Summary
L'objectif de ce protocole est d'évaluer la spécificité des médicaments anticancéreux in vitro en utilisant des cultures mixtes contenant des cellules tumorales à la fois et non tumorales.
Abstract
Un procédé permettant d' évaluer la spécificité de médicaments anticancéreux in vitro en utilisant des cultures contenant des cellules à la fois tumorales et non tumorales est démontrée. L'élément clé est la détermination quantitative d'une altération génétique spécifique de la tumeur par rapport à une séquence universelle utilisant un essai de PCR numérique bi-sonde et le calcul subséquent de la proportion de cellules tumorales. L'essai est effectué sur une culture contenant des cellules tumorales d'une lignée établie et dopés dans des cellules non tumorales. La culture mixte est traitée avec un médicament d'essai à diverses concentrations. Après le traitement, l'ADN est préparé directement à partir des cellules adhérentes ont survécu dans les puits de plaques à 96 puits en utilisant une méthode simple et peu coûteuse, et on le soumet à un test de PCR numérique bi-sonde pour mesurer une modification génétique spécifique de la tumeur et une séquence universelle de référence . Dans la présente démonstration, une délétion hétérozygote du gène NF1 est utilisé en tant que l'altération génétique spécifique de la tumeur etRPP30 un gène en tant que gène de référence. En utilisant le rapport NF1 / RPP30, la proportion de cellules tumorales a été calculée. Etant donné que le changement de dose-dépendante de la proportion de cellules tumorales fournit une indication de la spécificité in vitro du médicament, cet essai in vitro génétique et à base de cellules aura probablement un potentiel d'application dans la découverte de médicaments. En outre, pour le cancer de soins personnalisé, cet outil genetic- et à base de cellules peut contribuer à l'optimisation de la chimiothérapie adjuvante au moyen de tests d'efficacité et la spécificité des médicaments candidats en utilisant des cultures primaires de tumeurs individuelles.
Protocol
1. Préparation de mélange de culture contenant à la fois des cellules tumorales et des cellules non tumorales
- Utiliser les cellules tumorales à partir d' une lignée cellulaire établie MPNST 5 S462. Utiliser les fibroblastes que les cellules non tumorales 6,7
- La culture à la fois les cellules tumorales et les fibroblastes dans un milieu DMEM classique avec 10% de sérum de fœtus bovin (BSA), glutamine 3 mM, 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol, 500 U / ml de pénicilline, 500 pg / ml de streptomycine et du pyruvate de sodium 1 mM à 37 ° C, et 5% de CO 2 5-7. Au sous-confluence, récolter les cellules avec 0,05% de trypsine et les compter en utilisant un hémocytomètre.
- Mélanger 400 cellules tumorales et 1600 cellules non tumorales ensemble dans chaque puits d'une plaque de culture à 96 puits dans 0,2 ml de milieu. Compte tenu de la croissance plus rapide des cellules tumorales au cours de la période de 5 jours de traitement, la proportion initiale de cellules tumorales a été fixée à 25%. Mettre en place 4 répétitions pour chaque concentration de médicament. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 O / N.
2. DruTraitement g
- Utiliser le nilotinib comme médicament d'essai. Préparer des solutions mères de 0, 2, 4 et 20 nilotinib mM dans du DMSO. Diluer chacun d'eux par 200 fois dans 5 ml de milieu DMEM, ce qui donne deux fois concentré médicamenteux solutions de 0, 10, 20 et 100 uM 6,7.
- Retirer 0,1 ml de milieu de chaque puits et ajouter 0,1 ml de milieu contenant un médicament. Les concentrations finales sont comprises entre 0, 5, 10 et 50 uM. Continuer à incuber les cellules dans un milieu contenant un médicament pendant 5 jours.
- A la fin du traitement, inspecter les cellules fixées à l'aide d'un microscope à contraste de phase et de prendre des photos. Aspirer le milieu de suite, laver les cellules adhésives survécu une fois avec 0,2 ml de PBS.
3. Préparation de l'ADN pour la PCR numérique
- Lyser les cellules en utilisant HotShot 8.
- Ajouter 50 ul de solution de lyse alcaline (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) à chaque puits. Sceller les puits avec du papier. Incuber la plaque à 95 ° C dans un four ou sur une plaque chauffante pendant 30 minutes. Vérifiez sous un microscope pour vous assurer qu'il n'y a pas plus de cellules intactes sont restées à la surface des puits. Dans le cas où les cellules ne lysent complètement, augmenter le temps de chauffage ou d'ajouter un détergent. Congeler une fois à -20 ° C améliore également les cellules de rupture.
