Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist die Spezifität von Antikrebs - Arzneimittel in vitro zu beurteilen , Mischkulturen unter Verwendung von sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält.
Abstract
Ein Verfahren für die Spezifität der Antikrebs - Arzneimittel in vitro Beurteilung unter Verwendung von Kulturen sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält , nachgewiesen wird . Das Schlüsselelement ist die quantitative Bestimmung eines tumorspezifische genetische Veränderung in Bezug auf eine universelle Sequenz, die ein Dual-Sonde digitalen PCR-Assay und die nachfolgende Berechnung des Anteils der Tumorzellen verwendet wird. Der Test wird auf einem Kulturzellen einer etablierten Linie enthaltenden Tumors durchgeführt und versetzt in Nicht-Tumorzellen. Die Mischkultur wird in verschiedenen Konzentrationen mit einem Testwirkstoff behandelt. Nach der Behandlung wird die DNA auf eine Dual-Sonde digitalen PCR Assay direkt von den überlebt Klebstoff Zellen in Wells von 96-Well-Platten eine einfache und kostengünstige Methode und unterzogen unter Verwendung eines tumorspezifische genetische Veränderung und eine Referenz universelle Sequenz zur Messung . In der vorliegenden Demonstration, eine heterozygote Deletion des NF1 - Gens wird als tumorspezifische genetische Veränderung verwendet , undein RPP30 Gen als Referenz - Gen. Verwendung des Verhältnisses NF1 / RPP30 wurde der Anteil der Tumorzellen berechnet. Da die dosisabhängige Veränderung des Anteils der Tumorzellen für die Spezifität des Medikaments eine in vitro Anzeige liefert, diese genetische und zellbasierten in vitro - Assay wird wahrscheinlich Anwendungspotential in der Wirkstoffforschung. Darüber hinaus für die personalisierte Krebsfürsorge, diese Gen- und Zell-basiertes Tool kann zur Optimierung der adjuvanten Chemotherapie durch Prüfung der Wirksamkeit und Spezifität von Wirkstoffkandidaten mit Primärkulturen von einzelnen Tumoren beitragen.
Protocol
1. Vorbereitung Mix Kultur, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen
- Verwenden von Tumorzellen aus einer etablierten Zelllinie MPNST S462 5. Verwenden Fibroblasten als die Nicht-Tumorzellen 6,7
- Kultur sowohl Tumorzellen und Fibroblasten in Standard-DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (BSA), 3 mM Glutamin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 500 U / ml Penicillin, 500 g / ml Streptomycin und 1 mM Natriumpyruvat bei 37 ° C und 5% CO 05-7 Februar. Bei Subkonfluenz, ernten die Zellen mit 0,05% Trypsin und zähle sie eine Zählkammer.
- Mischungs 400 Tumorzellen und 1600 Nicht-Tumorzellen zusammen in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte in 0,2 ml Medium. Berücksichtigung schnelleres Wachstum von Tumorzellen über den Behandlungszeitraum von 5 Tagen wurde der anfängliche Anteil der Tumorzellen auf 25% eingestellt. Richten Sie 4 Wiederholungen für jede Wirkstoffkonzentration. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N.
2. Drug Behandlung
- Verwenden Sie Nilotinib als Test Droge. Stocklösungen von 0, 2, 4 und 20 mM Nilotinib in DMSO. Verdünnte jeder von ihnen um 200-fach in 5 ml DMEM - Medium, so dass 2-fach konzentriertem arzneimittel Lösungen von 0, 10, 20 und 100 & mgr; M 6.7.
- Entfernen Sie 0,1 ml Medium aus jeder Vertiefung und 0,1 ml Medium, das Medikament. Die Endkonzentrationen sind 0, 5, 10 und 50 uM. Weiter, um die Zellen in Medium, das Medikament für 5 Tage inkubiert.
- Am Ende der Behandlung, überprüfen Sie die anhaftenden Zellen ein Phasenkontrastmikroskop und Fotos zu machen. Saugen Sie das Medium entfernt, waschen Sie einmal die überlebt Klebstoff Zellen mit 0,2 ml PBS.
