Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

تقييم خصوصية المضاد للسرطان المخدرات Published: March 23, 2016 doi: 10.3791/53752

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو تقييم خصوصية الأدوية المضادة للسرطان في المختبر باستخدام الثقافات المختلطة التي تحتوي على خلايا الورم على حد سواء وغير السرطانية.

Abstract

ويتجلى إجراء لتقييم خصوصية الأدوية المضادة للسرطان في المختبر باستخدام الثقافات تحتوي على كل ورم وغير ورم الخلايا. العنصر الرئيسي هو تحديد كمية من التعديل الوراثي للورم محددة فيما يتعلق تسلسل عالمي باستخدام ثنائي التحقيق الرقمي فحص PCR وحساب لاحق من نسبة الخلايا السرطانية. ويتم فحص الخروج على الثقافة التي تحتوي على الخلايا السرطانية وجود خط أنشئت وارتفعت في الخلايا غير السرطانية. يتم التعامل مع ثقافة مختلطة مع المخدرات اختبار بتركيزات مختلفة. بعد العلاج، ويتم إعداد الحمض النووي مباشرة من خلايا لاصقة على قيد الحياة في الآبار لوحات 96-جيدا باستخدام طريقة بسيطة وغير مكلفة، وتعرض لثنائي التحقيق الرقمي فحص PCR لقياس التغيير الجيني للورم معين وتسلسل عالمي المرجعية . في مظاهرة الحالية، يتم استخدام الحذف متخالف من الجين NF1 مثل التعديل الوراثي للورم معين وجين RPP30 كما الجين المرجعية. باستخدام نسبة NF1 / RPP30، تم احتساب نسبة الخلايا السرطانية. منذ التغيير تعتمد على الجرعة من نسبة الخلايا السرطانية يوفر دلالة في المختبر لخصوصية المخدرات، وهذا في الفحص المختبري وراثية وخلية القاعدة المرجح أن يكون إمكانيات التطبيق في اكتشاف الأدوية. وعلاوة على ذلك، لرعاية مرضى السرطان، شخصية، يمكن أن تسهم هذه الأداة genetic- وخلية القاعدة إلى تحسين العلاج الكيميائي عن طريق اختبار فعالية وخصوصية المخدرات مرشح باستخدام الثقافات الأولية من ورم على حدة.

Protocol

1. إعداد الثقافة مزيج يحتوي على كل الخلايا السرطانية والخلايا غير السرطانية.

  1. استخدام الخلايا السرطانية من خط الخلية أنشئت MPNST S462 5. استخدام الخلايا الليفية مثل الخلايا غير السرطانية-6،7
  2. الثقافة على حد سواء ورم الخلايا والخلايا الليفية في المتوسط ​​DMEM القياسية مع المصل 10٪ بقري جنيني (BSA)، 3 مم الجلوتامين، 0.1 مم 2-المركابتويثانول، 500 U / البنسلين مل، 500 غ / مل الستربتومايسين و1 ملم البيروفات الصوديوم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO فبراير 5-7. في التقاء الفرعي، حصاد الخلايا مع 0.05٪ التربسين ونعدهم باستخدام عدادة الكريات.
  3. مزيج 400 الخلايا السرطانية والخلايا 1600 غير ورم معا في كل بئر من لوحة ثقافة 96-جيدا في 0.2 مل المتوسطة. وبالنظر إلى النمو السريع للخلايا السرطانية خلال فترة العلاج 5 أيام، تم تعيين نسبة الأولية من الخلايا السرطانية بنسبة 25٪. انشاء 4 يعيد لكل تركيز الدواء. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N.

2. دروز العلاج

  1. استخدام nilotinib مثل اختبار المخدرات. إعداد الحلول الأسهم 0، 2، 4 و 20 ملي nilotinib في DMSO. تمييع كل منهم من 200 أضعاف في 5 مل DMEM المتوسطة، وإعطاء 2 أضعاف تتركز حلول المخدرات من 0، 10، 20 و 100 ميكرومتر 6.7.
  2. إزالة 0.1 مل المتوسطة من كل بئر وإضافة 0.1 مل من المتوسط ​​تحتوي على المخدرات. تركيزات النهائية هي 0، 5، 10 و 50 ميكرومتر. مواصلة احتضان الخلايا في المتوسط ​​تحتوي على المخدرات لمدة 5 أيام.
  3. في نهاية العلاج، وفحص الخلايا المرفقة باستخدام مجهر مرحلة التباين والتقاط الصور. نضح المتوسطة بعيدا، وغسل الخلايا لاصقة على قيد الحياة مرة واحدة مع 0.2 مل برنامج تلفزيوني.