- Ajouter 50 ul solution (40 mM Tris-HC, pH 4,0) à chaque neutralisants bien. Transférer tous les lysats dans U-forme puits d'une plaque PCR et sec dans un cycleur PCR à 95 ° C pendant 10 à 30 min. Reconstituer les lysats avec 20 ul d'eau distillée.
- Dessaler utilisant Goutte-Dialyse 9
- utiliser des filtres à membrane avec une moyenne taille des pores 0,025 um.
- Float le filtre sur l'eau distillée avec brillant vers le haut dans les puits d'une plaque de 12 puits. Mouiller le filtre pendant 5 min. Faites attention à éviter les bulles d'air entre le filtre et l'eau.
- Pipet les lysats Les reconstitués de chaque échantillon de l'étape 3.1.4 avec précaution sur sur chacune des 4 zones du filtre. Couvrir la plaque et dialyser pendant 30 à 60 min.
- Aspirer l'eau sous le filtre sans retourner sur le filtre, ni perturber les gouttes.
- Transférer les lysat-gouttes dans les puits d'une nouvelle PCR-plaque. Sécher les gouttes d'ADN en chauffant à 95 ° C pendant 10 à 30 minutes dans un cycleur de PCR. Reconstituer les lysats dans 10 ul d'eau.
4. PCR numérique
- composants Décongeler comme l'ADN, le tampon et le mélange d'essai à la température ambiante, de spin bas pendant 10 secondes à la force maximale de toute centrifugeuse disponible (par exemple, VWR mini-centrifugeuse), puis les garder sur la glace.
- Préparer le mélange maître contenant tous les composants à l'exception de l' ADN (tableau 1). Considérons le volume mort et de calculer le mélange maître d'environ 10% de plus que le montant requis.
REMARQUE: Utilisez les amorces et les sondes utilisées dans le kit commercial. - Vortex, le mélange maître, centrifuger pendant 10 secondes à la force maximale de toute centrifugeuse disponible (par exemple, VWR mini-centrifugeuse) et distribuer 15 pi à chaquepuits d'une plaque de 96 PCR. Ajouter tous lysat (qui contient de l'ADN) de chaque échantillon dans les puits contenant le mélange maître. Transférer 20 pl de chaque mélange réactionnel dans un puits sur le côté d'une cartouche échantillon à température ambiante.
- Distribuer 70 pi d'huile générateur de gouttelettes dans chaque puits, du côté de l'huile d'une cartouche. Fermer la cartouche avec le joint d'étanchéité et placer le paramètre entier dans un générateur de gouttelettes. Lancer la génération de gouttelettes.
- 40 ul de transfert de gouttelettes solution dans les puits d'une plaque PCR à 96 puits. Sceller la plaque avec une feuille et placer la plaque dans un cycleur PCR. Mettre le couvercle de la température à 105 ° C et la rampe vitesse à 2 ° C / sec. Effectuer PCR en utilisant les paramètres dans le tableau 2. Après la PCR, transférer la plaque dans un lecteur de gouttelettes et de commencer la lecture. Vous pouvez également stocker la plaque à 4 ° C pendant jusqu'à 24 heures.
5. Calcul de proportion de cellules tumorales
- Chargez les données numériques PCR et effectuer analys automatiquesest.
- Contrôler les résultats de chaque test manuellement en inspectant la distribution unidimensionnel et 2 dimensions des gouttelettes positives et négatives, et assurer qu'ils sont bien séparés et les lignes de seuil ont été dans les bonnes positions. Exclure les résultats ne répondent pas aux critères, par exemple, pas de séparation claire des gouttelettes positives et négatives, de l'analyse. Copiez le rapport NF1 / RPP30 résultant dans une feuille Excel.
- Calculer la proportion de cellules tumorales comme suit: 2 x (1- NF1 / RPP30).
6. Changement de dose-dépendante de la proportion de cellules tumorales
- Pour chaque médicament-concentration, calculer la moyenne et l'écart type des 4 répétitions. Tracer les moyens et les écarts-types contre la drogue-concentrations.
