Introduction
आनुवंशिक और जैव रासायनिक दृष्टिकोण गठबंधन करने की क्षमता ड्रोसोफिला जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से उपयुक्त 1-3 जीव बना दिया है। इन अध्ययनों से अक्सर न केवल वयस्क मक्खियों से, लेकिन यह भी लार्वा 4, 5 pupae और भ्रूण 6-8 से जैविक सामग्री की बड़ी मात्रा में आवश्यकता होती है। सामग्री की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं ने बड़ी मक्खी "जनसंख्या पिंजरों" के रूप में जाना जाता है कंटेनरों का उपयोग सुसंस्कृत मक्खियों की है। इन पिंजरों दोनों पक्षों पर एक शुद्ध द्वारा कवर मक्खियों से बचने के बिना पिंजरे के अंदर भोजन की शुरूआत अनुमति देने के लिए प्लास्टिक का बना एक सिलेंडर से मिलकर बनता है। इन पिंजरों घर का बना 9-11 या (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) एक कंपनी से खरीदा जा सकता है।
मक्खियों की बड़ी संख्या को विकसित करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि फल के चक्र से उड़ान भरने के 12 एक तरीका है कि सब मक्खियों एक फिर से विकसित में नियंत्रित किया जा सकता हैlatively ढंग सिंक्रनाइज़। इस तुल्यकालन नई भ्रूण बोने, लार्वा / मक्खियों खिलाने और सटीक समय पर वयस्क मक्खियों का त्याग करके हासिल की है। एक तुल्यकालन मक्खी आबादी का प्रयोग विकासात्मक अध्ययन 13 के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
कुछ मक्खियों से एक नई आबादी पिंजरे के शुरू होने से एक समय लेने वाली प्रक्रिया प्रवर्धन 9-11 के कई चक्रों की आवश्यकता होती है। भी उड़ संस्कृति की बोतलें या minicages जैसे बड़े कंटेनरों का उपयोग, पूरी प्रक्रिया महीनों के लिए पिछले कर सकते हैं। इस समय लेने कदम से बचने के लिए, कई ड्रोसोफिला प्रयोगशालाओं नियमित रूप से इस तरह के पिंजरों बनाए रखें। यह सबसे अधिक एक नया पिंजरे एक पहले से ही स्थापित जनसंख्या पिंजरे से एक भ्रूण संग्रह से शुरू शुरू करने के लिए सुविधाजनक है। सामान्य में, सबसे प्रयोगशालाओं में इस तरह के ओरेगन आर या गुआंगज़ौ एस के रूप में wildtype जनसंख्या पिंजरों, बनाए रखने के लिए इस पांडुलिपि मक्खी जनसंख्या पिंजरों बनाए रखने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।
Protocol
1. चक्र शुरू: सीडिंग भ्रूण
नोट: चक्र पिछले चक्र से एकत्र सामग्री के 1.5 ग्राम (भ्रूण और / या कुछ पहले instar लार्वा से बना एक मिश्रण) के साथ शुरू होता है। इस सामग्री को पोटा संबंधी चरण तक एक सक्रिय खमीर मिश्रण के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) में रखा जाएगा। कंटेनर ढक्कन लार्वा से बचने के लिए अनुमति देने से बचने के लिए के साथ भ्रूण की जैविक मिश्रण और लार्वा की शुरूआत के बाद बंद कर दिया जाएगा। यह आदेश हवा परिसंचरण अनुमति देने के लिए ढक्कन में छेद बनाने के लिए आवश्यक है। छेद के माध्यम से लार्वा भागने होने से बचने के लिए, फोम प्लग का इस्तेमाल किया जाता है। अंत में, यह इस खंड में बल्कि पूरे प्रोटोकॉल में न केवल दस्ताने और प्रयोगशाला कोट, पहनने के लिए, ब्लीच के साथ गंदा या धुंधला कपड़े लेने से बचने के लिए सिफारिश की है।
- प्लास्टिक के कंटेनर सेट करें।
- एक की प्लास्टिक कंटेनर ढक्कन में एक धार के साथ तीन वर्ग छेद बनाओ2.2 सेमी pproximately। टेप (3/4 इंच लेबलिंग टेप) प्रत्येक छेद के चारों कोनों में जोड़े फोम प्लग (50 x 55 मिमी, DXL) के लिए एक तंग फिट सुनिश्चित करने के लिए, और उसके बाद प्रत्येक छेद में एक फोम प्लग जगह है।
- प्लास्टिक की चादर के साथ प्लास्टिक के कंटेनर के अंदर कवर। इस फिल्म के साथ, प्लास्टिक कंटेनर के नीचे कवर करने के लिए कपास की एक परत जोड़ें। अपनी उंगलियों के साथ कपास आंसू।
- मक्खी भोजन तैयार करें।
- एक 500 मिलीलीटर बीकर में विआयनीकृत पानी की 333 मिलीलीटर जोड़ें। एक चुंबकीय पट्टी के साथ बीकर सरगर्मी, वहीं शेयर समाधान (99.96% और 85%, क्रमशः) से, propionic एसिड के 167 μl और फॉस्फोरिक एसिड के 1.08 मिलीलीटर जोड़ें।
- धीरे-धीरे सक्रिय सूखी खमीर के 77.5 ग्राम जोड़ने के लिए, बड़े गुच्छों से परहेज। सूखी खमीर भंग करने के बाद, सूक्रोज की 38.8 ग्राम जोड़ें।
नोट: सुक्रोज पिछले घटक जोड़ा जा करने के लिए किया जाना चाहिए, क्योंकि तुरंत इस घटक को जोड़ने के बाद, किण्वन शुरू हो जाएगा।
- इसके तत्काल बाद सुक्रोज भंग करने के बाद, डालनाकपास से अधिक भोजन, और समान रूप से कपास कवर करने के लिए सुनिश्चित करें। ढक्कन के साथ प्लास्टिक के कंटेनर बंद प्रयोगशाला भोजन दूषित भीतर बच मक्खियों से बचने के लिए।
- 70% इथेनॉल के 5 मिलीलीटर के साथ पिछले चक्र से काटा भ्रूण (नहीं dechorionated) के 1.5 ग्राम Resuspend। आधा दो फिल्टर अखबारों में कटौती और एक रंग या एक विस्तृत टिप के साथ एक हस्तांतरण pipet का उपयोग 4 टुकड़े पर समान रूप से जैविक मिश्रण वितरित (यदि आवश्यक हो) में कटौती। लथपथ कपास के शीर्ष पर फिल्टर कागजात निर्धारित करना और ढक्कन बंद करें। अंत में, आर टी (24ºC) पर प्लास्टिक के कंटेनर और प्यूपा अवस्था तक आर्द्रता (35%) सेते हैं।
ध्यान दें: प्लास्टिक के कंटेनर एक नम कक्ष में नहीं रखा जाना चाहिए, अन्यथा इस बैक्टीरिया की वृद्धि को प्रोत्साहित करेंगे।
भ्रूण से मक्खियों: 2. साइकिल का सिलसिला।
नोट: चक्र के इस भाग 1 दिन पर प्लास्टिक कंटेनर में रखा 9 दिन बाद जब वयस्क मक्खियों उभरेगा जब तक भ्रूण से चला जाता हैpupae से। इन 8 दिनों के दौरान कुछ भी नहीं किया जा करने के लिए किया गया है लेकिन मॉनिटरिंग कि भ्रूण ड्रोसोफिला जीवन चक्र के अगले चरण के लिए सही ढंग से प्रगति eclosion तक। लार्वा मर रहा है और इस समय के दौरान काले रंग बदल शुरू करते हैं, तो जाँच करें कि फोम प्लग भी तंग नहीं कर रहे हैं और है कि पर्याप्त वेंटिलेशन प्रदान की जाती है। इस अवधि में एक अच्छा समय पिछले चक्र से मक्खी जनसंख्या पिंजरे साफ करने के लिए है।
- भ्रूण का निरीक्षण मानव संसाधन 1 सेंट instar लार्वा 24 के आसपास बनने के बाद उन्हें वयस्क मादा मक्खी भोजन (3 कदम देखें) में जमा किया। जिसके परिणामस्वरूप लार्वा 4 दिनों के दौरान चरण 1 में तैयार मक्खी भोजन से फ़ीड, बढ़ रही है और 2 एन डी और 3 instar लार्वा में दो बार molting होगा।
- मक्खी जनसंख्या पिंजरे साफ करें।
- मक्खियों की गतिविधि को धीमा करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पिंजरे रखें। शुद्ध है कि पिंजरे के एक तरफ कवर है निकालें, और एक तेजी से आंदोलन के साथ, एक बड़े Biohazard प्लास्टिक के साथ खुला ओर टोपीबैग। बैग में पिंजरे की सामग्री डालो।
- Biohazard बैग अभी भी पिंजरे के एक तरफ कवर करने के साथ, खड़ी नीचे Biohazard बैग पक्ष के साथ एक सिंक पर पिंजरे स्थिति। ध्यान से बचने मक्खियों को रोकने और एक biohazard अपशिष्ट कंटेनर में त्यागने के लिए प्लास्टिक की थैली निकाल दें।
- ध्यान से, एक छोटा सा छेद बनाने के पानी के साथ पिंजरे में बंद है, जो सिंक में मक्खियों धो देगा के अंदर कुल्ला करने के लिए पर्याप्त ऊपरी शुद्ध खुला। धीरे-धीरे छेद का आकार बढ़ाने के लिए और पिंजरे के अंदर सब मक्खियों को समाप्त।
- पिंजरे और पानी और साबुन से दोनों के जाल को साफ करें। नेट अभी भी गीला कर रहे हैं जबकि उन्हें सूखी साफ पिंजरे के दोनों किनारों पर सुरक्षित, और अंत में एक प्रयोगशाला मूसलधार बारिश कागज, जो पिंजरे में चिपके से कदम 1.1.2 में तैयार प्लास्टिक की फिल्म नहीं कर पाएगा अंदर डाल दिया। अब पिंजरे अगले चक्र के लिए तैयार है।
- चार दिनों के प्रारंभिक सेटअप के बाद, लार्वा कोषस्थ कीट धारण करना निरीक्षण करते हैं। लार्वा 4 अधिक दिनों के लिए इस चरण में रहेगा।
नोट: डीuring इस चरण pupae प्लास्टिक कंटेनर के अंदर पूरे कपास की सतह को कवर किया जाएगा। - पोटा संबंधी चरण के दौरान और पहले पहले मक्खियों उभरने, प्लास्टिक के कंटेनर खुला और साफ जनसंख्या पिंजरे के अंदर प्रयोगशाला मूसलधार बारिश कागज पर सभी pupae के साथ कपास युक्त प्लास्टिक की फिल्म जगह है। एक डबल गाँठ के साथ नेट बंद करो और प्लास्टिक कंटेनर और अगले चक्र के लिए ढक्कन साफ।
नोट: Pupae ढक्कन से चिपका त्याग और autoclaving या eclosion से पहले ठंड से नष्ट कर दिया जाना चाहिए।
3. वयस्क मक्खियों।
ध्यान दें: प्यूपा के 4 दिनों पहले मक्खियों चरण के बाद प्यूपा से उभरेगा। 24 के भीतर - 48 घंटा सब मक्खियों eclosed जाना चाहिए था। चक्र के इस भाग में, यह उनके प्रजनन के लिए सही माहौल बनाने के उद्देश्य से भोजन उपलब्ध कराने के लिए महत्वपूर्ण है।
- गुड़ ट्रे तैयार करें।
- एक 1 एल कुप्पी विआयनीकृत एच 2 ओ के 556.25 मिलीलीटर, गुड़ की 90 मिलीलीटर, और अगर की 22 ग्राम में गठबंधन। 30 मिनट, शांत करने के लिए एक हलचल पट्टी के साथ आटोक्लेव और 95% EtOH में 10% की Tegosept 9.25 मिलीलीटर जोड़ें।
- 21 x 14.5 सेमी की एक मांस ट्रे में मिश्रण डालो। सुनिश्चित करें कि मात्रा 15 को कवर करने के लिए पर्याप्त है - 17 ट्रे। जमना और एक प्लास्टिक की फिल्म के साथ प्रत्येक ट्रे कवर सुखाने से बचने के लिए 20 मिनट - 10 रुको। 1 एल के कई बोतल एक ही समय में तैयार किया जा सकता है। 4 डिग्री सेल्सियस प्लास्टिक में लिपटे पर स्टोर गुड़ ट्रे जब तक की आवश्यकता है।
- एक गुड़ ट्रे वयस्क मक्खियों के साथ पिंजरे के अंदर गीला खमीर के साथ कवर जोड़ें।
- प्लेट जोड़ने से पहले, 30 मिनट के लिए ठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर पिंजरे जगह है।
- एक बीकर में विआयनीकृत एच 2 ओ की 200 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे सूखी खमीर डालना एक चम्मच के साथ सरगर्मी है। जब मिश्रण लगभग मूंगफली का मक्खन की निरंतरता मक्खियों भोजन में अटक रही रोकने के लिए हो जाता है सूखी खमीर जोड़ने बंद करो।
नोट: यह महत्वपूर्ण है खाद्य समाधान अन्यथा जमना करने के लिए इसे कवर करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा की अनुमति नहींगुड़ ट्रे और कटाई प्रक्रिया (धारा 4.3 देखें) के दौरान अंडे निकाल सकते हैं। - एक गुड़ ट्रे से प्लास्टिक की फिल्म निकालें और नए सिरे से तैयार गीला खमीर एक चम्मच या रंग का उपयोग की एक परत के साथ कवर। सुनिश्चित करें कि पूरी सतह कवर किया जाता है हो सकता है।
- जबकि पिंजरे ठंडे कमरे में अब भी है, शुद्ध खोलने के लिए और ध्यान से पिंजरे में गीला खमीर के साथ गुड़ ट्रे जोड़ें। नेट बंद करो और आरटी पर पिंजरे जगह है।
नोट: यह प्रविष्टि के दौरान एक खाली मांस ट्रे के साथ थाली कवर करने के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन गुड़ ट्रे को मक्खियों के लिए उपयोग ब्लॉक नहीं करना सुनिश्चित करें।
- भोजन की थाली बदले हर 24 - 48 घंटा खमीर से बचने के लिए भी सूखा पाने के लिए। प्रौढ़ मक्खियों सुखाना करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं।
4. चक्र के अंत: भ्रूण कटाई
नोट: सबसे अच्छा मक्खी उर्वरता 3 - eclosion के बाद 5 दिनों के लिए। इसलिए, इस समय के दौरान कटाई सबसे अच्छा भ्रूण उपज मिल जाएगा। बाद वांछित संग्रह comple हैंटेड, चक्र खत्म हो गया है। मक्खियों का बलिदान किया जाना चाहिए और पिंजरे के रूप में साफ 2.2 चरण में निर्दिष्ट।
- आमतौर पर, 2 दिन मक्खी eclosion के बाद, परिचय एक नया गुड़, पिंजरे में ताजा गीला भोजन के साथ ट्रे के रूप में खंड 3.2.5 में विस्तार से बताया। उंगलियों की मदद से अंडे बयान की उपज बढ़ाने के लिए, गीला, खमीर की सतह के रूप में संभव के रूप में अनियमित हैं। एक पुराने भोजन की थाली पिंजरे में मौजूद है, तो नई प्लेट जोड़ने से पहले, ध्यान से इसे हटाने और एक biohazard बैग में त्यागें। उपज बढ़ाने के लिए एक और टिप कपास परत को हटाने के लिए तो सभी अंडे भोजन में रखी हो जाएगा। आरटी पर पिंजरे बनाए रखें।
- छोटे सफेद डॉट्स के रूप में भ्रूण का निरीक्षण करें।
नोट: अंडे एकत्र होने के लिए तैयार हैं। मक्खी पिंजरे के नियमित रखरखाव के लिए, 2 दिन संग्रह की सिफारिश की समय है। इस संग्रह में ज्यादातर भ्रूण और कुछ 1 सेंट instar लार्वा में शामिल होंगे। विभिन्न Colle के लिए काटा भ्रूण के ठेठ पैदावार के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखेंction समय अंक। - भ्रूण हार्वेस्ट
- ठंडे कमरे में पिंजरे के बारे में 30 मिनट के लिए रखें। मतलब समय में धारा 1 में समझाया प्लास्टिक कंटेनर और अगले चक्र के लिए मक्खी भोजन तैयार करते हैं।
- एक 8 एल आटोक्लेव ट्रे में कुल क्षमता की ¼ और फिर 10% ट्राइटन X-100 के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए पानी जोड़ने। जबकि पिंजरे ठंडे कमरे में है ध्यान से गुड़ प्लेट हटाने और एक biohazard बैग के अंदर जगह है।
- बैग से ट्रे निकालें और (भागने से रोकने के लिए मक्खियों) जल्दी से यह डूब आटोक्लेव ट्रे में डिटर्जेंट समाधान में। Biohazard बैग बंद करो और एक biohazard कंटेनर में डाल दिया। मक्खियों पानी है कि डिटर्जेंट शामिल नहीं करता है में डूब नहीं होगा।
- गुड़ के बंद भ्रूण और खमीर धोने के लिए एक बड़ी तूलिका और आसुत जल बंदूक का प्रयोग करें। Biohazard बॉक्स में प्लेटें और गुड़ त्यागें।
- एक तीन चलनी सेट (coarsest चलनी 30 शीर्ष पर, 40 के बीच में और 100 तल पर) के माध्यम से ध्यान समाधान डालो। धो झुरमुटों ओn आसुत जल बंदूक के साथ शीर्ष स्तर पर जब तक कोई झुरमुटों रहते हैं।
नोट: वयस्क मक्खियों और 3 instar लार्वा चलनी 30 में बनाए रखा जाएगा।- आसुत जल के साथ आटोक्लेव ट्रे कुल्ला और चलनी के माध्यम से कुल्ला पानी डालना। शीर्ष चलनी और दोहराने प्रक्रिया को दूर करता है, तो खमीर झुरमुटों रहते हैं। 1 सेंट और 2 एन डी instar लार्वा का सब से अधिकांश चलनी 40 में रहेगा।
- दूसरी चलनी निकालें। तीसरे (नीचे) चलनी में पीले सामग्री भ्रूण और छोटे 1 सेंट instar लार्वा का मिश्रण है। आसुत जल बंदूक का प्रयोग करें चलनी के एक तरफ करने के लिए सभी अंडे स्थानांतरित करने के लिए। उन्हें एक रंग के साथ ले लीजिए और उन्हें तौलना।
- इन चक्रों के दौरान भ्रूण के संग्रह उपज / लार्वा जी 7 और 13 के बीच है। एक नया चक्र (खंड 1) शुरू करने के लिए इस सामग्री का केवल 1.5 ग्राम का प्रयोग करें। आगे की प्रक्रिया के लिए भ्रूण के आराम का उपयोग या खारिज किया जा सकता है।
5. इसके अलावाप्रसंस्करण
नोट: भ्रूण आबादी की निरंतरता के लिए उपयोग नहीं किया वैकल्पिक प्रयोगों के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है। दोनों विकल्पों के लिए, भ्रूण पहले dechorionated होना पड़ सकता है।
- dechorionation के लिए, 50% ब्लीच समाधान में 2 मिनट के लिए भ्रूण धोने और आसुत जल से अच्छी तरह कुल्ला।
- एक कागज तौलिया के साथ मजबूती से दबाकर भ्रूण, पहले सूखा फ्रीज करने के लिए, और फिर वजन और जगह उन्हें एक रंग की मदद से, एक 15 या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में। अंत में कुछ सेकंड के लिए तरल एन 2 में शंक्वाकार ट्यूब डूब।
Representative Results
एक मक्खी पिंजरे आबादी के रखरखाव के लिए उड़ान भरने के जीवन चक्र पर आधारित है। इसलिए, (चित्रा 1 ए) प्लास्टिक कंटेनर में भ्रूण और लार्वा की प्रारंभिक जैविक मिश्रण रखने के बाद निषेचित अंडे से अधिक नहीं 2 दिनों में लार्वा हो जाएगा और लार्वा 4 दिनों के लिए बढ़ेगा, अपेक्षाकृत अलग instar लार्वा चरणों के माध्यम से सिंक्रनाइज़ ( चित्रा 1 बी देखें)।
बाद लार्वा 3 instar लार्वा चरण पूरा कर लिया है कि वे पोटा बना जाना और ढक्कन (चित्रा 1 सी) की आंतरिक सतह पर कुछ के साथ प्लास्टिक के कंटेनर के अंदर कपास की सतह को कवर किया जाएगा। जब तक मक्खियों कायापलट प्रक्रिया को समाप्त इस pupation अवधि अगले 4 दिनों के लिए जाना होगा। इस अवधि के दौरान यह दृढ़ता से पिंजरे में मक्खियों को हस्तांतरण करने की सिफारिश की है। के बाद 10 - पहले वयस्क मक्खियों दिन 9 बजे eclose करने के लिए शुरू कर देंगेचक्र (चित्रा -1) के और दिन के 11 उनमें से सभी ने दीक्षा pupae से उभरा है जाएगा।
5 दिनों eclosion (15 करने के लिए 13 दिन) के बाद और अंत में 17 दिन में गिरावट आती है (7 दिनों eclosion के बाद) - भ्रूण संग्रह का सबसे अच्छा उपज 3 प्राप्त की है। इसलिए, यह 13 दिन में ताजा भोजन के अंतिम ट्रे जोड़ने के लिए और 15 दिन में अंडे (चित्रा 1E और एफ) को इकट्ठा करने की सिफारिश की है। इस भ्रूण की अधिकतम संख्या के संग्रह की अनुमति देगा। प्रत्येक चक्र में 1.5 ग्राम का एक प्रारंभिक सामग्री के साथ लगातार 6 चक्र संग्रह की उपज। टेबल 1 से पता चलता एक तिहाई अतिरिक्त दिन पहले एकत्रित भोजन भी सूखी होने में परिणाम हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप एकत्र भ्रूण की उपज कम हो जाएगा जोड़ना, और चित्रा 2 एक पूरे चक्र संग्रह के लिए सिफारिश की अनुसूची है।
सामग्री 2 दिन में काटा60; अवधि ज्यादातर भ्रूण से बना है। हालांकि लार्वा की एक छोटी संख्या भी मौजूद हैं। पिंजरे रखरखाव प्रयोजनों के लिए इन लार्वा एक समस्या है, क्योंकि asynchronicity के कुछ डिग्री की उम्मीद नहीं कर रहे हैं। फिर भी कुछ जैव रसायन प्रयोगों के लिए, इन भ्रूणों की शुद्धता बहुत महत्वपूर्ण है, लेकिन एक ही समय में यह भी इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए अंडे की बड़ी मात्रा में एकत्र करने के लिए आवश्यक है। इस कारण से कई लघु लगातार संग्रह, 1 घंटा और 3 घंटा पर प्रदर्शन किया गया जल्दी से आरटी पर भोजन के साथ एक नई प्लेट को जोड़ने के बाद, उपज और पवित्रता है कि इस विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता है के एक अनुमान प्रदान करने के लिए (2 टेबल और चित्रा 3) । 1 घंटा लगातार संग्रह एक बहुत कम उपज (14.5 मिलीग्राम) लेकिन फिर भ्रूण हर बार एकत्र के लिए वृद्धि की मात्रा लेकिन पिछली बार के साथ शुरू कर दिया। पहली बार में कम उपज के कारण हो सकता है मक्खियों भोजन बदल रहा है लेकिन बाद में acclimating की प्रक्रिया के दौरान जोर दिया जा रहा है। दूसरी ओर, कोई LARVAE पांच अनुक्रमिक संग्रह (चित्रा 3 ए) में मनाया गया, दिखा रहा है कि छोटे कद के संग्रह के उच्च शुद्धता निकलेगा। कपास पिंजरे से हटा नहीं है, तो संभावना है कि पहले के समय अंक से लार्वा रहने और ताजा प्लेट बढ़ जाती है में प्रवेश करेंगे। यहां तक कि जब कपास निकाल दिया जाता है, कई बार लार्वा पिंजरे की तरफ घूमते हैं और एक संग्रह के दौरान भोजन में प्रवेश करेंगे।
3 घंटा लगातार संग्रह के लिए, उपज 840 तक 1250 मिलीग्राम है, जो चारों ओर 10 बार 1 घंटा संग्रह में प्राप्त की पैदावार की तुलना में अधिक है तक बताया गया। इन भ्रूणों की पवित्रता 100% (चित्रा 3 बी) के पास था। समसामयिक लार्वा मनाया गया। कुछ विकासात्मक अध्ययन एकत्र भ्रूण के लिए एक बहुत ही सख्त तुल्यकालन की आवश्यकता है। तुल्यकालन शुद्धता बढ़ाने के लिए, यह पहला संग्रह प्लेट त्यागने के लिए अगर स्थिति आदर्श नहीं हैं, महिलाओं को अधिक परिपक्व अंडे को बनाए रखने और जमा कर सकते हैं क्योंकि सिफारिश की हैमीटर की स्थिति ऐसी एक ताजा प्लेट की शुरूआत के साथ के रूप में सुधार होता है,। इसके अलावा यह पता चला है कि पुराने वयस्क मक्खियों (> 6 दिन) कम सिंक्रनाइज़ भ्रूण का उत्पादन महत्वपूर्ण है। उच्च सटीकता के साथ तुल्यकालन की डिग्री करने के लिए, एकत्र भ्रूण की एक DAPI धुंधला सिफारिश की है।
चित्रा 1 में एक मक्खी जनसंख्या पिंजरे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जीवन चक्र। (ए) चक्र की शुरूआत प्लास्टिक बॉक्स कंटेनर में भ्रूण की 1.5 ग्राम बोने। एक संदर्भ के रूप में, कम पैनल में, फिल्टर पेपर की लंबाई 8.5 सेमी है। (बी) लार्वा अपेक्षाकृत 5 दिन चक्र की दीक्षा के बाद सिंक्रनाइज़ बढ़ रहा है। (सी) 8 दिन, मक्खियों की सबसे प्यूपा चरण में हैं। बी (बी) और सी में कम पैनल (सी ') ऊपरी पैनल में संकेत क्षेत्रों की आवर्धन कर रहे हैं। (डी) प्रौढ़ मक्खियों pupae 10 दिनों चक्र दीक्षा के बाद से उभरा। (ई) वयस्क भ्रूण एकत्रित करने की प्रक्रिया, पीले सामग्री मक्खी भोजन पर शुरू 15. दिन में पहले जनसंख्या पिंजरे के अंदर मक्खियों निषेचित अंडे हैं। (एफ) भ्रूण (और कुछ लार्वा) 100 coarsest चलनी के तल पर एकत्र, एक पूरे के पिंजरे चक्र के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. पूरे चक्र संग्रह अनुसूची। चित्रा 2 एक पूरा चक्र संग्रह के लिए सिफारिश की अनुसूची से पता चलता है। टी = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. 1 घंटा और 3 घंटा लगातार संग्रह की पवित्रता। 1 घंटा (ए) और 3 घंटा (बी) के भोजन का एक नया ट्रे जोड़ने के बाद पर एकत्र भ्रूण के प्रतिनिधि छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| चक्र संख्या | यील्ड (G) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
| संग्रह # | संग्रह की लम्बाई (मानव संसाधन) | यील्ड (एमजी) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160.1 |
| 5 | 1 | 106.1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
तालिका 2 में 1 घंटे और 3 घंटा लगातार संग्रह की उपज। तालिका 2 एक नए गुड़ की थाली रखने के बाद नए खाद्य और लगातार 3 संग्रह 3 घंटा जोड़ने के बाद 1 घंटा 5 लगातार संग्रह की उपज से पता चलता है।
Discussion
सामग्री एक के 1.5 ग्राम के साथ शुरू चक्र के अनुसार 7 और 13 ग्राम के बीच एकत्र भ्रूण की एक उपज प्राप्त कर सकते हैं। सामग्री के इस तरह के एक राशि प्राप्त करने के लिए यह मक्खी चक्र के सभी चरणों के लिए सही संवर्धन की स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर तापमान और आर्द्रता, जो 24 डिग्री सेल्सियस और 35% क्रमशः होना चाहिए रहे हैं। इन दो मापदंडों प्रयोगशाला के सामान्य वातावरण में लगातार आयोजित नहीं किया जा सकता है, तो एक संभावना यह एक इनक्यूबेटर या एक पर्यावरण कक्ष में मक्खी पिंजरे जगह होगी। अन्य प्रोटोकॉल उत्पादित अंडे 9,10 की पैदावार बढ़ाने के लिए 70% आर्द्रता और यह भी एक लगातार 24 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र सलाह देते हैं। हालांकि 35% के आसपास नमी को ध्यान में रखते हुए जीवाणु संक्रमण से बचा जाता है, और जब से इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए ही आबादी के पिंजरे के रखरखाव है, मक्खियों प्रयोगशाला के सामान्य प्रकाश के वातावरण में रखा जाता है।
एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु di रखने के लिए हैवयस्क के लिए sturbances यथासंभव कम मक्खियों। यह एक स्थान के लिए उड़ान भरने के कमरे से अलग पिंजरे में रखने के लिए अन्य मक्खियों से पार संक्रमण से बचने की सलाह दी जा सकती है।
ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती मक्खियों की बड़ी आबादी के संवर्धन की सिफारिश नहीं है, क्योंकि यह बहुत मुश्किल है उनकी पवित्रता बनाए रखने के लिए और वे बड़ी आबादी पिंजरों 14 में स्पष्ट असामान्य व्यवहार संभोग प्रदर्शन कर सकते हैं।
एक संभावित समस्या है, जबकि बड़ी मात्रा में ड्रोसोफिला संवर्धन के कण और / या फफूंदी जैसे अन्य जीवों, जो भोजन के लिए प्रतिस्पर्धा करेंगे और इसलिए उत्पादित अंडे की उपज कम की उपस्थिति है। इससे बचने के लिए, यह सभी उपकरणों को साफ रखने के लिए, पिंजरे, जाल धो और पानी और साबुन, और हर चक्र के बाद डिस्पोजेबल सामग्री (फोम प्लग) discarding के साथ बक्से उड़ान भरने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। बढ़ रही ढालना को कम करने के लिए, propionic और फॉस्फोरिक एसिड जब कदम में मक्खी भोजन की तैयारी कर गीला खमीर में जुड़ जाते हैं1.2 और Tegosept जब गुड़ तैयारी 3.1 कदम में ट्रे। जब समय कम है और सामग्री सही दूर साफ नहीं किया जा सकता है यह इस तरह के प्लास्टिक का डिब्बा या -20 सी में चलनी के रूप में कभी कभी जगह सामग्री के लिए उपयोगी है।
एक पूरी संग्रह चक्र 14 में होता है - 15 दिन, जब शुरुआत भ्रूण मक्खी बॉक्स में वरीयता प्राप्त और पिछले संग्रह दिन के साथ समाप्त कर रहे हैं। समय की इस अवधि के दौरान यह आदेश आबादी मक्खी पिंजरे के रखरखाव (छवि। 2) के लिए सभी आवश्यक कदम, प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत याद करने में एक कार्यक्रम का आयोजन करने के लिए सिफारिश की है। दिन है कि अंडे, वरीयता प्राप्त होते हैं जब तक वयस्क मक्खियों उभरने से, यह केवल प्लास्टिक बॉक्स का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है, और जब पोटा बनना होता है, उन्हें पिंजरे के अंदर जगह है। जब तक भ्रूण एक नया चक्र के लिए वरीयता प्राप्त कर रहे 3 दिन - उसके बाद, मक्खियों हर 2 खिलाना पड़ता है। पूरे प्रोटोकॉल में, सबसे लंबा दिन एक नया चक्र शुरू करने के लिए संग्रह और भ्रूण के बीज बोने की क्रिया के दौरान होता है। ए5 दिन वयस्क eclosion के बाद, और अंत में 2 दिन बाद गिरावट आती है - प्रोटोकॉल में टिप्पणी कर रहा है, सबसे अच्छा अंडे की उपज 3 है। यह हमारे लिए दिन में जो अंडे की फसल प्रदर्शन किया जाएगा चुनने के लिए में कुछ लचीलापन देता है।
किसी भी कारण के लिए एकत्र भ्रूण की उपज वांछित शुरू राशि (1.5 ग्राम) की तुलना में कम है, तो एक हमेशा एक नया गुड़ ट्रे जोड़ने के लिए और अधिक अंडे अगले दिन जमा कर सकते हैं। लगातार संग्रह के लिए, यह समानांतर में 2 पिंजरों बनाए रखने के लिए सिफारिश की है, और अगर भ्रूण की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है, यह भी बड़ा पिंजरों का उपयोग करना संभव है। थोड़े समय के संग्रह कर के मामले में, एक तरह से पैदावार बढ़ाने के लिए सुबह में अंडे बिछाने फट का लाभ ले रहा है।
वहाँ विभिन्न विकास के चरणों की बड़ी मात्रा में एकत्र करने के कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, जनसंख्या पिंजरों से एकत्र भ्रूण immunoprecipitation assays 6-8, जन संग्रह में बहुत सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया हैअलग लार्वा से लार्वा ऊतकों के एन -3 सी प्रयोगों 4 और शाही सेना की तैयारी 15 के लिए एक बहुत अच्छा स्रोत होने के लिए प्रदर्शन किया है, और वयस्क मक्खियों से सिर चिप प्रयोगों 16 के लिए उपयोग किया गया है। इसके अलावा, वयस्कों अक्सर टिशू कल्चर 17 के लिए उड़ान भरने के अर्क बनाने के लिए आवश्यक हैं।
पिंजरे के सबसे होनहार आवेदनों में से एक उच्च throughput assays कि रोगजनकों, जैविक अणुओं, रासायनिक पदार्थ और विकिरण के लिए जोखिम के जवाब में विश्लेषण और जीन, टेप, प्रोटीन और चयापचयों की स्क्रीनिंग की अनुमति देने के लिए सामग्री प्रदान करना है। इन बड़े पैमाने पर assays में लोगों की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, और मक्खी जनसंख्या पिंजरे यहाँ वर्णित है ताकि उनके विश्लेषण और 18 स्क्रीनिंग के लिए ड्रोसोफिला जीवन चक्र के विभिन्न चरणों के दौरान माल की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए बहुत सहायक हो सकता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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