3. إعداد الحمض النووي لPCR الرقمية

  1. خلايا ليز باستخدام العامل البارع 8.
    1. إضافة 50 ميكرولتر محلول قلوي تحلل (25 ملم هيدروكسيد الصوديوم، 0.2 ملي EDTA) إلى كل بئر. اغلاق الآبار مع احباط. احتضان لوحة عند 95 درجة مئوية في الفرن أو على لوحة التسخين لمدة 30 دقيقة. تحقق تحت ميكرoscope للتأكد من أنه لا يوجد المزيد من الخلايا سليمة بقيت على السطح من الآبار. في حالة الخلايا لم ليز تماما، وزيادة الوقت التدفئة أو إضافة مواد التنظيف. تجميدها مرة واحدة في -20 درجة مئوية كما يعزز كسر الخلايا.
    2. إضافة 50 ميكرولتر تحييد حل (40 ملي تريس، HC، ودرجة الحموضة 4.0) إلى كل بئر. نقل كافة لست] في الآبار U-شكل لوحة PCR وجاف في cycler على PCR في 95 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 دقيقة. إعادة تشكيل لست] مع 20 ميكرولتر من الماء المقطر.
  2. تحلية باستخدام قطرة غسيل الكلى 9
    1. استخدام المرشحات الغشائية مع متوسط ​​حجم المسام 0.025 ميكرون.
    2. تعويم تصفية على الماء المقطر مع الجانب اللامع حتى في الآبار من لوحة ال 12 أيضا. الرطب مرشح لمدة 5 دقائق. إيلاء الاهتمام لتجنب فقاعات الهواء بين مرشح والمياه.
    3. الماصة ولست] تشكيلها من كل عينة من الخطوة 3.1.4 بعناية على على كل من 4 مناطق من التصفية. تغطية لوحة وdialyze لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
    4. تمتص الماء بعيدا تحت التصفية دون التقليب أكثر من مرشح ولا إزعاج قطرات.
    5. نقل المحللة قطرات في الآبار من PCR لوحة جديدة. تجفيف الحمض النووي قطرات عن طريق التسخين في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10-30 دقيقة في cycler على PCR. إعادة تشكيل لست] في 10 ميكرولتر المياه.

4. PCR الرقمية

  1. مكونات المجمدة ذوبان مثل الحمض النووي، العازلة ومزيج فحص في RT، تدور لمدة 10 ثانية في القوة القصوى من أي أجهزة الطرد المركزي المتاحة (على سبيل المثال، VWR مصغرة الطرد المركزي) ومن ثم الاحتفاظ بها على الجليد.
  2. تحضير خليط رئيسية تحتوي على جميع المكونات ما عدا الحمض النووي (الجدول 1). النظر في حجم القتلى وحساب خليط سيد حوالي 10٪ أكثر من المبلغ المطلوب.
    ملاحظة: استخدام الاشعال وتحقيقات المستخدمة في عدة التجارية.
  3. دوامة الخليط الماجستير، وتدور باستمرار لمدة 10 ثانية في القوة القصوى من أي أجهزة الطرد المركزي المتاحة (على سبيل المثال، VWR أجهزة الطرد المركزي صغير) والاستغناء عن 15 ميكرولتر على كلبئر من لوحة 96-PCR. إضافة كافة المحللة (التي تحتوي على الحمض النووي) من كل عينة إلى الآبار التي تحتوي على خليط الرئيسي. نقل 20 ميكرولتر من كل خليط التفاعل في بئر على الجانب عينة من خرطوشة في RT.
  4. الاستغناء عن 70 ميكرولتر من النفط قطرة مولد في كل بئر على الجانب النفط من لخرطوشة. إغلاق خرطوشة مع طوقا ووضع الإعداد كاملة إلى مولد قطرة. بدء جيل بالقطيرات.
  5. نقل 40 ميكرولتر قطيرة-حل في الآبار من 96-جيدا لوحة PCR. ختم لوحة مع احباط ووضع لوحة في cycler على PCR. ضبط درجة الحرارة غطاء في درجة حرارة 105 مئوية والطريق المنحدر المعدل 2 ° C / ثانية. تنفيذ PCR باستخدام الإعدادات في الجدول 2. وبعد PCR، ونقل لوحة في قارئ قطرة وبدء القراءة. بدلا من ذلك، تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.

