Introduction
Die Fähigkeit , genetische und biochemische Ansätze zu kombinieren , hat Drosophila einen besonders geeigneten Organismus für Biochemie und Molekularbiologie Studien 1-3. Diese Studien erfordern oft große Mengen an biologischem Material, nicht nur von erwachsenen Fliegen, sondern auch von Larven 4, 5 und pupae Embryonen 6-8. Zur Gewinnung großer Mengen von Material, haben Forscher kultivierten Fliegen mit großen Behältern bekannt als fliegen "Bevölkerung Käfige". Diese Käfige bestehen aus einem Zylinder aus Kunststoff mit einem Netz auf beiden Seiten überzogen ist, die Einführung des Lebensmittels im Inneren des Käfigs zu ermöglichen, ohne das entweichende Fliegen. Diese Käfige können von einem Unternehmen selbst gemachte 9-11 oder gekauft werden (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Ausrüstung).
Ein großer Vorteil dieses System der Verwendung einer großen Anzahl von Fliegen zu wachsen , ist , dass der Zyklus der Frucht 12 in einer Weise gesteuert werden kann fliegen , die alle Fliegen in einem Wieder entwickelnlativ synchronisiert. Diese Synchronisation wird durch Impfen neue Embryonen erreicht, Fütterung Larven / Fliegen und die erwachsenen Fliegen in genauen Zeiten zu opfern. Eine synchronisierte Fliegenpopulation unter Verwendung ist besonders nützlich für Entwicklungsstudien 13.
Der Beginn einer neuen Population Käfig von einigen Fliegen ist ein zeitraubender Vorgang erfordert viele Amplifikationszyklen 9-11. mit größeren Behältern wie Fliegenkulturflaschen oder minicages Auch kann der gesamte Prozess für Monate dauern. Aufwendige Arbeitsschritt pflegen viele Drosophila Laboratorien regelmäßig solche Käfige Um diese Zeit zu vermeiden. Es ist sehr bequem, einen neuen Käfig aus einem Embryo Sammlung von einem bereits etablierten Bevölkerung Käfig beginnen zu starten. In der Regel halten die meisten Labors Wildtyp- Bevölkerung Käfigen, wie Oregon R oder Kanton S. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Protokoll Fliegenpopulation Käfigen zu halten.
Protocol
1. Starten des Zyklus: Seeding Embry
HINWEIS: Der Zyklus beginnt mit 1,5 g gesammelte Material (ein Gemisch aus Embryonen und / oder einem Eilarven) aus dem vorherigen Zyklus. (Siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Geräte) mit einer aktiven Hefemischung bis pupal Phase Dieses Material wird in einen Plastikbehälter gegeben werden. Der Behälter wird nach dem Einbringen des biologischen Mischung von Embryonen und Larven, die mit dem Deckel der Larven zu verhindern geschlossen entweichen. Es ist notwendig, Löcher in den Deckel zu machen, um die Luftzirkulation zu ermöglichen. mit Larven Flucht durch die Löcher, Schaumstöpsel verwendet werden, zu vermeiden. Schließlich wird empfohlen, Handschuhe und Laborkittel zu tragen, nicht nur in diesem Bereich, sondern auch im gesamten Protokoll, zu vermeiden, verschmutzt oder Färbung Kleidung mit Bleichmittel zu bekommen.
- Stellen Sie den Kunststoffbehälter auf.
- Machen Sie drei quadratische Löcher mit einer Rasierklinge in der Kunststoffbehälterdeckel einespproximately 2,2 cm. In Band (3/4 Zoll Etikettenband) auf die vier Ecken jedes Loch einen festen Sitz für den Schaumstoffstöpsel, um sicherzustellen, (50 x 55 mm, DXL) und legen dann ein Schaum Stecker in jedem Loch.
- Decken Sie die Innenseite des Kunststoffbehälters mit Plastikfolie. Über diesen Film, eine Schicht aus Baumwolle fügen Sie den Boden des Kunststoffbehälters abzudecken. Reißen Sie die Baumwolle mit den Fingern.
- Bereiten Sie die Fliege Essen.
- Hinzufügen 333 ml deionisiertem Wasser in einem 500 ml Becherglas gegeben. Während das Becherglas mit einem Magnetstab gerührt wurde, 167 & mgr; l Propionsäure und 1,08 ml Phosphorsäure hinzufügen, aus den Stammlösungen (99,96% und 85%, respectively).
- Langsam 77,5 g Trockenhefe hinzufügen, große Klumpen zu vermeiden. Nach der Trockenhefe Auflösen hinzufügen 38,8 g Saccharose.
HINWEIS: Saccharose sollte die letzte Zutat hinzugefügt werden, da unmittelbar nach dieser Komponente hinzufügen, wird Gärung beginnen.
- Unmittelbar nach der Saccharose aufzulösen, gießen Sie dieLebensmittel über die Baumwolle, und stellen Sie sicher, dass die Baumwolle gleichmäßig zu bedecken. Schließen Sie den Kunststoffbehälter mit dem Deckel entkam Fliegen im Labor zu vermeiden, dass die Lebensmittel verunreinigen.
- Resuspendieren 1,5 g der geernteten Embryos (nicht dechorionated) aus dem vorherigen Zyklus mit 5 ml 70% Ethanol. Cut in Hälfte zwei Filterpapiere und die biologische Mischung gleichmäßig über die vier Stücke verteilen mit einem Spatel oder einem Transferpipette mit einer breiten Spitze (schneiden, wenn nötig). Legen Sie die Filterpapiere auf dem getränkten Watte und schließen Sie den Deckel. Schließlich brüten die Kunststoffbehälter bei RT (24 ° C) und Luftfeuchtigkeit (35%) bis zum Puppenstadium.
HINWEIS: Der Kunststoffbehälter nicht in eine feuchte Kammer gestellt werden soll, andernfalls wird das Wachstum von Bakterien zu fördern.
2. Fortsetzung des Zyklus: Von Embryonen zu Flies.
HINWEIS: Dieser Teil des Zyklus geht aus den platzierten Embryonen in den Kunststoffbehälter am Tag 1 bis 9 Tage später, wenn die adulte Fliegen entstehen wirdaus den Puppen. Während dieser 8 Tagen wurde nichts getan werden , aber die Überwachung , dass die Embryonen in die nächsten Phasen des Lebenszyklus von Drosophila bis Schlüpfen richtig voran. Wenn Larven beginnen zu sterben und schwarz während dieser Zeit drehen, überprüfen Sie, dass die Schaumstoffstöpsel nicht zu eng und dass eine ausreichende Belüftung gewährleistet ist. Diese Frist ist eine gute Zeit, um die Fliegenpopulation Käfig aus dem vorherigen Zyklus zu reinigen.
- Beachten Sie die Embryonen werden 1. Larvenstadium etwa 24 Stunden nach der erwachsenen weiblichen sie in die Fliege Nahrung abgelagert (siehe Schritt 3). Die sich ergebende Larven werden aus der Fliege Nahrung in Schritt 1 innerhalb von 4 Tagen vorbereitet ernähren, wachsen und zweimal in 2. und 3. Larvenstadium der Häutung.
- Reinigen Sie die Fliegenpopulation Käfig.
- Setzen Sie den Käfig bei 4 ° C für mindestens 30 Minuten, um die Aktivität der Fliegen zu verlangsamen. Entfernen Sie das Netz, das eine Seite des Käfigs abdeckt, und mit einer schnellen Bewegung, die Kappe die offene Seite mit einem großen Biohazard KunststoffTasche. Gießen Sie den Inhalt des Käfigs in die Tasche.
- Mit dem Biohazard-Beutel noch eine Seite des Käfigs abdeckt, positionieren Sie den Käfig vertikal über einem Waschbecken mit der Tasche Biohazard Seite nach unten. Entfernen Sie vorsichtig den Plastikbeutel zu verhindern Fliegen entkommen und entsorgen Sie sie in einem Biohazard Abfallbehälter.
- Sie vorsichtig das obere Netz öffnen genug, um ein kleines Loch zu schaffen, um das Innere des Käfigs mit Wasser spülen, die die Fliegen in die Spüle waschen. Erhöhen Sie langsam die Größe des Lochs und beseitigen alle Fliegen in den Käfig.
- Reinigen Sie den Käfig und beide Netze mit Wasser und Seife. Während die Netze noch feucht sind sichern sie auf beiden Seiten des trockenen, sauberen Käfig, und schließlich in einem Labor Soaker Papier zu bringen, die die Kunststofffolie in Schritt 1.1.2 vom Kleben an den Käfig vorbereitet wird verhindern. Jetzt ist der Käfig für den nächsten Zyklus.
- Vier Tage nach der Ersteinrichtung, beobachten die Larven verpuppen. Die Larven werden für 4 Tage in diesem Zustand bleiben.
HINWEIS: Dährend dieser Phase die Puppen ausge wird die gesamte Baumwolle Fläche im Inneren des Kunststoffbehälters abzudecken. - Während der pupal Phase und bevor die ersten Fliegen entstehen, öffnen Sie die Kunststoff-Behälter und legen Sie die Kunststoff-Folie, die Baumwolle mit all den Puppen über den Labor Soaker Papier innerhalb des Rein Bevölkerung Käfig enthält. Schließen Sie das Netz mit einem doppelten Knoten und reinigen Sie den Kunststoffbehälter und den Deckel für den nächsten Zyklus.
HINWEIS: Pupae an dem Deckel befestigt ist durch Autoklavieren oder Gefrieren vor Schlüpfen verworfen und zerstört werden.
3. adulte Fliegen.
HINWEIS: Nach den 4 Tagen der Puppe die ersten Fliegen Stufe wird aus den Puppen entstehen. Innerhalb 24 - 48 Stunden sollten alle Fliegen geschlüpften haben. In diesem Teil des Zyklus, ist es wichtig, dass sie Lebensmittel mit dem Ziel, die Schaffung der richtigen Umgebung für die Wiedergabe zur Verfügung zu stellen.
- Bereiten Sie die Melasse Tabletts.
- Kombinieren in einem 1 - L - Kolben 556,25 ml deionisiertes H 2 O, 90 ml Melasse und 22 g Agar. Autoklav mit einem Rührstab für 30 Minuten, cool und 9,25 ml 10% Tegosept EtOH in 95% hinzufügen.
- Gießen Sie die Mischung in eine Fleischschale von 21 x 14,5 cm. Stellen Sie sicher, dass das Volumen genug ist 15 abzudecken - 17 Tabletts. Warten 10 - 20 min zum Verfestigen und jedes Fach mit einer Kunststoffolie abzudecken Austrocknen zu verhindern. Mehrere Kolben von 1 l können zur gleichen Zeit hergestellt werden. Lagern Sie die Melasse Tabletts bei 4 ºC in Plastik verpackt, bis sie benötigt.
- Fügen Sie eine Melasse Tablett mit nassen Hefe in den Käfig mit den erwachsenen Fliegen bedeckt.
- Bevor die Platte hinzufügen, legen Sie den Käfig bei 4 ° C im Kühlraum für 30 min.
- In 200 ml VE - H 2 O in einen Becher und langsam Trockenhefe gießen , während sie mit einem Löffel gerührt wurde. Stoppen Sie das Hinzufügen Trockenhefe, wenn die Mischung etwa die Konsistenz von Erdnussbutter wird zu verhindern, dass Fliegen in der Nahrung stecken zu bleiben.
HINWEIS: Es ist wichtig, nicht das Essen Lösung zu ermöglichen, sich zu verfestigen sonst wird es sehr schwierig sein, zu deckendie Melasse Tablett und die Eier während des Ernteprozesses extrahieren (siehe Abschnitt 4.3). - Entfernen Sie die Kunststofffolie von einer Melasse Tablett und decken Sie es mit einer Schicht aus dem frischen nassen Hefe bereit, einen Löffel oder Spachtel. Achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist.
- Während der Käfig noch im Kühlraum ist, öffnen Sie das Netz und sorgfältig die Melasse Tablett mit nassen Hefe in den Käfig hinzufügen. Schließen Sie das Netz und legen Sie den Käfig bei RT.
HINWEIS: Es kann nützlich sein beim Einsetzen der Platte mit einer leeren Fleischschale zu decken, aber sicher sein, nicht den Zugang der Fliegen zum Melasse Tablett zu blockieren.
- Ändern Sie die Nahrungsmittelplatte alle 24 bis 48 Stunden um die Hefe zu vermeiden, zu trocknen. Erwachsenen Fliegen sind sehr empfindlich gegen Austrocknung.
4. Ende des Zyklus: Ernten der Embry
HINWEIS: Die besten Fliegen Fruchtbarkeit ist 3 - 5 Tage nach dem Schlüpfen. Daher Ernte in dieser Zeit die beste Embryo Ausbeute erhalten. Nach Wunsch Sammlungen sind completed, ist der Zyklus beendet. Die Fliegen sollte geopfert werden, und der Käfig, wie in Schritt 2.2 gereinigt spezifiziert.
- Typischerweise einführen, 2 Tage nach dem Schlüpfen fliegen, eine neue Melasse mit frischem Nassfutter in den Käfig Tablett, wie in Abschnitt 3.2.5 erläutert. Um die Ausbeute an Eiern Abscheidung, mit Hilfe der Finger zu erhöhen, bilden die Oberfläche der nassen Hefe als irreguläre wie möglich. Wenn eine alte Nahrungsmittelbehälter in den Käfig ist, bevor Sie die neue Platte hinzufügen, entfernen Sie sie vorsichtig und entsorgen Sie sie in einen Biohazard Tasche. Eine andere Spitze, die Ausbeute zu erhöhen ist, die Baumwollschicht zu entfernen, um alle Eier werden in der Nahrungs verlegt werden. Pflegen Sie den Käfig bei RT.
- Beachten Sie die Embryonen als kleine weiße Punkte.
HINWEIS: Die Eier sind bereit, gesammelt werden. Für Routinewartung des Fliegen Käfig, 2 Tage Sammlung ist die empfohlene Zeit. Diese Sammlung wird meist enthalten Embryonen und wenige 1. Larvenstadium. Siehe repräsentative Ergebnisse für typische Ausbeuten von geernteten Embryonen für verschiedene collection Zeitpunkten. - Ernten Sie die Embryonen
- Setzen Sie den Käfig in den Kühlraum für ca. 30 min. In der Zwischenzeit den Kunststoffbehälter und die Fliege Nahrung für den nächsten Zyklus vorzubereiten, wie in Kapitel 1 beschrieben.
- In einem 8 l-Autoklaven Fach ein Wasser der Gesamtkapazität auf ¼ und dann 1 ml 10% Triton X-100 hinzufügen. Während der Käfig entfernen im Kühlraum ist sorgfältig die Melasse Platte und legen Sie sie in einem Biohazard Tasche.
- Entfernen Sie die Schale aus dem Beutel und unterzutauchen es schnell (zu verhindern Fliegen entweichen) in der Detergenslösung in den Autoklaven Fach. Schließen Sie die BIOHAZARD Beutel und in einen Behälter für biologischen. Flies wird nicht ertrinken in Wasser, das kein Waschmittel enthält.
- Verwenden Sie eine große Pinsel und destilliertes Wasser Pistole Embryonen und Hefe zu waschen von Melasse. Entsorgen Sie Platten und Melasse in Biohazard Feld.
- Gießen Lösung vorsichtig durch ein Sieb drei Satz (gröbste Sieb 30 auf der Oberseite, 40 in der Mitte und 100 auf der Unterseite). Wash Klumpen on Top-Level mit destilliertem Wasser Pistole, bis keine Klumpen bleiben.
HINWEIS: Die erwachsenen Fliegen und 3. Larvenstadium wird in dem Sieb 30 zurückgehalten werden.- Spülen Sie den Autoklaven Tablett mit destilliertem Wasser und gießen Sie das Spülwasser durch die Siebe. Entfernen Sie die obere Sieb und wiederholen Sie den Vorgang, wenn Hefe Klumpen bleiben. Die meisten der 1. und all der 2. Larvenstadium werden in dem Sieb 40 bleiben.
- Nehmen Sie das zweite Sieb. Das gelbliche Material in der dritten (unten) Sieb ist die Mischung von Embryonen und Klein 1. Larvenstadium. Verwenden Sie destilliertes Wasser Pistole alle Eier auf einer Seite des Siebes zu bewegen. Sammeln Sie sie mit einem Spatel und gewogen.
- Während dieser Zyklen die Sammlung Ausbeute von Embryonen / Larven im Bereich zwischen 7 und 13 g. Verwenden Sie nur 1,5 g dieses Materials einen neuen Zyklus (Abschnitt 1) zu starten. Verwenden Sie den Rest der Embryonen für die weitere Verarbeitung oder verworfen werden.
5. WeitereVerarbeitung
HINWEIS: Die Embryonen für die Fortsetzung der Bevölkerung nicht genutzt werden können sofort für Experimente verwendet werden, oder alternativ kann bei -80 ° C eingefroren werden. Für beide Optionen, müssen die Embryonen zunächst dechorionated werden.
- Für dechorionation, waschen Sie die Embryonen für 2 Minuten in 50% Bleichlösung und gründlich mit destilliertem Wasser.
- Zum Einfrieren der Embryonen, zunächst trocken, indem Sie fest mit einem Papiertuch drücken, und dann wiegen und legen Sie sie mit Hilfe eines Spachtels, in einen 15 oder 50 ml konischen Röhrchen. Schließlich tauchen die konische Röhre in flüssigem N 2 für einige Sekunden.
Representative Results
Die Aufrechterhaltung einer Bevölkerung Fliegenkäfig im Fluge seines Lebenszyklus. Deshalb wird nach der anfänglichen biologischen Mischung von Embryonen und Larven in den Kunststoffbehälter (Abbildung 1A) platzieren die befruchteten Eier Larven in nicht mehr als 2 Tage werden wird und die Larven werden 4 Tage lang wachsen, relativ durch die verschiedenen Larvenstadien synchronisiert ( siehe Abbildung 1B).
Nachdem die Larven des 3. Larvenstadium Larvenstadium abgeschlossen haben , werden sie die Oberfläche der Baumwolle im Inneren des Kunststoffbehälters mit einigen auf der inneren Oberfläche des Deckels (1C) verpuppen und abzudecken. Diese Verpuppung Zeitraum wird für die nächsten 4 Tage vergehen, bis die Fliegen die Metamorphose Prozess beenden. Während dieser Zeit wird dringend empfohlen, die Fliegen in den Käfig zu übertragen. Die ersten erwachsenen Fliegen beginnt am Tag 9 schlüpfen - 10 nach demEinleitung des Zyklus (Figur 1D) und bis zum Tag 11 alle von ihnen werden aus den Puppen entstanden.
Die beste Ausbeute der Embryonen Sammlung 3 erhalten - 5 Tage nach dem Schlüpfen (Tag 13 bis 15) und schließlich sinkt in Tag 17 (7 Tage nach dem Schlüpfen). Daher ist es empfehlenswert , die letzte Tablett mit frischen Lebensmitteln am Tag 13 und sammeln die Eier am Tag 15 (Abbildung 1E und F) hinzuzufügen. Dies wird Sammlung der maximalen Anzahl von Embryonen. Das Hinzufügen eines dritten zusätzlichen Tag , bevor sie in das Essen zu trocken und damit die Ausbeute an gesammelten Embryonen verringern können die Folge zu sammeln. Die Tabelle 1 zeigt die Ausbeute an 6 aufeinander folgenden Zyklus Sammlungen, mit einem Ausgangsmaterial von 1,5 g in jedem Zyklus, und Abbildung 2 ist die für einen ganzen Zyklus Sammlung empfohlenen Zeitplan.
Das Material wird in 2 Tage geerntet60; Perioden besteht hauptsächlich aus Embryonen zusammen. Jedoch eine kleine Anzahl von Larven sind ebenfalls vorhanden. Käfig für Wartungszwecke sind diese Larven kein Problem, da ein gewisser Grad an Asynchronität erwartet wird. Dennoch für einige biochemische Experimente ist die Reinheit dieser Embryonen sehr wichtig, aber gleichzeitig ist es auch große Mengen an Eiern zu sammeln notwendig, diese Experimente durchzuführen. Aus diesem Grund ist bei 1 h und 3 h durchgeführt wird , mehrere kurze aufeinanderfolgenden Sammlungen wurden nach dem bei RT schnell das Hinzufügen einer neuen Platte mit Nahrung, eine Schätzung der Ausbeute und Reinheit bereitzustellen , die mit diesem Verfahren (Tabelle 2 und Abbildung 3) erhalten werden kann , . Die 1 Stunde aufeinander folgenden Sammlungen begann mit einer sehr geringen Ausbeute (14,5 mg), aber dann die Mengen von Embryonen für jedes Mal erhöht gesammelt, aber das letzte Mal. Die geringe Ausbeute zunächst zurückgeführt werden kann, um die Fliegen während des Prozesses der Änderung der Lebensmittel, sondern später acclimating betont wird. Auf der anderen Seite, keine larvae wurden in den fünf aufeinanderfolgenden Sammlungen (3A) beobachtet, was zeigt , dass kürzere Sammlungen höherer Reinheit erhalten. Wenn Baumwolle nicht aus dem Käfig entfernt wird, wird die Wahrscheinlichkeit, dass aus früheren Zeitpunkten Larven bleiben und geben Sie die frische Platte erhöht wird. Selbst wenn Baumwolle entfernt wird, manchmal wird Larven auf der Seite des Käfigs wandern und das Essen während einer Sammlung ein.
Für die 3 h aufeinander folgenden Sammlungen lag die Ausbeute von 840 bis 1250 mg, die etwa 10-mal mehr als die Erträge in den 1 Std Sammlungen erhalten. Die Reinheit dieser Embryos war in der Nähe von 100% (3B). Gelegentliche Larven beobachtet. Einige Entwicklungsstudien erfordern eine sehr strenge Synchronisation für die gesammelten Embryonen. Um die Synchronisation Reinheit zu erhöhen, ist es empfehlenswert, die erste Sammelplatte zu verwerfen, weil, wenn die Bedingungen nicht ideal sind, können Frauen reifer Eier behalten und deponieren diem, wenn die Bedingungen, beispielsweise unter Einführung einer frischen Platte verbessern. Auch ist es wichtig zu wissen, dass ältere adulte Fliegen (> 6 Tage) produzieren weniger synchronisiert Embryonen. Um den Grad der Synchronisation mit hoher Genauigkeit, eine DAPI-Färbung der gesammelten Embryos verifizieren empfohlen.
Abbildung 1. Die Drosophila melanogaster Lebenszyklus in einem Fliegenpopulation Cage. (A) Die Einleitung des Zyklus Impfen 1,5 g Embryonen in die Kunststoff - Box - Container. Als Referenz ist in der unteren Platte, wobei die Länge des Filterpapiers 8,5 cm. (B) Larven wachsen relativ 5 Tage nach dem Beginn des Zyklus synchronisiert. (C) Am Tag 8, sind die meisten der Fliegen im Puppenstadium. Die unteren Platten in B (B ') und C (C ') sind Vergrößerungen der angegebenen Bereiche in den oberen Platten. (D) Erwachsene geschlüpften Fliegen aus den Puppen von 10 Tagen nach Zyklus Initiation. (E) Erwachsene fliegt in der Bevölkerung Käfig , bevor der Prozess des Sammelns der Embryonen beginnen, am Tag 15. Die gelbliche Material on the fly Lebensmittel sind befruchtete Eier. (F) Embry (und ein paar Larven) am unteren Rand des 100 gröbste Sieb gesammelt, nach einem ganzen Käfig Zyklus. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. gesamten Zyklus Sammlung Spielplan. Abbildung 2 zeigt den empfohlenen Zeitplan für einen vollständigen Zyklus Sammlung. t = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Reinheit von 1 Stunde und 3 Stunden aufeinander folgenden Sammlungen. Repräsentative Bild von Embryonen in 1 Stunde (A) und 3 Stunden (B) gesammelt , nachdem ein neues Tablett mit Essen hinzufügen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zyklusnummer | Ausbeute (g) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
| Sammlung # | Länge der Sammlung (hr) | Ausbeute (mg) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160,1 |
| 5 | 1 | 106,1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
Tabelle 2. Ausbeute von 1 Stunde und 3 Stunden konsekutiv Sammlungen. Tabelle 2 zeigt die Ausbeute an 5 aufeinander folgenden Sammlungen 1 Stunde nach Hinzufügen neuer Nahrungsmittel und 3 aufeinander folgenden Sammlungen 3 Stunden nach einer neuen Melasse Platte platzieren.
Discussion
Ausgehend von 1,5 g des Materials kann man eine Ausbeute von gesammelten Embryos zwischen 7 und 13 g pro Zyklus erhalten. Um eine solche Menge an Material, ist es entscheidend, die richtige Züchtungsbedingungen für alle Phasen der Flugzyklus aufrechtzuerhalten.
Die wichtigsten Parameter sind die Temperatur und die Feuchtigkeit, die jeweils 24 ºC und 35% liegen. Wenn diese beiden Parameter nicht konstant gehalten werden in der normalen Umgebung des Labors, wäre eine Möglichkeit, den Flugkäfig in einen Inkubator oder einer Klimakammer zu platzieren. Andere Protokolle empfehlen 70% Luftfeuchtigkeit und auch eine konstante 24 Stunden Licht-Dunkel - Zyklus , die Ausbeute der produzierten Eier 9,10 zu erhöhen. Allerdings halten vermeidet die Feuchtigkeit um 35% bakterielle Kontamination, und da der Zweck dieses Protokolls nur die Aufrechterhaltung einer Bevölkerung Käfig ist, werden die Fliegen in der normalen Licht Umgebung des Labors gehalten.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist, di zu haltensturbances dem Erwachsenen fliegt so niedrig wie möglich. Es kann ratsam sein, den Käfig in einer Position getrennt von der Fliegenraum zu halten, um Kreuzkontamination von anderen entfernt zu vermeiden.
Die Züchtung von großen Populationen von transgenen und mutierten Fliegen wird nicht empfohlen, da es sehr schwierig ist , ihre Reinheit zu erhalten , und sie können in großen Bevölkerungs Käfige 14 ausgeprägte abnormal Paarungsverhalten aufweisen.
Ein mögliches Problem bei der Drosophila Kultivierung in großen Mengen ist das Vorhandensein von anderen Organismen wie Milben und / oder Form, die für die Lebensmittel konkurrieren und damit die Ausbeute der produzierten Eier zu reduzieren. Um dies zu vermeiden, ist es sehr wichtig, alle Geräte sauber zu halten, Waschen Sie den Käfig, Netze und Fliegenboxen mit Wasser und Seife, und Verwerfen des Einwegmaterial (Schaumstöpsel) nach jedem Zyklus. Zur Verringerung der Schimmel wächst, Propionsäure und Phosphorsäure in die nasse Hefe hinzugefügt, wenn die Fliege Essen in Schritt Vorbereitung1.2 und Tegosept wenn die Melasse Tablett 3.1 in Schritt vorbereitet. Es ist manchmal hilfreich, um Platz Materialien wie die Kunststoff-Box oder Siebe in -20 ° C, wenn die Zeit knapp ist und Materialien können nicht sofort gereinigt werden.
Eine ganze Sammlung Zyklus tritt in 14 - 15 Tagen beginnen, wenn die Embryonen in die Fliegenkasten ausgesät werden und mit der letzten Sammlung Tag endet. Während dieser Zeit ist es empfehlenswert , einen Zeitplan zu organisieren , um alle notwendigen Schritte für die Erhaltung einer Population Fliegen Käfig zu erinnern (Abb. 2), detailliert im Abschnitt Protokoll. Von dem Tag an, dass die Eier werden ausgesät, bis die erwachsenen Fliegen entstehen, ist es notwendig, nur die Kunststoff-Box zu kontrollieren, und wenn der Verpuppung erfolgt, so dass sie in den Käfig zu setzen. Danach müssen die Fliegen alle 2 gefüttert - 3 Tage bis Embryonen für einen neuen Zyklus ausgesät werden. In der gesamten Protokoll ist der längste Tag während des Sammelns und Aussaat der Embryonen für einen neuen Zyklus zu starten. EINs im Protokoll kommentiert, ist die beste Ei Ertrag 3 - 5 Tage nach dem Schlüpfen Erwachsenen und schließlich sinkt 2 Tage später. Das gibt uns eine gewisse Flexibilität, um den Tag, an dem die Ernte der Eier durchgeführt werden, um zu wählen.
Wenn aus irgendeinem Grund ist die Ausbeute an gesammelten Embryonen weniger als die gewünschte Ausgangsbetrag (1,5 g), immer kann man eine neue Melasse Tablett hinzuzufügen und mehr Eier am nächsten Tag zu sammeln. Für konstante Sammlungen, wird empfohlen, 2 Käfige in parallel zu halten und, wenn höhere Mengen an Embryonen erforderlich sind, ist es auch möglich, größere Käfige zu verwenden. Bei kurzer Zeit Sammlungen zu tun, ist eine Möglichkeit, um die Ausbeute zu erhöhen Vorteil der Eiablage Burst am Morgen zu nehmen.
Es gibt viele Vorteile von großen Mengen von verschiedenen Entwicklungsstadien zu sammeln. Zum Beispiel gesammelt Embryonen aus Bevölkerung Käfigen wurden sehr erfolgreich in Immunpräzipitationstests 6-8, Masse collectio verwendetn der Larvengewebe von dissoziierten Larven hat gezeigt , 15 eine sehr gute Quelle für 3C Experimente 4 und RNA - Präparationen zu sein, und Köpfe von erwachsenen Fliegen wurden für ChIP Experimente 16 verwendet. Zusätzlich werden Erwachsenen häufig benötigt fly Extrakte für die Gewebekultur 17 zu machen.
Eine der vielversprechendsten Anwendungen der Käfig Material für Hochdurchsatz-Assays zur Verfügung zu stellen, die die Analyse und das Screening von Genen, Transkripten, Proteinen und Stoffwechselprodukten in Reaktion auf die Exposition von Pathogenen, biologischen Molekülen, chemischen Substanzen und ionisierender Strahlung ermöglichen. In diesen großen Assays eine große Anzahl von Personen erforderlich sind, und der Käfig Fliegenpopulation beschrieben hier kann sehr hilfreich sein , um große Mengen des Materials 18 während der verschiedenen Phasen des Drosophila - Lebenszyklus für ihre Analyse und Screening zu erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. Oxford. 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Drosophila RNAi Screening Center [Internet]. , Available from: http://www.flyrnai.org/DRSC-PRC.html (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