3. Vorbereitung DNA für digitale PCR
- Lyse Zellen HotShot mit 8.
- Zugabe von 50 & mgr; l alkalische Lyse-Lösung (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Folie. Inkubieren der Platte bei 95 ° C in einem Ofen oder auf einer Heizplatte für 30 min. Überprüfen Sie unter einer micrOscope, um sicherzustellen, dass nicht mehr intakte Zellen an der Oberfläche der Vertiefungen blieb. Bei lysieren die Zellen, erhöhen nicht vollständig die Heizzeit oder Reinigungsmittel hinzufügen. Frieren sie einmal bei -20 ° C auch verbessert das Brechen Zellen.
- In 50 ul Neutralisierungslösung (40 mM Tris-HC, pH 4,0) in jede Vertiefung. Übertragen alle Lysate in U-Form Vertiefungen einer PCR-Platte und trocken in einer PCR-Cycler bei 95 ° C für 10 bis 30 min. Rekonstitution der Lysate mit 20 & mgr; l destilliertes Wasser.
- Entsalzen mit Tropfen-Dialyse 9
- verwenden Membranfilter mit einer mittleren Porengröße von 0,025 & mgr; m.
- Schwimmer den Filter auf destilliertem Wasser mit glänzenden Seite nach oben in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Befeuchten Sie die Filter für 5 min. Achten Sie Luftblasen zwischen dem Filter und Wasser zu vermeiden.
- Pipettieren die rekonstituierten Lysaten von jeder Probe aus Schritt 3.1.4 vorsichtig auf auf jeder der vier Bereiche des Filters. Decken Sie die Platte und dialysiere für 30 bis 60 min.
- Saugen Sie das Wasser unter dem Filter entfernt, ohne den Filter Umklappen noch die Tropfen zu stören.
- Transfer des Lysats Tropfen in die Vertiefungen einer neuen PCR-Platte. Trockne die DNA-Tropfen durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 bis 30 min in einer PCR-Cycler. Rekonstitution der Lysate in 10 & mgr; l Wasser.
4. Digitale PCR
- Auftau-frozen Komponenten wie DNA, Puffer und der Testansatz bei RT spin bei Maximalkraft von jeder verfügbaren Zentrifuge für 10 sec nach unten (beispielsweise VWR Minizentrifuge) und dann auf Eis halten.
- Vorbereitung Master Mischung enthaltend alle Komponenten außer DNA (Tabelle 1). Betrachten Sie Totvolumen und berechnen Master Mischung ca. 10% mehr als die erforderliche Menge.
HINWEIS: Verwenden Sie die Primer und im Handel erhältlichen Kits verwendeten Sonden. - Vortex die Master-Mischung, Spin-down für 10 Sekunden bei maximaler Kraft von jeder verfügbaren Zentrifuge (zB VWR Mini-Zentrifuge) und 15 & mgr; l zu jeder verzichtenVertiefung einer Platte mit 96-PCR. Fügen Sie alle Lysat von jeder Probe (die DNA enthält) in die Vertiefungen der Master-Gemisch enthält. Transfer 20 ul jeder Reaktionsmischung in eine gut auf der Probenseite einer Kartusche bei RT.
- Dispense 70 ul Tröpfchengenerator Öl in jede Vertiefung auf der Ölseite einer Kartusche. Schließen Sie die Kassette mit der Dichtung und legen Sie die gesamte Einstellung in einen Tröpfchengenerator. Starten Sie Tropfenerzeugung.
- Transfer 40 ul Tröpfchen-Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte. Verschließen Sie die Platte mit einer Folie und legen Sie die Platte in eine PCR-Cycler. Stellen Sie den Deckel-Temperatur bei 105 ° C und Rampenrate bei 2 ° C / s. Führen Sie die PCR mit den Einstellungen in der Tabelle 2. Nach der PCR, übertragen Sie die Platte in einen Tröpfchen Leser und dem Lesen beginnen. Alternativ speichern Sie die Platte bei 4 ° C bis zu 24 Stunden.