5. حساب نسبة الخلايا السرطانية

  1. تحميل البيانات PCR الرقمية وأداء محللة بيانات التلقائيهو.
  2. السيطرة على النتائج من كل فحص يدويا عن طريق التفتيش توزيع ذات بعد واحد و 2 الأبعاد من قطرات الإيجابية والسلبية، والتأكد من أنها يتم فصل جيدا وكانت خطوط العتبة في مواقف الحق. استبعاد النتائج التي لا تستوفي المعايير، على سبيل المثال، لا فصل واضح من قطرات الإيجابية والسلبية، من مزيد من التحليل. نسخ الناتجة نسبة NF1 / RPP30 في ورقة اكسل.
  3. حساب نسبة الخلايا السرطانية على النحو التالي: 2 × (1- NF1 / RPP30).

تغيير 6. الجرعة التي تعتمد على نسبة من الخلايا السرطانية

  1. لكل-تركيز الدواء، وحساب المتوسط ​​والانحراف المعياري من 4 مكررات. رسم الوسائل والانحرافات المعيارية ضد تركيز الدواء.

Representative Results

نوعية الحمض النووي أعدت باستخدام العامل البارع المشترك / قطرة غسيل الكلى كافية لPCR الرقمي مرضيا (الشكل 1B). ل2000 الليفية، تقريبا تم الحصول عليها 3000 ± 500 قطرات إيجابية، الموافق 75٪ من المتوقع 4000 نسخ (نسختين في خلية واحدة). في هذه الدراسة، كانت الخلايا السرطانية من خط أنشئت MPNST S462 التي هي معروفة لديهم حذف متغاير الزيجوت من الجين NF1 5. تم الكشف عن هذا التخفيض جرعة الجين 50٪ بشكل واضح من قبل المزدوج فحص PCR الرقمي (الشكل 1B). على النقيض من ذلك، تم قياس نسختين من هذا الجين في الخلايا الليفية. هذا الاختلاف الجيني بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية، يمكن حساب نسبة الخلايا السرطانية في الثقافات المختلطة (الشكل 2). عن طريق قياس الجرعة الجينات النسبية NF1 إلى RPP30، نسبة الخلايا السرطانية في ثقافة مختلطة يمكن تحديدفي كل-تركيز الدواء (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. الرقمية PCR. (A) التوضيح من حيث المبدأ. (ب) فحص ثنائي التحقيق يكشف عن انخفاض كمية من الجينات المستهدفة (NF1) في الخلايا السرطانية MPNST S462 فيما يتعلق الجين المرجعية (RPP30). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
وتباينت الشكل 2. نسبة محسوبة من خلايا ورم الخلايا السرطانية وغير السرطانية الخلايا في نسب مختلفة، والمصنف في كل بئر من لوحة 96. بعد التعلق O / الطرافة N، كانت هي lysed الخلاياتعرضوا ح العامل البارع / قطرة-غسيل الكلى ولست] المحلاة إلى PCR الرقمي الذي أعطى نسبة NF1 / RPP30. تم احتساب قاعدة على هذه النسبة نسبة الخلايا السرطانية في كل بئر. يعني وحسبت الانحراف المعياري من نسبة الخلايا السرطانية من 4 يعيد في كل نسبة انشاء. تم التخطيط نسب محسوبة من الخلايا السرطانية (العمودي) على نسب الإعداد (المحور السيني). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تعتمد على الجرعة تغيير نسبة الخلايا السرطانية. (A) الجرعة التي تعتمد على الحد من خلايا حيوية واضحة. (ب) نسبة من الخلايا السرطانية (يعني والانحراف المعياري من 4 مكررات) تحسب من نسبة NF1: RPP30، انخفضت في نطاق 0-10 ميكرومتر. على أعلى جرعة 50 ميكرومتر، تركت بعض الخلايا الحيوية، على الأرجح بسبب التأثير السام لجميع الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
ويمكن قياس الرقم 4. فصل استجابة الخلايا السرطانية من ذلك الخلايا غير السرطانية (أ) الجدوى و / أو انتشار مجموع الخلايا باستخدام المقايسات التقليدية؛ نسبة الخلايا السرطانية يمكن تحديد باستخدام الإجراء هو موضح في الدراسة الحالية. (ب) باستخدام المعلمتين، استجابة من مجموع الخلايا في ثقافة مختلطة لدواء يمكن تقسيمها إلى استجابة الخلايا السرطانية واستجابة الخلايا غير السرطانية.كوم / ملفات / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1 رد الفعل
2 × ddPCR SUPERMIX 12
مزيج فحص لNF1 1.2
مزيج فحص لRPP30 1.2
HaeIII 0.6
حاصل الجمع 15 خليط ماستر
الحمض النووي 9
مجموع 24 خليط PCR النهائي

الجدول 1 إعداد المزدوج ddPCR رد الفعل

خطوة عمل درجة الحرارة مرة دورات
1 Polymمحو تفعيل 95 ° C 10 دقائق 1
2 تمسخ الحمض النووي 94 ° C 30 ثانية 40
3 الصلب / exetension 60 ° C 1 دقيقة
4 البلمرة التعطيل 98 ° C 10 دقائق 1
5 عقد (اختياري) 4 ° C

الجدول 2 إعدادات cycler على PCR

Discussion

الخطوة الأساسية في هذه الأداة genetic- وخلية القاعدة لتقييم خصوصية المخدرات في المختبر هي تحديد نسبة الخلايا السرطانية باستخدام واحد أو أكثر من الخصائص الوراثية للورم معين. وعلى النقيض من ميزات المظهرية التقليدية الميزات الوراثية هي محددة ومستقرة وسهلة لقياس. على سبيل المثال، فإن الطفرة أو عدد النسخ الاختلاف ورم محددة موجودة حصرا في الخلايا السرطانية ولكن ليس في الخلايا غير السرطانية. هذا وصمة عار وراثي يمكن أن يعتمد عليه وعلى وجه التحديد كميا، على سبيل المثال، وذلك باستخدام PCR الرقمي كما هو موضح في هذه الدراسة.

لPCR الرقمي، نقاء عالية من الحمض النووي ليست ضرورية. ومع ذلك، تحلية وإزالة الجزيئات المثبطة هي اللازمة التي يمكن تحقيقها عن طريق على بعد غسيل الكلى انخفاض استخدام مرشح مناسب. وجنبا إلى جنب تحلل وانخفاض غسيل الكلى هو بسيط وسريع، لا يتطلب أي أدوات خاصة، وبالتالي يمكن أن تنفذ في أي مختبر القياسية. إذا كانت الخلايا لا برياك جيدا، يمكن اعتبار معالجة إضافية مثل تجميد الخلايا في -20 درجة مئوية، مضيفا المنظفات و / أو باستخدام البروتيني.

في هذه الدراسة، تم استخدام الحذف متخالف من الجين NF1 كسمة ورم محددة لتقدير. وبالمثل، الحذف من الجينات أو مواضع أخرى يمكن أن تستخدم أيضا. وعلاوة على ذلك، والطفرات يمكن أن تستخدم أيضا لقياس الخلايا السرطانية. في هذه الحالة، لا بد من التحقق من صحة نطاق واسع لضمان خصوصيتها لكل منهما المقايسات PCR الرقمية لمتحولة والأليلات العادية.

نسبة تعتمد على جرعة من الخلايا السرطانية توفر مؤشرا عن المخدرات خصوصية أو الانتقائية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أيضا استجابة استخراج الخلايا السرطانية من الاستجابة من مجموع الخلايا ثقافة مختلطة لدواء (الشكل 4). وتنص هذه الاستراتيجية استخراج حل للمشكلة فنية في استخدام الثقافات الأولية (التي تحتوي على كل ورم وليسخلايا ن الورم) لمكافحة المخدرات والاختبار.

وgenetic- وخلية مقرها في أداة المختبر تبين في هذه الدراسة وبالتالي تكون هناك إمكانية التطبيق (1) في مجال مكافحة المخدرات اكتشاف حيث أنه يوفر منصة لتقييم خصوصية المخدرات أو الانتقائية في المختبر و (2) في رعاية مرضى السرطان شخصية حيث تمكن المخدرات اختبار في الثقافات الأولية، وبالتالي يمكن أن تسهم في المخدرات التحديد في مساعد العلاج الكيميائي 4. وعلاوة على ذلك، وآلية الدوائية للدواء يمكن دراستها باستخدام هذه الأداة، منذ بعض التعديل الوراثي أو تغيرات جينية متعددة يمكن اتباعها أثناء المخدرات العلاج.

