Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני.
Abstract
הליך להערכה ספציפי של תרופות נגד הסרטן במבחנה באמצעות תרביות המכילות גם תאים סרטניים ולא-סרטניים מודגם. אלמנט המפתח הוא נחישות כמותי של שינוי גנטי ספציפי גידול ביחס רצף אוניוורסלי באמצעות assay PCR דיגיטלי כפולה חללית לבין חישוב בדיעבד של הפרופורציה של תאים סרטניים. את assay מתבצעת על תרבות המכילה תאים סרטניים של קו הוקם ומשובץ-בתאים שאינם סרטניים. התרבות המעורבת מטופל בתרופת מבחן בריכוזים שונים. לאחר הטיפול, ה- DNA הוא מוכן ישירות מתאי הדבק שרדו בבארות של צלחות 96-היטב באמצעות שיטה פשוטה וזולה, ועברתי assay PCR הדיגיטלי כפולה בדיקת למדידת שינוי גנטי ספציפי גידול רצף ייחוס אוניוורסלי . בהפגנה הנוכחית, במחיקה הטרוזיגוטיים של הגן NF1 משמש שינוי גנטי ספציפי הגידולגן RPP30 כמו גן ההתייחסות. באמצעות יחס NF1 / RPP30, חלקם של תאים סרטניים חושב. מאז השינוי תלוי במינון של הפרופורציה של תאים סרטניים מספק אינדיקציה במבחנה עבור סגוליות של התרופה, גנטי מבוסס תאים זה assay במבחנה סביר להניח כי יש פוטנציאל יישום של גילוי תרופות. יתר על כן, עבור סרטן טיפול אישית, כלי genetic- ו מבוסס תאים זה עשוי לתרום לאופטימיזציה של כימותרפיה אדג'ובנטי באמצעות יעילויות בדיקות וספציפיות של תרופות מועמדות באמצעות תרבויות עיקריות של גידולים בודדים.
Protocol
1. הכנת תרבות מיקס המכילה גם תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים
- השתמש בתאים סרטניים מקו תא הוקם MPNST S462 5. השתמש פיברובלסטים כמו התאים שאינם סרטניים 6,7
- תאים פיברובלסטים תרבות הן הגידול במדיום תקן DMEM עם 10% בסרום שור העובר (BSA), 3 גלוטמין מ"מ, 0.1 מ"מ 2-mercaptoethanol, 500 U / פניצילין מ"ל, 500 גר '/ מ"ל סטרפטומיצין ו פירובט סודיום 1 מ"מ ב 37 ° C ו -5% CO 2 5-7. At-מפגש משנה, למסוק את התאים עם טריפסין 0.05% ו לספור אותם באמצעות hemocytometer.
- מערבבים 400 תאים סרטניים ו -1,600 תאים שאינם סרטניים יחד היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב 0.2 מ"ל בינוני. בהתחשב צמיחה מהירה יותר של תאים סרטניים לאורך תקופת הטיפול של 5 ימים, חלקם הראשוני של תאים סרטניים נקבע ל 25%. הגדרת 4 משכפל עבור כל ריכוז התרופה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N.
2. דרוטיפול g
- השתמש nilotinib כמו תרופת הבדיקה. הכינו פתרונות המניות של 0, 2, 4 ו -20 מ"מ nilotinib ב DMSO. לדלל כל אחד מהם על ידי 200 של פי 5 מ"ל DMEM בינוני, מתן פתרונות תרופתיים מרוכז פי 2 של 0, 10, 20 ו -100 מיקרומטר 6.7.
- הסר 0.1 מ"ל בינוני מבאר כל ולהוסיף 0.1 מ"ל של המכיל תרופה בינוני. הריכוזים הסופיים הם 0, 5, 10 ו -50 מיקרומטר. המשך דוגרי תאי תרופה המכילה בינונית במשך 5 ימים.
- בסוף הטיפול, לבדוק התאים המצורפים באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד ולצלם. לשאוב את המדיום משם, לשטוף את התאים דבקים שרד פעם עם 0.2 מיליליטר PBS.
3. הכנת DNA עבור PCR הדיגיטלי
- Lyse תאים באמצעות מאצ 8.
- הוסף 50 μl פתרון תמוגה אלקליין (25 מ"מ NaOH, 0.2 mM EDTA) זה טוב. חותם את הבארות עם רדיד. דגירה את הצלחת על 95 מעלות צלזיוס בתנור או על צלחת חימום למשך 30 דקות. בדוק תחת microscope לוודא שאף תאים שלמים יותר נשארים על פני השטח של הבארות. במקרה התאים לא lyse לחלוטין, להגדיל את זמן החימום או להוסיף חומר ניקוי. להקפיא אותם פעם ב -20 מעלות צלזיוס גם משפר שביר תאים.
- הוסף 50 μl נטרול פתרון (40 מ"מ טריס-HC, pH 4.0) היטב כל אחד. להעביר את כל lysates לתוך בארות U-בצורת צלחת PCR ויבש בתוך Cycler PCR ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות. מחדש את lysates עם 20 μl מים מזוקקים.
- Desalt באמצעות Drop-דיאליזה 9
- להשתמש במסנני קרום עם גודל הנקבובי ממוצע 0.025 מיקרומטר.
- Float את המסנן במים מזוקקים עם למעלה בצד מבריק בבארות של צלחת 12-היטב. להרטיב את המסנן במשך 5 דקות. שים לב, כדי למנוע בועות אוויר בין המסנן והמים.
- Pipet את lysates מחדש של כל דגימת משלב 3.1.4 בזהירות על על כל אחת מ -4 תחומי המסנן. מכסים את הצלחת ואת dialyze למשך 30 עד 60 דקות.
- תמצוץ את המים תחת המסנן בלי לדפדף על המסנן ולא להפריע את הטיפין.
- מעבירים את lysate-טיפות לתוך הבארות של PCR-צלחת חדשה. לייבש את טיפות DNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות בתוך Cycler PCR. מחדש את lysates ב 10 מי μl.
4. PCR דיגיטלי
- רכיבים קפוא להפשיר כגון DNA, חיץ לערבב assay ב RT, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של כל צנטריפוגות זמין (למשל, VWR מיני צנטריפוגות) ולאחר מכן לשמור אותם על הקרח.
- הכן תערובת מאסטר המכיל את כל המרכיבים למעט DNA (טבלה 1). שקול נפח מת ולחשב מאסטר תערובת כ 10% יותר מהסכום הנדרש.
הערה: השתמש primers ו בדיקות בשימוש בערכה המסחרית. - וורטקס את התערובת אב, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של צנטריפוגות כל זמין (למשל, צנטריפוגות מיני VWR) ולחלק 15 μl לכלגם צלחת 96-PCR. הוסף את כל lysate (המכיל DNA) של כל דגימה כדי הבארות המכילות תערובת מאסטר. העברת 20 μl של כל תערובת התגובה לתוך באר בצד מדגם של מחסנית ב RT.
- לוותר 70 μl של שמן גנרטור אגל לבאר כל בצד שמן של מחסנית. סגור את המחסנית עם האטם ולמקם את התפאורה כולה למחולל רביב. התחל דור אגל.
- העברת 40 μl אגל-פתרון לתוך בארות צלחת PCR 96-היטב. חותם את הצלחת עם בנייר כסף ומניחים בצלחת לתוך Cycler PCR. הגדר את הטמפרטורה המכסה ל -105 מעלות צלזיוס, כבש שער ב -2 מעלות צלזיוס / sec. לבצע PCR תוך שימוש בהגדרות בטבלה 2. לאחר PCR, להעביר את הצלחת לקורא אגל ולהתחיל לקרוא. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות.
5. חישוב שיעור של תאים סרטניים
- טענו את נתוני PCR הדיגיטליים ולבצע analys האוטומטיהוא.
- שליטה בתוצאות של כל assay באופן ידני על ידי בוחן את ההתפלגות חד ממדית ו -2 ממדים של הטיפין החיוביות ושליליות, ואת בטוח שהם מופרדים היטב ואת קווי הסף היו בעמדות הנכונות. אל תכלול תוצאות שלא עמדו בקריטריונים, למשל, אין הפרדה ברורה של טיפות חיוביות ושליליות, בניתוחים נוספים. העתק את RPP30 NF1 / יחס שנוצר לתוך גיליון Excel.
- חשבת את חלקם של תאים סרטניים כמו: 2 x (1 NF1 / RPP30).
6. שינוי תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים
- עבור כל-ריכוז תרופה, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן מ -4 המשכפל. מגרש את האמצעים ואת סטיות התקן נגד-ריכוזי התרופה.
Representative Results
איכות DNA הוכן באמצעות מאצ משולב / Drop-דיאליזה מספיקה עבור PCR דיגיטלי משביע רצון (איור 1B). עבור 2,000 פיברובלסטים, כ -3,000 ± 500 טיפות חיוביות התקבלו, המקביל ל 75% של 4,000 עותקים הצפויים (שני עותקים בתא אחד). במחקר זה, התאים הסרטניים היו מקו הוקם MPNST S462 אשר ידוע כבעלי מחיקת heterozygotic של גן NF1 5. 50% זה הפחתת מינון הגן זוהתה בבירור על ידי assay PCR הדיגיטלי הכפול (האיור 1B). לעומת זאת, שני עותקים של הגן הזה נמדדו פיברובלסטים. הבדל גנטי בין גידול ותאי שאינו סרטני מאפשר חישוב השיעור של תאים סרטניים בתרביות מעורבות (איור 2). באמצעות מדידת מינון הגנים היחסי של NF1 כדי RPP30, חלקם של תאים סרטניים ב תרבות מעורבת ניתן לקבועבכל-ריכוז התרופה (איור 3).
איור 1. דיגיטלי PCR. (א) איור של העיקרון. (ב) assay כפול בדיקה מגלה כמות מופחתת של גן המטרה (NF1) בתאי הגידול MPNST S462 ביחס גן הפניה (RPP30). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שיעור מחושב של תאים סרטניים. תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים היו מעורבים ב יחסים שונים זורעים לתוך היטב בכל צלחת 96. לאחר מצורף O / N, התאים היו שנינות lysedמאצ h / Drop-דיאליזה ואת lysates desalted היו נתונים PCR דיגיטלי אשר נתן יחס של NF1 / RPP30. על בסיס יחס זה, חלקם של תאים סרטניים בכל טוב חושב. ממוצע וסטיית תקן של פרופורציה של תאים סרטניים חושבו מתוך 4 משכפל בכל פרופורציה הגדרת. הפרופורציות המחושבות של תאים סרטניים (ציר ה- Y) היו זממו נגד פרופורציות הגדרה (ציר ה- X). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תלויי מנת שינוי פרופורציה של תאים סרטניים. (א) תלוי במינון ההפחתה של תאים חיוניים גלויים. (ב) חלקם של תאים סרטניים (ממוצע וסטיית תקן של 4 משכפל) שנמדד יחס של NF1: RPP30, ירד בטווח של 10 - 0 מיקרומטר. באותו מיקרומטר הגבוה ביותר 50 מנה, כמה תאים חיוניים נותרו, כנראה עקב השפעה רעילה לכל התאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 4. תגובת הפרדה של תאים סרטניים מזו של תאים שאינם סרטניים (א) כדאיות או / ו תרבות תאים כוללים ניתן למדוד באמצעות מבחנים קונבנציונליים; שיעור של תאים סרטניים ניתן לקבוע באמצעות ההליך הפגין במחקר הנוכחי. (ב) באמצעות שני פרמטרים, תגובה של תאים הכוללים בתרבות מעורבת לתרופה ניתן לחלק התגובה של התאים הסרטניים והתגובה של התאים שאינם סרטניים..com / קבצים / ftp_upload / 53,752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תגובה 1 | ||
| 2 x ddPCR Supermix | 12 | |
| תמהיל Assay עבור NF1 | 1.2 | |
| תמהיל Assay עבור RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0.6 | |
| סיכום ביניים | 15 | תערובת מאסטר |
| DNA | 9 | |
| סה"כ | 24 | תערובת PCR סופית |
טבלה 1 הגדרת התגובה Dual ddPCR
| שָׁלָב | פעולה | טֶמפֶּרָטוּרָה | זְמַן | מחזורים |
| 1 | Polymלמחוק הפעלה | 95 ° C | 10 דק ' | 1 |
| 2 | denaturation DNA | 94 ° C | 30 שניות | 40 |
| 3 | חישול / exetension | 60 ° C | דקה 1 | |
| 4 | שחרור משרות פולימראז | 98 ° C | 10 דק ' | 1 |
| 5 | המתנה (אופציונלי) | 4 ° C |
טבלה 2 הגדרות Cycler PCR
Discussion
צעד מפתח כלי genetic- ו מבוסס תא זו להערכת סגוליות תרופה במבחנה הוא קביעת שיעור של תאים סרטניים באמצעות אחד או יותר מאפיינים גנטיים ספציפי גידול. בניגוד לתכונות פנוטיפי קונבנציונליות 7, מאפיינים גנטיים ספציפיים, יציבים וקלים לכמת. לדוגמא, וריאצית מספר מוטציה או עותק ספציפי גידול קיימת אך ורק בתאים הסרטניים אך לא בתאים שאינם סרטניים. כזה הסטיגמה גנטי ניתן באופן מהימן ומדויק לכמת, למשל, באמצעות PCR הדיגיטלי כפי שמודגם במחקר זה.
לקבלה הדיגיטלי PCR, טוהר גבוה של DNA אינו הכרחי. עם זאת, Desalting והסרת מולקולות מעכבות נחוצים אשר יכולה להיות מושגת על ידי א-דיאליזה ירידה באמצעות מסנן מתאים. תמוגה בשילוב טיפה-הדיאליזה היא פשוט ומהירה, לא דורשת מכשירים מיוחדים ולכן יכולה להתבצע בכל מעבדה סטנדרטית. אם התאים אינם בריk היטב, יכול להיחשב טיפול נוסף כגון הקפאת התאים ב -20 ° C, הוספת חומר ניקוי ו / או באמצעות פרוטאז.
במחקר הנוכחי, את המחיקה הטרוזיגוטיים של גן NF1 שמשה תכונה מסוימת גידולים עבור כימות. באופן דומה, מחיקות של גנים או לוקוסים אחרים יכולות לשמש גם. יתר על כן, מוטציות יכולות לשמש גם לכימות תאים סרטניים. במקרה כזה, מבחני PCR דיגיטליים עבור המוטציה ואת אללים הנורמלי צריכים להיות מאומתים נרחב כדי להבטיח הספציפיות שלהם עבור כל אחד מהם.
תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים מספקת אינדיקציה-סגולי סמים או סלקטיביות. יתר על כן, הוא גם מאפשר בתגובה לחילוץ של תאים סרטניים מן התגובה של תאים כוללים של תרבות מעורבת לתרופה (איור 4). מיצוי אסטרטגיה זו מספקת פתרון עבור הבעיה הטכנית באמצעות תרבויות עיקריות (המכיל הוא גידול ולאn-גידול תאים) עבור בדיקות סמים.
Genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה הראה במחקר הנוכחי עשויים ולכן יש פוטנציאל יישום (1) ב-גילוי תרופות שבה היא מספקת פלטפורמה להערכה סגולי סמים או סלקטיביות במבחנה (2) בטיפול בסרטן אישית איפה זה מאפשר תרופות בדיקות בתרבויות עיקריות וכתוצאה מכך עשוי לתרום בחירת התרופה אדג'ובנט כימותרפיה 4. יתר על כן, מנגנון תרופתי של תרופה ניתן ללמוד באמצעות הכלי הזה, מאז שינוי גנטי מסוים או שינויים גנטיים מרובים ניתן בעקבות במהלך-הטיפול התרופתי.
קושי בשימוש תרבויות עיקריות אישיות הוא חוסר תכונה גנטית אוניברסלית עבור כימות של התאים הסרטניים. עם זאת, עם מקדמה בשיעור היום רצף שלם של הגנום, הגנים ואזורים שינו בתדירות הגבוהה ביותר ידועים גידולים נפוצים. לדוגמה, בין הראש והצווארגידולים, 71%, 23% ו -22% יש מוטציות TP53, FAT1 וגנים CDKN2A, ו -60%, 34% ו -26% יש מחיקות באזורי הגן של CDKN2A, STK11 ו PTEN, בהתאמה 10. הקרנת 5 עד 10 גנים או / ואזורים כגון באמצעות-רצף ממוקד ו / או דיגיטלי PCR יהיה ולכן סביר לזהות אחד או יותר שינויים גנטיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור כימות של תאים סרטניים בתרבות העיקרי נגזר. מגבלה נוספת היא הכמות המספיקה של גידולי כריתה להקמת תרבויות עיקריות.
למרות תכונות יתרון ופוטנציאל יישום מבטיח של genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה, מגבלותיו צריכים להישמר נפש שלה בטבע במבחנה יודגש. לדוגמא, ההשפעות השונות או הרעיל של תרופה על תאים סרטניים רשאי למדי בשל הבדל בסוגי תאים (פיברובלסטים לעומת בתאי שוואן) או שלהםמקורות שונים (מאנשים שונים). ההשפעה החזקה יותר של תרופה על תאים סרטניים מאשר תאים שאינם סרטניים עשויה גם להיות מוסברת על ידי העובדה כי לשעבר לגדול מהר יותר מאשר האחרון. והחשוב מכל, תאים בהתנהגות במבחנה שונה מאשר תאים בגוף האדם וכתוצאה מכך, תוצאות הערכה במבחנה לעתים קרובות לא או רק חלקית לשקף את המצב קליני האמיתי. לכן, יעילה, cytotoxicity וספציפית של תרופות שהתקבלו עבור תאים בתרבית הם די טבע סמן ביולוגי, אך אין להם את האמינות של יעילות preclinically הנמדד של אנטיביוטיקה. אף על פי כן, נע שורות תאים לתרבויות מעורבות ו / או תרבויות עיקריות הוא צעד קדימה בהערכה ותוצאת תרופה וספציפית / סלקטיביות במבחנה. עם מאמצים רבים, בתנאים במבחנה ניתן למצוא האפשר מתאם סביר של נתונים במבחנה עם תגובות אמיתיות של חולים, לפחות עבור חלק מתרופות.
Acknowledgments
גברת אלסטר, מר Honrath וד"ר ג'יאנג זוכים להערכה לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל שלהם. כמו כן העריך ד"ר Volz ואת קבוצת המחקר של ד"ר Dandri למתן גישה למכשיר דיגיטלי PCR שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
