstruite par seconde (également compris grille temps de rotation), réduisant le risque d'artefacts de mouvement vu lorsque des événements plus rapides se déplacent à travers multiples éclairage maxima dans une image brute.

Selon la vitesse de l'écoulement moléculaire à l'étude, l'augmentation de la durée d'exposition peut introduire des artefacts de mouvement; les chercheurs devraient garder des temps d'exposition au minimum requis pour un bon signal. Comme la taille des pixels dans les images SIM sont inférieures à celles des images de fluorescence standard, les populations moléculaires présentant des vitesses d'écoulement plus rapides peuvent passer à travers la sous-région devant un ultérieur frame est acquis. Pour le logiciel STICS de corréler le signal de fluorescence dans cette région plus petite plus rapide des taux d'image sont nécessaires par rapport aux ensembles de données de fluorescence standard. Par exemple, une taille de la sous-région de 8 x 8 pixels de données SIM représente une zone de 240 x 240 nm tandis qu'un pixel sous-région à partir d'un ensemble de données de fluorescence standard de 8 x 8 représente une superficie de 1,7 pm (avec une taille de pixel supposé de 200 nm).

Pour de plus longs cours (> 3 min) lots de données peuvent être prises en utilisant 'acquisition ND »pour réduire l'exposition de laser pendant la formation des synapses (par exemple, l'imagerie pendant 10 secondes toutes les minutes pendant 10 minutes va exposer la cellule à la même puissance du laser cumulative que l'imagerie de <2 min en continu).

Reconstructions sous-optimale de l'imagerie SIM sont démontrés dans la figure 6, où le même données brutes a été reconstruit en utilisant différents haute Résolutisur la suppression de bruit (paramètres HRNS), les transformées de Fourier à terme (FFT) et à moitié plein de largeur maximum de profils de la fibre en surbrillance sont également présentés. Réglage de la HRN est un équilibre entre l'augmentation de reconstruction des artefacts dus à la mauvaise-signal-bruit et augmenter la résolution. Un HRN qui est trop faible (<1) peut donner des images granuleuses avec l'augmentation des artefacts SM hexagonales, tandis qu'un réglage trop élevé HRNS (> 1) peut 'clip' et jeter les données à haute résolution (considéré comme un diamètre de FFT réduite). Une résolution de> 100 nm indiquerait la nécessité de relancer la reconstruction avec des paramètres différents, si les résolutions sont encore sous-optimale réacquérir les données avec une configuration optimisée de microscope peut être nécessaire.

Imagerie et de quantifier le flux moléculaire

Pour flux moléculaire de l'image, des données de séries chronologiques a été prise de cellules T d'atterrissage et la formation d'une synapse sur un stimulateur coverslip, F-actine peut être vu à l'écoulement d'une manière rétrograde à partir de la périphérie de la cellule vers le centre de la cellule. Comme F-actine devient moins dense vers le centre de l'analyse des STICS cellulaires a été effectuée seulement à la périphérie de la synapse, cette région est également où microamas de signalisation sont connus pour provenir pendant la formation des synapses prolongée.

Lors de l'acquisition et l'analyse de données à l'aide STICS il est important de comprendre le programme repose sur la corrélation des fluctuations fluorescentes dans les sous-régions sélectionnées pour former une fonction de corrélation plus élevée et plus lisse (CF). Le nombre absolu de cadres nécessaires pour générer une sortie de STICS succès est pas exact que le logiciel repose davantage sur la création d'une sortie par le nombre total de fluctuations du signal constructif au sein de ces sous-régions. Par exemple, si l'ensemble de données dispose de 20 mobiles, des protéines marquées dans chaque sous-région circulant dans les mêmes STICS de direction aura besoin de moins de cadres gèneévaluer une sortie fiable, tandis qu'un sous-région avec 5 résultats mobiles de protéines dans une fonction de corrélation plus faible et peut nécessiter plusieurs cadres. Le nombre exact de trames et la taille du sous-région utilisés dépend de la nature des événements moléculaires étant imagé et doit être optimisée par l'utilisateur.