Representative Results
Qualité de l' ADN préparé en utilisant le HotShot combiné / Chute-dialyse est suffisante pour satisfaisante PCR numérique (figure 1B). Pour 2000 fibroblastes, environ 3000 ± 500 gouttelettes positifs ont été obtenus, ce qui correspond à 75% des attendus 4.000 exemplaires (deux exemplaires dans une cellule). Dans cette étude, les cellules tumorales sont d'une lignée établie MPNST S462 qui sont connus pour avoir une délétion hétérozygote du gène NF1 5. Cette réduction du dosage génique 50% a été clairement détectée par le test de PCR numérique double (figure 1B). En revanche, deux copies de ce gène ont été mesurées dans les fibroblastes. Cette différence génétique entre les cellules tumorales et non tumorales permet de calculer la proportion de cellules tumorales dans des cultures mixtes (figure 2). En mesurant le dosage du gène de la NF1 par rapport à RPP30, la proportion de cellules tumorales dans une culture mixte peut être déterminéà chaque drogue concentration (Figure 3).
Figure 1. Numérique PCR. (A) illustration du principe. (B) un essai à double sonde révèle quantité réduite d'une cible (NF1) gène dans les cellules tumorales MPNST S462 par rapport à un gène de référence (RPP30). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La proportion calculée des cellules tumorales. Des cellules tumorales et des cellules non tumorales ont été mélangées à différents rapports et ensemencées dans chaque puits d'une plaque à 96 puits . Après la fixation O / wit N, les cellules ont été lyséesh HotShot / Chute-dialyse et les lysats dessalées ont été soumis à une PCR numérique qui a donné le rapport de NF1 / RPP30. Sur la base de ce rapport, le pourcentage de cellules tumorales dans chaque puits a été calculé. La moyenne et l'écart type de proportion de cellules tumorales ont été calculées à partir de 4 répétitions à chaque proportion set-up. Les proportions calculées des cellules tumorales (axe Y) ont été tracées en fonction des proportions de mise en place (axe X). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Modification de la dose-dépendante de la proportion de cellules tumorales. (A) dépendante de la dose la réduction des cellules vitales visibles. (B) la proportion de cellules tumorales (moyenne et écart - type de 4 répétitions) calculé à partir de la le rapport de la NF1: RPP30, a diminué dans la plage de 0 - 10 uM. A la dose la plus élevée de 50 uM, quelques cellules vitales ont été laissées, probablement en raison de l' effet toxique pour toutes les cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 4. Réponse de séparation des cellules tumorales de celui des cellules non tumorales (A) , la viabilité et / ou la prolifération des cellules totales peut être mesurée en utilisant des essais classiques; Proportion de cellules tumorales peut être déterminée en utilisant la procédure démontré dans la présente étude. (B) au moyen des deux paramètres, la réponse des cellules totales dans une culture mixte d'un médicament peut être divisé en réponse des cellules tumorales et la réponse des cellules non tumorales..com / fichiers / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| 1 réaction | ||
| 2 x ddPCR supermix | 12 | |
| Assay mélange pour NF1 | 1.2 | |
| mélange de dosage pour RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0,6 | |
| Sous-Total | 15 | mélange maître |
| ADN | 9 | |
| Total | 24 | Le mélange de PCR final |
Tableau 1 Configuration double ddPCR Réaction
| Étape | action | Température | Temps | Cycles |
| 1 | Polymeffacer activation | 95 ° C, | 10 minutes | 1 |
| 2 | dénaturation de l'ADN | 94 ° C, | 30 sec | 40 |
| 3 | Annelage / exetension | 60 ° C, | 1 minute | |
| 4 | Polymerase désactivation | 98 ° C, | 10 minutes | 1 |
| 5 | Maintien (en option) | 4 ° C |
Tableau 2 Paramètres Cycler PCR
Discussion
L'étape clé dans cet outil genetic- et à base de cellules pour évaluer la spécificité des médicaments in vitro est la détermination de la proportion de cellules tumorales en utilisant une ou plusieurs caractéristiques génétiques spécifiques de la tumeur. Contrairement aux caractéristiques classiques phénotypiques 7, les caractéristiques génétiques sont spécifiques, stable et facile à quantifier. Par exemple, une mutation ou d'une variation du nombre de copies spécifique à la tumeur est présent exclusivement dans les cellules tumorales, mais non dans des cellules non tumorales. Un tel stigmate génétique peut être quantifié de manière fiable et précise, par exemple, en utilisant la PCR numérique tel que démontré dans la présente étude.
Pour la PCR numérique, une grande pureté de l'ADN ne soit pas essentiel. Cependant, le dessalage et l'élimination des molécules inhibitrices sont nécessaires, qui peut être atteint par une goutte à la dialyse à l'aide d'un filtre approprié. La lyse et d'abandon dialyse combinée est simple et rapide, ne nécessite pas d'instruments spéciaux et peut donc être effectuée dans un laboratoire standard. Si les cellules ne sont pas Break puits, un traitement supplémentaire peut être considérée comme la congélation des cellules à -20 ° C, en ajoutant un détergent et / ou en utilisant la protéase.