5. Berechnen Anteil der Tumorzellen
- Laden Sie die digitalen Daten PCR und führen Sie die automatische analysist.
- Steuern die Ergebnisse jedes Test manuell durch die eindimensionale und 2-dimensionale Verteilung der positiven und negativen Tröpfchen Inspizieren und sicherzustellen, dass sie gut getrennt sind und die Schwellenlinien wurden in den richtigen Positionen. Ausschließen Ergebnisse nicht die Kriterien erfüllen, zum Beispiel keine klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen, von der weiteren Analyse. Kopieren Sie die resultierende Verhältnis NF1 / RPP30 in ein Excel - Blatt.
- Berechnen des Anteils der Tumorzellen , wie: 2 x (1- NF1 / RPP30).
6. Dosisabhängige Änderung der Anteil der Tumorzellen
- Für jedes Arzneimittel-Konzentration, die mittlere und Standardabweichung von den vier Replikaten berechnen. Zeichnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen gegen den Drogenkonzentrationen.
Representative Results
Die Qualität der hergestellten DNA die kombinierte HotShot / Tropfen-Dialyse ausreichend ist für eine zufriedenstellende digitale PCR (Abbildung 1B) verwendet wird . Für 2000 Fibroblasten, etwa 3000 ± 500 positive Tröpfchen erhalten, was 75% der erwarteten 4.000 Kopien entspricht (zwei Kopien in einer Zelle). In dieser Studie wurden die Tumorzellen aus einer etablierten Linie MPNST S462 die eine heterozygote Deletion des NF1 - Gens 5 haben , sind bekannt. Diese 50% Gendosis Reduktion wurde durch das Dual - Digital - PCR - Assay (1B) eindeutig erkannt. Im Gegensatz dazu zwei Kopien dieses Gens wurden in Fibroblasten gemessen. Diese genetische Unterschied zwischen Tumor- und Nicht-Tumorzellen ermöglicht die Berechnung des Anteils der Tumorzellen in gemischten Kulturen (Figur 2). Durch Messung der relativen Gendosis von NF1 bis RPP30, Anteil von Tumorzellen in einer Mischkultur bestimmt werdenbei jeder Arzneimittelkonzentration (Abbildung 3).
Abbildung 1. Digital PCR. (A) Darstellung des Prinzips. (B) ein Dual-Sondentest zeigt reduzierte Menge eines Ziels (NF1) Gen in den Tumorzellen MPNST S462 in Bezug auf einen Referenz (RPP30) -Gen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Berechnete Anteil der Tumorzellen. Die Tumorzellen und Nicht-Tumorzellen wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und entkernt in jede Vertiefung einer 96-Platte. Nach der Befestigung O / N wurden die Zellen lysiert with HotShot / Tropfendialyse entsalzt und die Lysate wurden in digitale PCR unterzogen , die das Verhältnis von NF1 / RPP30 gab. Basis dieses Verhältnisses Anteil von Tumorzellen in jeder Vertiefung wurde berechnet. Mittelwert und Standardabweichung der Anteil der Tumorzellen wurden berechnet aus 4 bei jedem Set-up Anteil repliziert. Die berechneten Anteile von Tumorzellen (Y-Achse) gegen die Set-up Proportionen aufgetragen wurden (X-Achse). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. dosisabhängige Veränderung der Anteil der Tumorzellen. (A) eine dosisabhängige Verringerung der sichtbaren vitalen Zellen. (B) Anteil der Tumorzellen (Mittelwert und Standardabweichung von 4 Replikaten) aus der berechneten Verhältnis von NF1: RPP30 verringerte sich im Bereich von 0 - 10 & mgr; M. Bei der höchsten Dosis 50 & mgr; M, wenige vitale Zellen gelassen wurden, wahrscheinlich durch toxische Wirkung auf alle Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 4. Vereinzeler Reaktion von Tumorzellen von der Nicht-Tumorzellen (A) Lebensfähigkeit oder / und die Proliferation von Zellen insgesamt kann unter Verwendung herkömmlicher Tests gemessen werden; Anteil der Tumorzellen kann unter Verwendung des Verfahrens in der vorliegenden Studie gezeigt werden, bestimmt. (B) über die beiden Parameter, Reaktion der gesamten Zellen in einer Mischkultur auf ein Medikament kann in Reaktion der Tumorzellen und der Reaktion des nicht-Tumorzellen unterteilt werden..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| 1 Umsetzung | ||
| 2 x ddPCR supermix | 12 | |
| Assay-Mix für NF1 | 1.2 | |
| Assay-Mix für RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0,6 | |
| Zwischensumme | 15 | Stammischung |
| DNA | 9 | |
| Gesamt | 24 | Endgültige PCR-Gemisch |
Tabelle 1 Einrichten von Dual - ddPCR Reaktion
| Schritt | Aktion | Temperatur | Zeit | Fahrräder |
| 1 | Polymlöschen Aktivierung | 95 ° C | 10 Minuten | 1 |
| 2 | DNA-Denaturierung | 94 ° C | 30 sec | 40 |
| 3 | Glüh- / exetension | 60 ° C | 1 Minute | |
| 4 | Polymerase Deaktivierung | 98 ° C | 10 Minuten | 1 |
| 5 | Hold (optional) | 4 ° C |
Tabelle 2 : PCR - Cycler - Einstellungen
Discussion
Der Schlüsselschritt in dieser Gen- und zellbasierte Werkzeug für die Beurteilung der Arzneimittelspezifität in vitro ist die Bestimmung des Anteils der Tumorzellen mit einem oder mehreren Tumor-spezifischen genetischen Merkmale. Im Gegensatz zu herkömmlichen phänotypischen Merkmale 7, sind genetische Merkmale spezifische, stabil und einfach zu quantifizieren. Zum Beispiel ist eine tumorspezifische Mutation oder Veränderung der Kopienzahl vorhanden ausschließlich in die Tumorzellen, jedoch nicht in Nicht-Tumorzellen. Eine solche genetische Stigma zuverlässig werden kann und genau quantifiziert werden, beispielsweise digitale PCR unter Verwendung der in dieser Studie nachgewiesen.
Für die digitale PCR ist eine hohe Reinheit der DNA nicht wesentlich. Jedoch sind Entsalzen und Entfernen inhibitorische Moleküle notwendig, die durch einen Tropfendialyse erreicht werden kann, einen geeigneten Filter. Die kombinierte Lyse und Drop-Dialyse ist einfach und schnell, erfordert keine speziellen Instrumente und daher in jedem Standard-Labor durchgeführt werden kann. Wenn die Zellen nicht Break gut, kann eine zusätzliche Behandlung in Betracht gezogen werden, wie die Zellen bei -20 ° C einfrieren, Zugabe von Reinigungsmittel oder / und unter Verwendung von Protease.
In der vorliegenden Studie wurde die heterozygote Deletion des NF1 - Gen als das tumorspezifische Merkmal für die Quantifizierung verwendet. In ähnlicher Weise kann auch verwendet werden, Deletionen anderer Gene oder Loci. Weiterhin Mutationen können auch zur Quantifizierung von Tumorzellen verwendet werden. In einem solchen Fall digital PCR-Assays für die mutierten und die normalen Allele müssen umfassend validiert werden, um ihre Spezifität für jeden von ihnen zu gewährleisten.
Dosisabhängige Anteil der Tumorzellen liefert eine Anzeige für arzneimittel Spezifität oder Selektivität. Darüber hinaus ermöglicht es auch von Tumorzellen aus der Reaktion der gesamten Zellen einer gemischten Kultur mit einem Medikament (4) Extrahieren Antwort. Diese Extraktion Strategie stellt eine Lösung für das technische Problem bei der Verwendung Primärkulturen (die sowohl Tumor enthält und keinn-Tumorzellen) für Drogentests.
Die Gen- und zellbasierten in vitro - Tool in der vorliegenden Studie gezeigt , daher Anwendungspotenzial aufweisen (1) in der Arzneimittelentdeckung , wo es eine Plattform für die Beurteilung der Arzneimittel Spezifität oder Selektivität in vitro und (2) in der personalisierten Krebsbehandlung bietet , wo es ermöglicht die Prüfung Drogen in Primärkulturen und damit zu arzneimittel Auswahl in der adjuvanten Chemotherapie 4 beitragen können. Darüber hinaus können pharmakologische Mechanismus eines Medikaments untersucht werden dieses Werkzeug verwenden, da bestimmte genetische Veränderung oder mehrere genetische Veränderungen können während der Arzneimittelbehandlung folgen.
Eine Schwierigkeit in individualisierter Primärkulturen ist das Fehlen einer universellen genetischen Merkmal für die Quantifizierung der Tumorzellen. Jedoch mit vorab in der heutigen Gesamtgenom-Sequenzierung, die am häufigsten veränderten Gene und Regionen sind für die gemeinsame Tumoren bekannt. Zum Beispiel unter Kopf und HalsTumoren, 71%, 23% und 22% haben Mutationen im TP53, FAT1 und CDKN2A gene, und 60%, 34% und 26% weisen Deletionen in den Genregionen von CDKN2A, STK11 und PTEN bzw. 10. Screenen von 5 bis 10 solcher Gene oder / und Regionen durch gezielte-Sequenzierung oder / und digitale PCR identifiziert daher wahrscheinlich eine oder mehrere genetische Veränderungen, die zur Quantifizierung von Tumorzellen in der abgeleiteten Primärkultur verwendet werden können. Eine weitere Einschränkung ist die oft unzureichende Menge an reseziert Tumoren für Primärkulturen aufzubauen.
Trotz der vorteilhaften Merkmale und viel versprechende Anwendungsmöglichkeiten der Gen- und zellbasierten in vitro - Tool sollte seine Grenzen gehalten werden , in Geist und seine in - vitro - Natur hervorzuheben. Zum Beispiel können die unterschiedlichen Effekte oder Zytotoxizität eines Arzneimittels auf Tumorzellen kann nicht aufgrund des Unterschieds in Zelltypen (Fibroblasten vs. Schwann-Zellen) oder ihreunterschiedlicher Herkunft (von verschiedenen Individuen). Die stärkere Wirkung eines Arzneimittels auf Tumorzellen als auf Nicht-Tumorzellen können auch durch die Tatsache erklärt werden, daß die erstere schneller wachsen als die letzteren. Am wichtigsten ist , Zellen in vitro Verhalten unterscheidet , als Zellen im menschlichen Körper und folglich Ergebnisse der in vitro Beurteilung oft nicht oder nur teilweise den realen klinischen Situation widerzuspiegeln. Daher Wirksamkeit, Zytotoxizität und Spezifität von Medikamenten für kultivierte Zellen erhalten werden, sind eher von biomarker Natur, aber nicht über die Zuverlässigkeit der gemessenen vorklinisch Wirksamkeit von Antibiotika. Dennoch ist Bewegen von Zelllinien zu Mischkulturen und / oder Primärkulturen ein Fortschritt arzneimittel Wirkung und Spezifität / Selektivität in vitro in der Beurteilung. Mit umfangreichen Bemühungen, in vitro Bedingungen können gefunden werden , die eine angemessene Korrelation von in vitro - Daten mit realen Reaktionen von Patienten, zumindest für einige Medikamente ermöglicht.
Acknowledgments
Frau Alster, Herr Honrath und Dr. Jiang sind bekannt für ihre hervorragende technische Unterstützung geschätzt. geschätzt Auch Dr. Volz und die Forschungsgruppe von Dr. Dandri für die Bereitstellung der Zugriff auf ihre digitalen PCR-Gerät ist.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
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