Utilisation de «Temporal cultures frame 'outil du STICS il est possible d'analyser des sous-ensembles de flux moléculaire à travers le temps: permet aux chercheurs de voir si les débits changent dans la même cellule en fonction de différentes conditions cellulaires ou des stimuli environnementaux tels que avant et après les traitements médicamenteux. Le filtre d'objet immobile est conçu pour éliminer une population fluorescente immobile avant d'analyser la population fluorescente mobile. Grâce à cette approche, les images contenant des pourcentages de population statiques jusqu'à 90% peut encore être analysés avec succès 10. Réglage du filtre immobile à 21 cadres filtre toutes les populations fluorescentes qui restent statique pour cette période de temps ou plus, ce qui ne contribue pas au flux rétrograde lors de la stabilisation dynamique de la synapse immunologique.

Figure 1
Figure 1. Microscope Les paramètres d'acquisition. (A) Faits saillants les paramètres N-SIM Pad utilisés pour l'expérimentation et l'erreur «Mauvais Fibre 'lorsque les modes de canal et une seule fibre ne sont pas sélectionnés. (B) Toutes les fenêtres nécessaires pour mettre en place, d'enregistrer et reconstruire une image d'éclairage structuré sur le système SIM. (C) N-SIM Pad et Paramètres N-SIM pop-out fenêtre (la boîte jaune) permettent de sélectionner la configuration de barreaux après avoir placé physiquement le 488 nm réseau dans le microscope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ontenu "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 2
Figure 2. Des paramètres de reconstruction pour l'image finale. Lors de la sélection sur le bouton 'Param »(la boîte jaune), sélectionnez la FRBR-SIM dans le menu déroulant, et d'abord définir à la fois le« Illumination Modulation Contraste' (IMC) et «Suppression du bruit à haute résolution »(HRNS) à 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. largeur à mi-hauteur (LMH) mesure. En utilisant le logiciel d'analyse (A) montre un graphique gaussien de l'outil de l'intensité de la ligne sélectionnée (la boîte jaune) et tiré à travers une image reconstruite SIM d'un échantillon de perles. ( (C) montrant une résolution de 120 nm dans ce cas . La baisse d'intensité de fluorescence est un artefact connu de reconstruction SIM causée par le bruit, pour amortir cet effet la suppression de bruit à haute résolution peut être réduite (Figure 5C), à un coût de la résolution. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 4
Figure 4. représentatifs des données d'éclairage structuré et STICS sortie. Un T Jurkat cellules exprimant la GFP-étiquetée F-actine imagées par la FRBR-SIM sur une lamelle de stimulation pour la génération de synapse immunologique. Cinq minutes après le contact, un temps-cours a été prélevé et analysé en utilisant le programme d'analyse STICS. Boîtes jaunes représentent les régions agrandies tandis que les cartes vectorielles démontrent le flux rétrograde de F-actine à la périphérie de la synapse. Vectorielles couleurs indiquent la vitesse de l'écoulement moléculaire dans cette sous-région, les données de vitesse est tracée sur un histogramme. En raison de la sélectivité de z-excitation TIRF-SIM fournit, l'échantillon peut être perdue de mise au point si elle se détache ou se déplace loin de la lamelle couvre-objet par l'évolution dans le temps de l'expérience à cause de la motilité ou de fronçage. Cela se voit ici dans le panneau en haut à droite comme une réduction de la densité du vecteur. La réduction est le résultat de l'application du filtre STICS immobile au sous-régions qui ont montré aucun fluctuations fluorescents pour la période de temps définie par l'utilisateur. Ce résultat souligne l'importance des régions que la sélection qui contiennent signal de fluorescence pour l'ensemble de la période. Lank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. images Raw SIM. Les neuf premières images sur la gauche montrent les 9 orientations de la grille nécessaire pour produire une image FRBR-SIM. Cellule imagé est une cellule T Jurkat exprimant la GFP étiqueté F-actine, la cellule zoom montre l'un des neuf premières images, démontrant éclairage non uniforme avec des franges de moirage, en particulier autour de la périphérie de la cellule. Bien que l'éclairage structuré est pas visible des interactions entre la lumière et l'échantillon créent des zones de variation de force d'illumination, après reconstruction il en résulte une image avec une résolution améliorée. Les deux barres d'échelle sont 5 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 6
Figure 6 haute résolution de suppression du bruit (HRNS) Les réglages des paramètres sous-optimale conduisent à la reconstruction de l'image sous-optimale..; (A) montre les différences de données reconstruites (paramètres utilisés affichés en bas à gauche de chaque image), si elle est inférieure HRNS conduit à une augmentation du bruit de fond à l'extérieur de la région des pétales et HRNS plus élevés peuvent réduire la résolution et entraîner une perte des détails les plus fins. (B) représente la transformée de Fourier des images de l'avant en (A) où l'information périphérique indique que les données à résolution plus élevée; noter les pétales coupées de la transformation quand HRNS est fixé à 5, indiquant réduite résolution de l'image. (C) démontre toute la moitié de la largeur maximale (LMH) de la fibre de l'actine (boîte jaune en a) sur les différents paramètres, les mesures FWHM via le logiciel a donné lecturede 90 nm, 100 nm et 180 nm pour les réglages HRNS de 0,1, 1, et 5 respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cette technique permettra aux chercheurs de l'image et de quantifier les détails précédemment insolubles dans les cellules exprimant la fluorescence. Dans nos résultats, nous montrons que la F-actine des flux d'une manière symétrique à partir de la périphérie de la cellule vers le centre de la cellule dans la cellule T est. Ces résultats sont cohérents avec les résultats antérieurs de la ligne 1D données de profil kymographe 13 et étendent la capacité d'analyse de données 2D et de super-résolution.