Dans la présente étude, la délétion hétérozygote du gène NF1 a été utilisé comme caractéristique spécifique à une tumeur pour la quantification. De même, des deletions d'autres gènes ou locus peuvent également être utilisés. En outre, des mutations peuvent également être utilisées pour quantifier les cellules tumorales. Dans ce cas, des essais de PCR numériques pour le mutant ainsi que les allèles normaux ont besoin d'être largement utilisée pour assurer leur spécificité pour chacun d'eux.
la proportion dépendant de la dose de cellules tumorales fournit une indication de la spécificité des médicaments ou de la sélectivité. En outre, elle permet également d' extraire une réponse de cellules tumorales à partir de la réponse des cellules totales d'une culture mélangée à un médicament (figure 4). Cette stratégie d'extraction fournit une solution pour le problème technique dans l'utilisation de cultures primaires (qui contient à la fois la tumeur et nonn cellules de la tumeur) pour le dépistage des drogues.
La base de cellules genetic- et outil vitro démontré dans la présente étude peut donc avoir un potentiel d'application (1) dans la découverte de médicaments , où il fournit une plate - forme pour l' évaluation de la spécificité de la drogue ou la sélectivité in vitro et (2) dans le traitement personnalisé du cancer où il permet des médicaments d'essai dans des cultures primaires et par conséquent peut contribuer à la drogue sélection dans la chimiothérapie adjuvante 4. En outre, le mécanisme pharmacologique d'un médicament peut être étudié à l'aide de cet outil, car certaines modifications génétiques ou des altérations génétiques multiples peuvent être suivies au cours du traitement de la toxicomanie.
Une difficulté dans l'utilisation de cultures primaires individualisées est l'absence d'une caractéristique génétique universel pour la quantification de cellules tumorales. Cependant, avec l'avance d'aujourd'hui dans le séquençage du génome entier, les gènes et les régions les plus fréquemment modifiés sont connus pour les tumeurs communes. Par exemple, parmi la tête et du coutumeurs, 71%, 23% et 22% ont des mutations dans le TP53, FAT1 et gènes CDKN2A, et 60%, 34% et 26% ont des délétions dans les régions de gènes de CDKN2A, STK11 et PTEN, respectivement 10. Criblage de 5 à 10 ces gènes et / ou des régions au moyen d'un séquençage ciblé et / ou une PCR numérique risque donc d'identifier une ou plusieurs altérations génétiques qui peuvent être utilisées pour la quantification de cellules tumorales dans la culture primaire dérivée. Une autre limite est la quantité souvent insuffisante des tumeurs réséquées pour la mise en place des cultures primaires.
Malgré les caractéristiques avantageuses et le potentiel d'application prometteuse du genetic- et dans l' outil vitro à base de cellules, ses limites doivent être gardés à l' esprit et sa nature in vitro doit être soulignée. Par exemple, les effets différentiels ou de la cytotoxicité d'un médicament sur les cellules tumorales peuvent plutôt due à la différence dans les types de cellules (fibroblastes par rapport aux cellules de Schwann) ou de leurorigines différentes (à partir de différents individus). L'effet plus fort d'un médicament sur les cellules tumorales que sur des cellules non tumorales peut également être expliquée par le fait que le premier croître plus vite que ce dernier. Plus important encore , les cellules dans le comportement in vitro diffère que les cellules dans le corps humain et par conséquent, les résultats d' une évaluation in vitro font souvent pas ou seulement partiellement le reflet de la situation clinique réelle. Par conséquent, l'efficacité et la spécificité cytotoxicité des médicaments obtenus pour les cellules en culture sont plutôt de nature biomarqueur mais ne possèdent pas la fiabilité de l'efficacité préclinique mesurée des antibiotiques. Néanmoins, le déplacement de lignées cellulaires à des cultures mixtes et / ou des cultures primaires est un pas en avant dans l' évaluation des médicaments à effet et la spécificité / sélectivité in vitro. Avec des efforts considérables, dans des conditions in vitro peut être trouvée qui permet une corrélation raisonnable des données in vitro avec des réponses réelles des patients, au moins pour certains médicaments.
Acknowledgments
Mme Alster, M. Honrath et le Dr Jiang sont appréciés pour leur assistance technique exceptionnelle. Aussi apprécié est le Dr Volz et le groupe de recherche du Dr Dandri pour fournir l'accès à leur appareil PCR numérique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | For drop-dialysis |
| ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
| ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
| Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
| Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
| Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
| Pierceble foil | BioRad | 181-4040 |
References
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