وثمة صعوبة في استخدام الثقافات الأولية الفردية هي عدم وجود ميزة وراثية عالمية لتقدير حجم الخلايا السرطانية. ومع ذلك، مع التقدم اليوم في تسلسل كامل الجينوم، من المعروف أن الجينات والمناطق الأكثر غيرت في كثير من الأحيان لعلاج الأورام شيوعا. على سبيل المثال، بين الرأس والعنقالأورام، 71٪، 23٪ و 22٪ لديهم طفرات في TP53، FAT1 والجينات CDKN2A، و 60٪، 34٪ و 26٪ لديهم الحذف في المناطق الجينات من CDKN2A، STK11 وPTEN، على التوالي 10. فحص 5-10 هذه الجينات و / أو المناطق عن طريق استهداف التسلسل أو / و PCR الرقمي وبالتالي من المحتمل تحديد واحد أو أكثر من التعديلات الوراثية التي يمكن استخدامها لتقدير حجم الخلايا السرطانية في الثقافة الأولية المشتقة. الحد آخر هو المبلغ في كثير من الأحيان غير كافية من الأورام مقطوعة لإقامة الثقافات الأولية.

وعلى الرغم من ميزات مفيدة وإمكانية تطبيق واعدة للgenetic- وخلية مقرها في أداة المختبر، يجب أن تبقى حدودها في الاعتبار، وينبغي التأكيد في المختبر الطبيعة. على سبيل المثال، فإن الآثار التفاضلية أو السمية الخلوية للدواء على الخلايا السرطانية قد بدلا نظرا للاختلاف في أنواع الخلايا (الخلايا الليفية مقابل خلايا شوان) أو منأصول مختلفة (من مختلف الأفراد). ويمكن أيضا أن أوضح تأثير أقوى من الدواء على الخلايا السرطانية من على الخلايا غير السرطانية، من خلال حقيقة أن تنمو السابق أسرع من هذا الأخير. الأهم من ذلك، الخلايا في المختبر السلوك يختلف من الخلايا في جسم الإنسان، وبالتالي، نتائج التقييم في المختبر في كثير من الأحيان لا أو جزئيا فقط تعكس الحالة السريرية الحقيقي. لذلك، فعالية، سمية الخلايا وخصوصية المخدرات التي تم الحصول عليها عن الخلايا المستزرعة هي بالأحرى من طبيعة العلامات البيولوجية لكنها لا تملك مصداقية فعالية قياس preclinically من المضادات الحيوية. ومع ذلك، والانتقال من خطوط الخلايا على الثقافات المختلطة و / أو الثقافات الأولية هو خطوة إلى الأمام في تقييم المخدرات تأثير وخصوصية / الانتقائية في المختبر. مع جهود واسعة النطاق، في ظروف المختبر ويمكن الاطلاع التي تمكن ارتباط معقول في المختبر البيانات مع استجابات حقيقية للمرضى، على الأقل بالنسبة لبعض الأدوية.

Acknowledgments

تحظى بتقدير السيدة ألستر، السيد Honrath والدكتور جيانغ للحصول على المساعدة الفنية المعلقة بينهما. يقدر أيضا هو الدكتور فولز وفريق البحث الدكتور Dandri إلى توفير إمكانية الوصول إلى جهاز PCR الرقمي الخاص بها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Membrane filter of 25 mm diameter Merk-Millipore VSWP 02500 For drop-dialysis
ddPCR assay for NF1 BioRad dHsaCP1000177 FAM-labelled
ddPCR assay for RPP30 BioRad dHsaCP2500350 HEX-labelled
QX200 BioRad 186-4001 The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200
Droplet oil BioRad 186-3005
Cartriges  BioRad 186-3004
Gaskets BioRad 186-3009
Cartrige holder BioRad 186-3051
Pierceble foil BioRad 181-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
  2. McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
  3. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  4. Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
  5. Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
  6. Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
  7. Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
  8. Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
  9. Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
  10. Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).

Tags

الطب، العدد 109، نسبة الخلايا السرطانية، واكتشاف المخدرات، خصوصية المخدرات، سمية الخلايا، PCR الرقمي، والطب الشخصية والثقافة الابتدائية والثقافات المختلطة، والعلاج الكيميائي، واختيار الدواء، وتحور، عدد نسخة الاختلاف
تقييم خصوصية المضاد للسرطان المخدرات<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kluwe, L. Assessing Specificity ofMore

Kluwe, L. Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53752, doi:10.3791/53752 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter