Summary
이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다.
Abstract
종양 및 비 종양 세포를 모두 함유하는 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하기위한 절차가 설명된다. 핵심 요소는 이중 디지털 프로브 PCR 분석 및 종양 세포의 비율의 후속 계산을 사용하여, 범용 서열과 관련하여 암 특이 적 유전자 변화를 정량한다. 상기 분석은 종양 설정된 광고의 세포를 함유하는 배양에서 수행되는 스파이크 된 비 - 종양 세포. 혼합 문화는 다양한 농도에서 시험 약물로 치료한다. 처리 후, DNA를 간단하고 저렴한 방법을 사용하여 96- 웰 플레이트의 웰에서 살아 접착 세포로부터 직접적으로 제조되며, 암 특이 적 유전자 변화와 기준 범용 시퀀스를 측정하기위한 이중 프로브 디지털 PCR 분석을 실시 . 본 데모에서, NF1 유전자의 이형 삭제가 암 특이 유전자 변형으로 사용되며기준 유전자와 같은 유전자 RPP30. 비 NF1 / RPP30를 사용하여, 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 종양 세포의 비율의 용량 의존적 인 변화는 약물의 특이성에 대한 시험 관내 표시를 제공하기 때문에, 이러한 유전자 및 세포 - 기재 시험 관내 분석 가능성 신약 개발에 응용 가능성을 가질 것이다. 또한, 맞춤형 암 치료를 위해,이 genetic- 및 셀 기반 도구는 개별 종양의 차 문화를 사용하여 테스트 효능 및 후보 약물의 특이성에 의해 보조 화학 요법을 최적화에 기여할 수있다.
Protocol
1. 혼합 문화 종양 세포와 비 암세포 모두 포함 준비
- 확립 된 세포주 MPNST S462 (5)에서 종양 세포를 사용합니다. 비 - 종양 세포로 -6,7- 섬유 아세포를 사용하여
- 배양 모두 종양 세포를 10 % 소 태아 혈청 표준 DMEM 배지에서 섬유 아세포 (BSA), 3 mM의 글루타민, 0.1 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 500 U가 / ㎖ 페니실린, 500 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 1 mM의 피루브산 나트륨, 37 ℃에서 5 % CO 2 5-7. 부 합류, 0.05 % 트립신으로 세포를 수확하고 혈구를 사용하여 계산.
- 0.2 ㎖의 배지에서 96- 웰 배양 플레이트의 각 웰에 함께 400 종양 세포 및 1600가 아닌 종양 세포를 섞는다. 오일의 치료 기간 동안 종양 세포의 빠른 성장을 고려하여, 종양 세포의 초기 비율은 25 %로 설정 하였다. 설정 4는 각각의 약물 농도에 대한 복제합니다. 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2 O / N.
2. 드루g 치료
- 시험 약물로서 닐 로티 닙을 사용합니다. DMSO 0, 2, 4 및 20 밀리미터 닐 로티 닙의 스톡 용액을 준비한다. 0, 10, 20 및 100 μM 6.7의 2 배 농축 된 약물 용액주고, 5 ㎖의 DMEM 배지에서 200 배 그들 각각의 희석.
- 각 0.1 ml의 매체를 잘 제거하고 매체를 포함하는 약 0.1 ml에 추가 할 수 있습니다. 최종 농도가 0, 5, 10 및 50 μM이다. 5 일간 매체를 포함하는 약물의 세포를 배양 계속합니다.
- 처리의 끝에서, 위상차 현미경을 사용하여 부착 된 세포를 검사하고 사진을 촬영. 멀리 매체를 기음 0.2 ml의 PBS로 한번 살아 접착제 세포를 씻는다.
3. 디지털 PCR을위한 DNA 준비
- 유능한 8을 이용하여를 Lyse 셀.
- 각 웰에 50 ㎕의 알칼리 분해 용액 (25 mM의 NaOH를 0.2 mM의 EDTA)를 추가합니다. 호일로 우물을 밀봉합니다. 오븐에서 30 분간 가열 플레이트상에서 95 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. MICR에서 확인oscope 더 이상 손상 세포가 우물의 표면에 남아 있지 않은지 확인합니다. 경우에 세포를 완전히 용해시키기 가열 시간을 늘리거나 세제를 추가하지 않았다. -20 °에서 한 번에 동결은 세포를 파괴 강화합니다 C.
- 물론 각 용액 (40 mM 트리스-HC, 산도 4.0) 중화 50 μl를 추가합니다. 10 ~ 30 분 동안 95 ° C에서 PCR의 자전거 타는 사람에 PCR 플레이트와 건조의 U 형 우물에 모든 해물을 전송합니다. 증류수 20 μL와 해물을 복원합니다.
- 드롭 투석 구를 사용하여 탈염
- 평균 기공 크기는 0.025 μm의 가진 멤브레인 필터를 사용한다.
- 12 웰 플레이트의 우물에 빛나는 쪽이 위로 증류수에 필터를 플로트. 5 분 동안 가습 필터. 필터 및 물과 공기 방울을 방지하기 위해주의.
- 피펫 신중 필터의 4 각 영역에 진입 단계 3.1.4에서 각 샘플의 재구성 해물. 접시를 덮고 30 ~ 60 분 동안 투석.
- 필터를 통해 틀지이나 방울을 방해하지 않고 필터에서 물을 멀리 빨아.
- 새로운 PCR 플레이트의 우물에 해물-방울을 전송합니다. PCR의 사이 클러 10 분 30 95 ° C에서 가열에 의한 DNA-방울을 건조시킵니다. 10 μl의 물에 해물을 복원합니다.
4. 디지털 PCR
- 이러한 DNA, 버퍼 및 RT의 분석 믹스로 해동 냉동 구성 요소 (예를 들어, VWR 미니 원심 분리기) 가능한 원심 분리기의 최대 힘에서 10 초 동안 스핀 다운 후 얼음에 보관하십시오.
- DNA (표 1)을 제외한 모든 구성 요소를 포함하는 마스터 혼합물을 준비합니다. 죽은 볼륨을 고려하고 필요한 양보다 약 10 % 더 마스터 혼합물을 계산합니다.
참고 : 상업 키트에 사용 된 프라이머 및 프로브를 사용합니다. - 소용돌이 마스터 혼합물 (예를 들어, VWR 미니 원심 분리기) 가능한 원심 분리기의 최대 힘에서 10 초 동안 스핀 다운 각 15 μl를 분배96 PCR 플레이트의 웰. 마스터 혼합물을 함유하는 웰에 각 시료 (DNA를 포함) 모두 해물을 추가한다. 전송 RT에서 카트리지의 시료 측의 각 웰에 반응 혼합물 20 μL.
- 카트리지의 유로 측의 각 웰에 방울 생성기 오일 70 μL 분주. 가스켓과 카트리지를 닫고 방울 생성기로 전체 설정을 배치합니다. 액적 생성을 시작합니다.
- 96 웰 PCR 플레이트의 우물로 전송 40 μL 방울-솔루션입니다. 포일와 함께 접시를 밀봉하고 PCR의 자전거 타는 사람에 접시를 놓습니다. 105 ° C에서 뚜껑 온도를 설정하고 2 ° C / sec의 속도를 램프. 표 2의 설정을 사용하여 PCR을 수행하십시오. PCR을가, 방울 리더에 플레이트를 전송하고 읽기 시작 후. 또한, 최대 24 시간 동안 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
5. 종양 세포의 비율을 계산
- 디지털 PCR 데이터를로드 및 자동 분석가를 수행이다.
- 직접 양극과 음극 방울의 일차원 및 2- 차원 분포를 조사하여 각각의 분석의 결과를 제어하고 잘 분리하고, 임계 라인 오른쪽 위치에 있다고 확인. 결과는 예를 들어, 기준을 만족하지 제외, 상기 분석에서 포지티브 및 네거티브 방울의 명확한 분리. 엑셀 시트에 결과 비 NF1 / RPP30를 복사합니다.
- 2 × (1- NF1 / RPP30)으로 종양 세포의 비율을 계산합니다.
종양 세포의 비율 6. 용량 의존적 변화
- 각각의 약물 농도를 들어, 4 회 반복의 평균과 표준 편차를 계산한다. 수단 및 약물 농도에 대한 표준 편차를 플롯.
Representative Results
DNA의 품질이 결합 된 유능한가 / 드롭 투석을 만족 디지털 PCR (그림 1B)에 대한 충분한 사용하여 제조. 2000 아세포를 들어, 약 3000 ± 500 긍정적 방울 예상 4,000 복사본 (하나의 셀에 2 부)의 75 %에 해당 얻었다. 본 연구에서 종양 세포가 5 NF1 유전자의 이형 접합체 삭제 것으로 알려진 확립 라인 MPNST S462에서 있었다. 이것은 50 %의 유전자 투여 량의 감소는 분명히 듀얼 디지털 PCR 분석 (도 1b)에 의해 검출 하였다. 대조적으로,이 유전자의 두 카피가 섬유 아세포에서 측정 하였다. 종양 및 비 종양 세포 간의 이러한 차이는 유전 혼합 배양에서 종양 세포 (도 2)의 비율의 계산을 가능하게한다. RPP30에 NF1의 상대 유전자 투여 량을 측정하여, 혼합 배양에서 종양 세포의 비율이 결정될 수있다각각의 약물 농도 (그림 3).
원리 그림 1. 디지털 PCR. (A)입니다. (B) 듀얼 프로브 분석은 기준 (RPP30) 유전자와 관련하여 종양 세포 MPNST S462에서 대상 (NF1) 유전자의 감소 된 양을 알 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 종양 세포의 비율 계산. 종양 세포 및 비 - 종양 세포를 다양한 비율로 혼합하고 96 플레이트의 각 웰에 시딩 하였다. 첨부 O / N, 세포가 용해 된 후, 재치시간인가요 / 드롭 투석 탈염 해물 NF1 / RPP30 비율 준 디지털 PCR을 실시 하였다. 이 비율에 대한 자료는 각 웰에서 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 평균과 각 4 설정 비율로 복제에서 종양 세포의 비율의 표준 편차를 계산 하였다. 종양 세포 (Y 축)의 계산 된 비율은 셋업 비율 (X 축)에 대해 도시 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 종양 세포의 비율 3 투여 량에 따른 변화. (A) 용량 의존적 표시 필수적인 세포의 감소. (B) 종양 세포의 비율 (평균 4 회 반복의 표준 편차)을 계산 NF1 비율 - 10 μM RPP30 0의 범위에서 감소 하였다. 가장 높은 용량 50 μM에서 몇 가지 중요한 세포로 인해 모든 세포에 독성 효과, 가능성이 남았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 비 종양 세포에서의 종양 세포의 응답을 분리 한도 4 (A) 가능성 및 / 또는 전체 세포의 증식은 통상의 분석법을 사용하여 측정 될 수있다; 종양 세포의 비율은 본 연구에서 설명 된 절차를 사용하여 결정될 수있다. 두 개의 매개 변수를 사용하여 (B)은, 약물을 혼합 배양에서 총 세포의 반응은 종양 세포가 아닌 종양 세포 반응의 반응으로 나눌 수있다..COM / 파일 / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1 반응 | ||
| 2 × ddPCR 수퍼 믹스 | (12) | |
| NF1에 대한 분석 믹스 | 1.2 | |
| RPP30에 대한 분석 믹스 | 1.2 | |
| HaeIII | 0.6 | |
| 소계 | (15) | 마스터 혼합물 |
| DNA | 9 | |
| 합계 | (24) | 최종 PCR 혼합물 |
표 1은 듀얼 ddPCR 반응 설정
| 단계 | 동작 | 온도 | 시각 | 사이클 |
| 1 | Polym활성화를 삭제 | 95 ° C | 10 분 | 1 |
| 이 | DNA 변성 | 94 ° C | 30 초 | (40) |
| 삼 | 소둔 / exetension | 60 ° C | 1 분 | |
| 4 | 중합 효소 비활성화 | 98 ° C | 10 분 | 1 |
| (5) | 홀드 (선택 사항) | 4 ° C |
표 2 PCR 자전거 타는 설정
Discussion
시험 관내 약물 특이성 평가 본 genetic- 셀 기반 도구의 핵심 단계는 하나 이상의 암 특이 유전자의 기능을 이용하여 종양 세포의 비율을 결정한다. 종래의 표현형 특징 7 대조적으로, 유전자 기능은 특정 안정하고 정량화하기 쉽다. 예를 들면, 종양 특이적인 변이 또는 카피 수 변이가 아닌 종양 세포에 독점적으로 종양 세포가 아니라 존재한다. 이러한 유전 적 특질을 확실하고 정확하게 본 연구에서 입증 된 바와 같이 디지털 PCR하여, 예를 들어, 정량 할 수있다.
디지털 PCR의 경우, DNA의 순도가 필수적인 것은 아니다. 그러나, 탈염 및 억제 분자를 제거하는 적절한 필터를 이용하여 드롭 투석에 의해 달성 될 수있는 필요하다. 모은 용해 및 드롭 투석, 간단하고 신속 특별한기구를 필요로하지 않으며, 따라서 임의의 표준 실험실에서 수행 될 수있다. 세포의 브리를하지 않으면또한 K, 추가 처리는, -20 ° C에서 세포를 동결 세제를 추가 및 / 또는 단백질 분해 효소를 사용하는 것으로 간주 될 수있다.
본 연구에서, NF1 유전자의 이형 삭제 정량화 대한 종양 특이 기능을 사용한다. 마찬가지로, 다른 유전자 나 좌위의 결실이 또한 사용될 수있다. 또한 돌연변이는 종양 세포를 정량화하기 위해 사용될 수있다. 이러한 경우에, 디지털 돌연변이 PCR 분석법 정상 대립 유전자는 광범위 그들 각각 특이성을 확인하기 위해 검증되어야한다.
종양 세포의 투여 량 - 의존 비율은 약물 - 특이성 또는 선택성에 대한 표시를 제공한다. 게다가, 그것은 또한 약물 (도 4)에 혼합 배양 총 세포의 반응에서 종양 세포의 추출 반응을 가능하게한다. 이 추출 전략없이 종양 모두 포함 차 배양을 사용의 기술적 문제에 대한 솔루션 (제공약물 테스트를위한 N-종양 세포).
genetic- 때문에 응용 가능성을 가질 수있다 본 연구에서 입증 시험 관내 도구에서 셀 기반 (1)가 시험 관내에서 약물 특이성 또는 선택성을 평가하고 플랫폼을 제공 약물 발견 (2) 맞춤 암 치료에 어디를 차 문화에서 시험 약물을 가능하게하고 결과적으로 보조 화학 요법 사에서 약물 선택에 기여할 수있다. 특정 유전자 변경 또는 여러 유전 적 변화는 약물 치료 중이어서 할 수 있기 때문에 또한, 약물의 약리 메커니즘은이 도구를 사용하여 공부하실 수 있습니다.
개별화 차 배양을 사용에 어려움이 결핍 종양 세포의 정량 범용 유전 기능이다. 그러나, 전체 게놈 시퀀싱 오늘의 진행과 함께 자주 변경 유전자 영역이 공통 종양으로 알려져있다. 예를 들어, 머리와 목 사이종양, 71 %, 23 % 및 22 %는 TP53, FAT1 돌연변이 및 CDKN2A 유전자, 60 %, 34 % 및 26 %가 CDKN2A, STK11 및 PTEN 각각 10 유전자 영역의 결실을 가지고있다. 타겟 시퀀싱 및 / 또는 디지털 PCR을 이용하여 5 내지 10 등의 유전자 및 / 또는 영역을 스크리닝 따라서 가능성 유래 일차 배양에서 종양 세포의 정량에 이용 될 수있는 하나 이상의 유전 적 변형을 확인한다. 또 다른 제한은 차 문화를 설정하는 절제된 종양의 자주 부족한 양이다.
유리한 기능과 genetic-의 유망한 응용 잠재력과 셀 기반 체외 도구가, 그 한계를 염두에 보관해야하고 시험 관내 특성이 강조되어야한다에도 불구하고. 예를 들어, 종양 세포에 대한 약물의 차동 영향이나 독성 수도 인해 오히려 세포 유형의 차이 (슈반 세포 대 섬유 아세포)를하거나(다른 개인의) 다른 기원. 비 - 종양 세포에 비해 종양 세포에 대한 약물의 강력한 효과는 전자가 후자보다 더 빠르게 증가한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. 가장 중요한 것은, 체외 동작 셀은 인체 세포보다 다르며 따라서, 시험 관내 평가의 결과들은 실제 임상 상황을 반영하지 않거나 부분적으로 수행. 따라서, 효능, 독성 및 배양 된 세포에 대해 얻어진 약물의 특이성은 오히려 바이오 마커 성격이지만 항생제 전임상 측정 효과의 신뢰성이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 혼합 문화 및 / 또는 주 문화에 세포 라인에서 이동하는 생체 외 약물 효과와 특이도 / 선택도를 평가하는데 앞으로 단계입니다. 광범위한 노력으로, 시험관 조건에서 적어도 일부 의약품에 대한 환자의 실제 반응과 체외 데이터의 합리적인 상관 관계를 가능하게하는 찾을 수 있습니다.
Acknowledgments
부인 스터 씨 Honrath 박사 지앙은 뛰어난 기술 지원을 부탁드립니다. 또한 닥터 VOLZ 및 디지털 PCR 장치에 대한 액세스를 제공하기위한 Dandri 박사의 연구 그룹은 알 것이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