La technique présentée est une progression de l'imagerie de kymographe qui est limitée à comploter fluctuations d'intensité de fluorescence à travers une seule ligne 1D au fil du temps. En comparaison, la technique actuelle permet la quantification de l'ensemble de flux moléculaire de la cellule à la fois avec la directivité et la vitesse extrait. Bien que interférométrie des tavelures a également montré actine dynamique 14 dans l'environnement 2D, la technique de speckle peut être limitée par la difficulté avec des densités d'étiquetage correct et visualise seulement une sous-population de l'actine.

Les étapes les plus importantes pour atteindre ces résultats sont d'optimiser l'efficacité de transfection des cellules particulières étant utilisé par le chercheur et l'alignement de l'optique du microscope SIM et motif de réseau. Choisir la bonne taille de la sous-région dépend des caractéristiques de l'échantillon, et il est important que trop petit réglage fluorescence moyenne plus rapide mobile est perdu par l'analyse de corrélation, mais le choix d'une trop grande sous-région se traduira par la perte potentielle de nuances dans les données supplémentaires acquises à l'aide méthodes de super-résolution.

Sous-région représente le nombre de pixels additionnés pour créer une super-pixel pour l'analyse de la cartographie de la vitesse, de plus en plus cela peut améliorer la fiabilité pour le suivi des objets en mouvement rapide. L'espacement de sous-région est l'écart entre les données dans superpixels. Lorsque l'espacement de sous-région est inférieure à la taille de la sous-région, ces vecteurs adjacents vais partager quelques informations, en augmentant ce paramètre pourrait réduire les inconvénients directionnelsistency du VectorMap finale générée. Le temps de délai maximum contrôle l'analyse de corrélation temporelle, où le nombre entré est le nombre maximum de décalages dans le temps avant la fin de l'analyse.

La reconstruction de l'image finale nécessite un éclairage modulation contraste (IMC) et les paramètres de suppression de bruit à haute résolution (HRNS) pour être sélectionné. Paramètres optimaux peuvent différer d'un échantillon à. IMC permet de distinguer le motif d'éclairage rayures sur l'échantillon, et réduit les artefacts de reconstruction. HRNS peut réduire des objets de données à faible contraste par «écrêtage» données à haute résolution de la transformée de Fourier; pour maintenir les capacités de résolution maximale et minimiser les artefacts de reconstruction ceux-ci sont normalement fixées à 1.

Limites de cette technique sont basées autour de la nature 2D du processus, que le logiciel STICS ne peut pas analyser les données 3D de la technique est limitée à la FRBR-SIM ou 2D-SIM, ce qui nécessite donc l'échantillon d'être relativement à plat contre la lamelle. Un autre inconvénient technique est que la FRBR-SIM nécessite 9 images brutes à collecter avant de reconstituer l'image finale de super-résolution, en tant que telle avec nos réglages de 50 ms acquisitions de trame et le temps pris par le microscope SIM de réorienter le modèle de grille; taux de ≈1 sec de cadre sont atteints. Comparé à d'autres temps d'acquisition de la technique de super-résolution et le grand champ de vue ces limitations sont acceptables pour la plupart des applications.

Les résultats présentés ici sont comparables aux ensembles de données de l'imagerie de la FRBR niveau de flux F-actine dans la formation de synapse immunologique. La bonne entente entre les modalités d'imagerie démontre STICS est robuste contre les éventuels artefacts de reconstruction SIM et également que les paramètres d'acquisition d'image utilisés pendant SIM sont acceptables pour l'analyse des données. En utilisant des ensembles de données de super-résolution avec un plus petit pixel tailles de plus de données peuvent être extraites à partir de cellules et de la dynamique de l individuelsub-diffraction micro-domaines cellulaires peuvent être étudiées.

Après avoir saisi cette technique tout écoulement moléculaire peut être imagée et quantifiée, avec une portée d'enquêter sur une multitude de questions concernant l'écoulement à la membrane plasmique, ou lorsque l'échantillonnage avec un microscope confocal, partout dans le plan XY de la cellule non invasive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables:
Jurkat E6.1 cells APCC ATTC TIB-152
RPMI Life Technologies 21875-091
FBS Sigma F7524-500ML
Penicillin-Strepromycin  Life Technologies 15140-122
HBSS  Life Technologies 14025-050
HEPES Life Technologies 15630-056
#1.5 8-well Labtek coverslips NUNC, Labtek 155409
LifeAct GFP construct Ibidi 60101
OptiMem Life Technologies 51985-042
anti-CD3 Cambridge Bioscience 317315
anti-CD28 BD Bioscience / Insight Biotechnology 555725
PBS Life Technologies 20012-019
Lens oil
Name Company Catalog number Comments
Equipment:
Gene Pulsar Xcell System BioRad 165-2660
Cuvette (0.4cm) BioRad 165-2088
Centrifuge (5810R) Eppendorf  5805 000.327
Centrifuge (Heraeus) Biofuge pico 75003235
6 well plate Corning 3516
Stage-top incubator Tokai Hit INUH-TIZSH
Nikon N-SIM microscope Nikon Contact company
Nikon Analyse software Nikon Contact company
Incubator (190D) LEEC Contact company

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  2. Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
  5. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
  7. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  8. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  9. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  10. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  11. Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
  12. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
  13. Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
  14. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).

Tags

Immunologie Numéro 106 Super résolution illumination structurée Microscopie actine cellules vivantes Image Correlation Spectroscopy
Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ashdown, G., Pandžić, E.,More

Ashdown, G., Pandžić, E., Cope, A., Wiseman, P., Owen, D. Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data. J. Vis. Exp. (106), e53749, doi:10.3791/53749 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter