Introduction
Förmågan att kombinera genetiska och biokemiska metoder har gjort Drosophila särskilt lämplig organism för biokemi och molekylärbiologi studier 1-3. Dessa studier kräver ofta stora mängder av biologiskt material, inte bara från vuxna flugor, men även från larver 4, puppor 5 och embryon 6-8. För att erhålla stora mängder material, forskare har odlade flugor med hjälp av stora behållare som kallas flyga "populations burar". Dessa burar består av en cylinder tillverkad av plast täckt med ett nät på båda sidor för att möjliggöra införandet av mat inne i buren utan flugorna flyr. Dessa burar kan vara hemlagad 9-11 eller köpas från ett företag (se tabell av specifika material / utrustning).
En stor fördel med att använda detta system för att odla ett stort antal flugor är att cykeln av bananfluga 12 kan styras på ett sätt som alla flugor utvecklas i en redevis synkroniserat sätt. Denna synkronisering uppnås genom sådd nya embryon, utfodring larver / flugor och offra de vuxna flugorna vid exakta tidpunkter. Med hjälp av en synkroniserad fluga befolkning är särskilt användbar för utvecklingsstudier 13.
Starten av en ny population bur från några flugor är en tidskrävande process som kräver många amplifieringscykler 9-11. Även med större behållare som flyga odlingsflaskor eller minicages, kan hela processen pågå i månader. För att undvika detta tidsödande steg, många Drosophila laboratorier upprätthålla regelbundet sådana burar. Det är mest praktiskt att starta en ny bur utgående från en embryosamlings från en redan etablerad population bur. I allmänhet är de flesta labb upprätthålla vildtyp befolknings burar, såsom Oregon R eller Canton S. manuskript presenterar ett detaljerat protokoll för att upprätthålla flyga befolkningen burar.
Protocol
1. Starta Cykel: Sådd embryon
OBS: Cykeln börjar med 1,5 g samlat material (en blandning bestående av embryon och / eller någon första stadiets larver) från den föregående cykeln. Detta material kommer att placeras i en plastbehållare (se tabell över specifika material / utrustning) med en aktiv jäst blandningen tills PUPP fasen. Behållaren kommer att vara stängd efter införandet av den biologiska blandning av embryon och larver med locket för att undvika att låta larverna att fly. Det är nödvändigt att göra hål i locket för att tillåta luftcirkulation. För att slippa larver flykt genom hålen är propparna används. Slutligen är det rekommenderas att bära handskar och skyddsrock, inte bara i det här avsnittet, men också i hela protokollet, för att undvika att få smutsiga eller färgning kläder med blekmedel.
- Ställ in plastbehållare.
- Gör tre kvadratiska hål med ett rakblad i plastbehållaren locket på enpproximately 2,2 cm. Lägg band (3/4 tum märkband) till de fyra hörnen av varje hål för att säkerställa en tät passning för skumproppar (50 x 55 mm, DXL), och sedan placera en skum plugg i varje hål.
- Täcka insidan av plastbehållare med plastfolie. Över denna film, lägga ett lager av bomull för att täcka botten av plastförpackningen. Riv bomullen med fingrarna.
- Förbereda flugan mat.
- Lägg 333 ml avjoniserat vatten i en 500 ml bägare. Under omröring av bägaren med en magnetisk bar, tillsätt 167 | il av propionsyra och 1,08 ml av fosforsyra, från stamlösningen (99,96% och 85% respektive).
- Tillsätt långsamt 77,5 g av aktiv torrjäst, undvika stora klumpar. Efter upplösning av torrjäst, tillsätt 38,8 g sackaros.
OBS: Sackaros bör vara den sista ingrediensen som skall tillsättas, eftersom omedelbart efter tillsats denna komponent, kommer jäsningen börjar.
- Omedelbart efter upplösning av sackaros, hällmat över bomull, och se till att täcka bomull jämnt. Stäng plastbehållare med locket för att undvika flytt flugor i laboratoriet förorenar maten.
- Resuspendera 1,5 g av de skördade embryon (ej dechorionated) från den föregående cykeln med 5 ml 70% etanol. Halve två filterpapper och distribuera den biologiska blandningen jämnt över de 4 bitar med hjälp av en spatel eller en överföringspipett med en bred spets (skuren vid behov). Lägg filterpapper ovanpå indränkt bomull och stäng locket. Slutligen inkubera plastbehållaren vid RT (24ºC) och fuktighet (35%) till dess att puppa steget.
OBS! Plastbehållare bör inte placeras i en fuktig kammare, annars kommer att uppmuntra tillväxten av bakterier.
2. Fortsättning på cykel: Från embryon till flugor.
OBS: Denna del av cykeln går från embryon som placeras i plastbehållaren på dag 1 till 9 dagar senare när de vuxna flugorna kommer att dyka uppfrån puppor. Under dessa 8 dagar ingenting har att göra men övervaka att embryona utvecklas korrekt till nästa steg i Drosophila livscykel tills eclosion. Om larver börjar dö och vrida svart under denna tid, kontrollera att skumproppar är inte för hårt och att tillräcklig ventilation. Denna period är en bra tid att städa flugan befolkningen buren från den föregående cykeln.
- Beakta embryona blir 1: a stadiets larver runt 24 timmar efter den vuxna kvinnliga deponerade dem i farten mat (se steg 3). Den resulterande larver kommer att ligga från flugan mat lagad i steg 1 under 4 dagar, växer och ömsat två gånger i 2: a och 3: e stadiet larver.
- Rengör flugan befolkningen bur.
- Placera buren vid 4 ° C under minst 30 min för att sakta ner aktiviteten hos flugorna. Avlägsna nätet som täcker en sida av buren, och med en snabb rörelse, cap den öppna sidan med en stor biologiskt plastväska. Häll innehållet i buren in i påsen.
- Med biologiskt påse fortfarande täcker ena sidan av buren, placera buren vertikalt över ett handfat med biologiskt påse nedåt. Försiktigt bort plastpåsen för att förhindra flugor flyr och kasta den i en biologiskt avfallsbehållare.
- Öppna försiktigt övre nätet tillräckligt för att skapa ett litet hål, skölj insidan av buren med vatten, som kommer att tvätta flugorna i vasken. Långsamt öka storleken av hålet och eliminera alla flugor inne i buren.
- Rengör buren och båda nät med vatten och tvål. Medan näten är fortfarande våt säkra dem på båda sidor av den torra ren bur, och slutligen sätta in ett labb soaker papper, som kommer att förhindra plastfilmen som framställts i steg 1.1.2 från att klibba till buren. Nu buren är redo för nästa cykel.
- Fyra dagar efter den första installationen, observera larverna förpuppas. Larverna kommer att förbli i detta skede ytterligare 4 dagar.
OBS: Dnder denna fas puppor kommer att täcka hela bomullsytan inuti plastbehållare. - Under PUPP fasen och innan de första flugorna fram, öppna plastbehållaren och placera plastfilmen innehåller bomullen med all puppor över labb soaker papper inuti rena befolkningen bur. Stänga nätet med en dubbelknut och rengör plastbehållaren och locket för nästa cykel.
OBS: Puppor fäst locket ska kasseras och förstöras genom autoklavering eller frysning före eclosion.
3. vuxna flugor.
OBS: Efter 4 dagar puppan skede de första flugorna kommer fram ur puppan. Inom 24-48 timmar alla flugor borde ha eclosed. I denna del av cykeln, är det viktigt att ge dem mat i syfte att skapa den rätta miljön för reproduktion.
- Förbered melass facken.
- Kombineras i en 1-liters kolv 556,25 ml avjoniserat H2O, 90 ml av melass, och 22 g agar. Autoklav med en omrörare under 30 minuter, låt svalna och till 9,25 ml 10% Tegosept i 95% EtOH.
- Häll blandningen i en kött fack 21 x 14,5 cm. Se till att volymen är tillräckligt för att täcka 15 - 17 brickor. Vänta 10 - 20 min för att stelna och täcka varje bricka med en plastfilm för att undvika uttorkning. Flera flaskor av ett L kan framställas på samma gång. Förvara melass brickorna vid 4 ° C insvept i plast tills de behövs.
- Lägg en melass bricka täckt med våt jäst inne i buren med vuxna flugor.
- Innan du lägger plåten, placera buren på 4 ° C i kylrummet under 30 minuter.
- Tillsätt 200 ml avjoniserat H2O i en bägare och långsamt hälla torrjäst under omröring med en sked. Sluta lägga torrjäst när blandningen blir ungefär konsekvens av jordnötssmör för att förhindra flugor fastnar i maten.
OBS: Det är viktigt att inte låta maten lösning stelna annars blir det mycket svårt att täckamelass fack och extrahera äggen under skördeprocessen (se avsnitt 4.3). - Ta bort plastfilmen från en melass fack och täcka den med ett skikt av den färska beredda våta jäst med hjälp av en sked eller spatel. Vara säker på att hela ytan är täckt.
- Medan buren är fortfarande i det kalla rummet, öppna nätet och tillsätt försiktigt den melass bricka med våt jäst in i buren. Stänga nätet och placera buren vid RT.
OBS: Det kan vara lämpligt att täcka plattan med en tom kött fack under införandet, men tänk på att inte blockera åtkomst av flugorna till melass facket.
- Ändra tallriken varje 24-48 timmar för att undvika jästen att bli för torr. Vuxna flugor är mycket känsliga för uttorkning.
4. slutet av cykeln: Skörda embryon
OBS: Den bästa farten fertilitet är 3 - 5 dagar efter eclosion. Därför kommer skörden under denna tid få bästa embryoutbytet. Efter önskade samlingar är kompletted, är cykeln om. Flugorna ska offras och buren rengöras som anges i steg 2,2.
- Typiskt, 2 dagar efter flyga eclosion, införa en ny melass bricka med färska våt mat i buren, som beskrivs i avsnitt 3.2.5. För att öka utbytet av ägg nedfall, med hjälp av fingrarna, göra ytan av den våta jäst så oregelbundna som möjligt. Om en gammal mat fack finns i buren, innan den nya plattan, försiktigt bort den och kasta den i en biologiskt påse. Ett annat tips för att öka utbytet är att avlägsna bomullslagret så att alla ägg kommer att läggas i maten. Bibehålla buren vid RT.
- Observera embryon som små vita prickar.
OBS: Äggen är redo att samlas in. För underhåll av flugan buren, är den rekommenderade tiden två dagars samling. Denna samling kommer att innehålla mestadels embryon och få en st INSTAR larver. Se representativa resultat för typiska utbyten av skördade embryon för olika colleInsatser tidpunkter. - Skörda embryon
- Placera buren i kylrummet i ca 30 min. Under tiden förbereder plastförpackning och flugan mat för nästa cykel som beskrivs i avsnitt 1.
- I en 8 liter autoklav fack tillsätt vatten till en fjärdedel av den totala kapaciteten och sedan tillsätt 1 ml 10% Triton X-100. Medan buren är i kylrummet avlägsna noggrant melass plattan och placera den i en biologiskt påse.
- Ta bort magasinet ur påsen och dränka den snabbt (för att förhindra flugor från att fly) i tvättmedelslösning i autoklaven facket. Stäng biologiskt påse och lägg i en behållare för biologiskt riskavfall. Flugor kommer inte drunknar i vatten som inte innehåller detergent.
- Använd en stor pensel och destillerat vatten pistol för att tvätta embryon och jäst av melass. Kassera plattor och melass i biologiskt box.
- Häll lösningen försiktigt genom en tre sikt set (grövsta sikten 30 på toppen, 40 i mitten och 100 på botten). Tvätta klumpar on toppnivå med destillerat vatten pistol tills inga klumpar kvar.
OBS: Den vuxna flugor och 3: e instar larver kommer att bevaras i sikten 30.- Skölj autoklav facket med destillerat vatten och häll sköljvattnet genom sållen. Ta bort övre sikten och upprepa proceduren om jäst klumpar kvar. Det mesta av den 1: a och alla av den 2: a stadiets larver kommer att förbli i sikten 40.
- Ta bort andra såll. Den gulaktiga material i den tredje (nedersta) sikt är blandningen av embryon och små ett st instar larver. Använda destillerat vatten pistol för att flytta alla ägg till en sida av sikten. Samla dem med en spatel och väga dem.
- Under dessa cykler insamling utbytet av embryon / larver varierar mellan 7 och 13 g. Använd endast 1,5 g av detta material för att starta en ny cykel (avsnitt 1). Använda resten av embryona för ytterligare behandling eller kan kasseras.
5. Ytterligarebearbetning
OBS! Embryon som inte utnyttjas för fortsättning av befolkningen kan användas omedelbart för experiment eller alternativt kan frysas vid -80 ° C. För båda alternativen, kan embryona måste först dechorionated.
- För dechorionation, tvätta embryon i 2 minuter i 50% blekmedel lösning och skölj noga med destillerat vatten.
- Att frysa embryon, första torr genom att trycka på ordentligt med en pappershandduk, och sedan väga och placera dem, med hjälp av en spatel, i en 15 eller 50 ml koniska rör. Slutligen dränka det koniska röret i flytande N2 under ett par sekunder.
Representative Results
Upprätthållandet av en fluga bur befolkning bygger i farten livscykel. Därför efter att ha placerat den initiala biologiska blandning av embryon och larver i plastbehållaren (Figur 1A) de befruktade äggen blir larver i högst två dagar och larverna kommer att växa i 4 dagar, relativt synkroniserade genom de olika stadiets larver steg ( se figur 1B).
Efter larverna har avslutat den 3: e INSTAR larvstadiet kommer de att förpuppas och täcka ytan av bomullen i plastbehållaren med några på den inre ytan av locket (Figur 1C). Detta pupation period kommer att gå för de kommande 4 dagar tills flugorna avsluta metamorfos processen. Under denna period är det starkt rekommenderat att överföra flugor in i buren. De första vuxna flugor börjar Eclose på dag 9-10 efterinitiering av cykeln (figur 1D) och dag 11 alla av dem kommer att ha vuxit fram ur puppan.
Den bästa avkastningen av embryon samling erhålls 3 - 5 dagar efter eclosion (dag 13-15) och slutligen avtar i dag 17 (7 dagar efter eclosion). Därför rekommenderas det att lägga till den sista brickan av färska livsmedel vid dag 13 och samla in ägg på dag 15 (Figur 1E och F). Detta gör det möjligt samling av det maximala antalet embryon. Lägga till en tredje extra dag innan insamling kan resultera i livsmedlet att vara alltför torr och följaktligen kommer att minska utbytet av uppsamlade embryon. Tabell 1 visar utbytet av 6 på varandra följande cykel samlingar, med ett utgångsmaterial med 1,5 g i varje cykel, och Figur 2 är det rekommenderade schemat för en hel cykel samling.
Den material som skördats under två dagar60; perioder mestadels består av embryon. Emellertid ett litet antal larver är också närvarande. För bur underhåll dessa larver är inte ett problem, eftersom en viss grad av asynkronitet förväntas. Ändå för vissa biokemi experiment är renheten hos dessa embryon mycket viktigt, men samtidigt är det också nödvändigt att samla in stora mängder ägg för att utföra dessa experiment. Av denna anledning flera korta konsekutiva samlingar genomfördes vid 1 timme och 3 timmar efter snabbt lägga vid RT en ny platta med mat, för att ge en uppskattning av utbyte och renhet som kan erhållas med denna metod (tabell 2 och figur 3) . 1 hr rad samlingar började med en mycket låg avkastning (14,5 mg) men sedan de mängder av embryon ökade för varje gång samlas men förra gången. Den låga avkastningen vid första kan bero på att flugorna som betonade under processen att ändra mat men senare acclimating. Å andra sidan, ingen larvae observerades i fem sekventiella samlingar (figur 3A), som visar att kortare samlingar ger högre renhet. Om bomull inte tas bort från buren, kommer sannolikheten att larver från tidigare tidpunkter kvar och anger färsk platta ökas. Även när bomull tas bort, ibland larver kommer att vandra på sidan av buren och in i livsmedels under en samling.
För tre hr rad samlingar, avkastningen varierade från 840 till 1250 mg, vilket är cirka 10 gånger mer än de erhållna utbytena i 1 timme samlingar. Renheten hos dessa embryon var nära 100% (figur 3B). Enstaka larver observerades. Vissa utvecklingsstudier kräver en mycket strikt synkronisering för embryon som samlats. För att öka synkroniserings renhet, rekommenderas att kasta den första uppsamlingsplattan för om förhållandena är inte idealiskt, kan honorna behålla mer mogna ägg och deponeram när villkoren förbättras, såsom med införandet av en färsk platta. Det är också viktigt att veta att äldre vuxna flugor (> 6 dagar) producerar mindre synkroniserade embryon. Att kontrollera graden av synkronisering med hög noggrannhet, är en DAPI färgning av de insamlade embryon rekommenderas.
Figur 1. Drosophila melanogaster Life Cycle i en fluga Population Cage. (A) Inledande av cykeln sådd 1,5 g av embryon i plastlådan behållaren. Som referens, i den nedre panelen, är längden av filterpapperet 8,5 cm. (B) Larver växer relativt synkroniserade 5 dagar efter inledandet av cykeln. (C) På dag 8, de flesta av de flugor är i puppan skede. De lägre panelerna i B (B ') och C (C ') är förstoringar av de angivna områdena i de övre panelerna. (D) Vuxna flugor framkom puppor 10 dagar efter cykelstart. (E) vuxna flugor i befolkningen buren innan processen med att samla in embryon på dag 15. Den gulaktiga material i farten mat är befruktade ägg. (F) Embryon (och några larver) samlas i botten av de 100 grövsta sikten, efter en hel bur cykel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Hela Cycle Collection schema. Figur 2 visar den rekommenderade schemat för en komplett cykel samling. t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. renhet en timme och 3 timmar i följd samlingar. Representativ bild av embryon som samlats vid en timme (A) och 3 timmar (B) efter att ha lagt en ny bricka med mat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| cykelantal | Utbyte (g) |
| 1 | 10,3 |
| 2 | 9,5 |
| 3 | 10,3 |
| 4 | 12,7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7,1 |
| samling # | Längd samling (h) | Utbyte (mg) |
| 1 | 1 | 14,5 |
| 2 | 1 | 21,6 |
| 3 | 1 | 56,1 |
| 4 | 1 | 160,1 |
| 5 | 1 | 106,1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
Tabell 2. Utbytet av en timme och 3 timmar i följd samlingar. Tabell 2 visar utbytet av 5 på varandra följande samlingar en timme efter tillsats av ny mat och 3 kollektioner på varandra följande tre timmar efter att placera en ny melass platta.
Discussion
Från och med 1,5 g material kan man få ett utbyte av insamlade embryon mellan 7 och 13 g per cykel. För att få en sådan mängd material är det viktigt att behålla de rätta odlingsbetingelserna för alla stadier av flugan cykeln.
De viktigaste parametrarna är temperatur och fuktighet, som bör vara 24 ° C och 35% respektive. Om dessa två parametrar inte kan hållas konstant i den normala miljön i labbet, skulle en möjlighet vara att placera flugan buren i en inkubator eller en klimatkammare. Andra protokoll rekommenderar 70% luftfuktighet och även en konstant 24 timmar ljus-mörker-cykel för att öka utbytet av de producerade ägg 9,10. Men att hålla luftfuktigheten ca 35% undviker bakteriell kontamination, och eftersom syftet med detta protokoll är endast upprätthållandet av en population bur är flugorna hålls i normalt ljus miljö labbet.
En annan viktig punkt är att hålla disturbances till vuxna flugor så låg som möjligt. Det kan vara tillrådligt att hålla buren på en plats skild från flugan rum för att undvika korskontaminering från andra flugor.
Odling av stora populationer av transgena och muterade flugor rekommenderas inte, eftersom det är mycket svårt att upprätthålla sin renhet och de kan uppvisa uttalad onormalt parningsbeteende i stora befolknings burar 14.
Ett möjligt problem medan odling Drosophila i stora mängder är närvaron av andra organismer som kvalster och / eller mögel, som kommer att konkurrera för mat och därmed minska utbytet av producerade ägg. För att undvika detta, är det mycket viktigt att hålla all utrustning ren, tvätta buren, nät och flyga lådor med vatten och tvål och kasta engångsmaterial (skumpluggar) efter varje cykel. För att minska mögel växer, är propionsyra och fosforsyra i den våta jäst vid beredning av flugan mat i steg1,2 och Tegosept vid upprättandet av melass facket i steg 3,1. Det är ibland bra att placera material såsom plastlådan eller siktar på -20 ˚C när tiden är kort och material kan inte rengöras direkt.
En hel samling cykel förekommer i 14 - 15 dagar, med början när embryona såddes i flugasken och slutar med den sista samlingen dagen. Under denna tid, är det rekommenderat att organisera ett schema för att komma ihåg alla de åtgärder som krävs för att upprätthålla en population flyga bur (Fig. 2), som beskrivs i protokollet avsnitt. Från den dag då äggen är seedade, tills de vuxna flugorna dyker upp, är det endast nödvändigt att inspektera plastlådan, och när pupation inträffar att placera dem inne i buren. Efter det, flugorna måste matas varje 2 - 3 dagar tills embryon sås ut för en ny cykel. I hela protokollet, är den längsta dagen under insamling och sådd av embryon för att starta en ny cykel. ens kommenterade i protokollet, är den bästa ägg avkastning 3 - 5 dagar efter vuxen eclosion, och slutligen avtar 2 dagar senare. Detta ger oss en viss flexibilitet för att välja den dag då skörden av äggen kommer att utföras.
Om du av någon anledning utbytet av insamlade embryon är mindre än den önskade utgångsbeloppet (1,5 g), en alltid kan lägga till en ny melass fack och samla in mer ägg nästa dag. För konstant samlingar, är det rekommenderat att behålla 2 burar parallellt, och om det krävs större mängder av embryon, även är det möjligt att använda större burar. I händelse av att göra korta tids samlingar, är ett sätt att öka utbytet för att dra nytta av den äggläggande skur på morgonen.
Det finns många fördelar med att samla in stora mängder av olika utvecklingsstadier. Till exempel, har samlats embryon från befolknings burar använts med stor framgång i immunfällningsanalyser 6-8, mass collection larver vävnader från dissocierade larver har visat sig vara en mycket bra källa för 3C experiment 4 och RNA-beredningar 15, och huvuden från vuxna flugor har använts för spån experiment 16. Dessutom är vuxna ofta behövs för att göra flyga extrakt för vävnadsodling 17.
En av de mest lovande tillämpningarna av buren är att tillhandahålla material för high-throughput assays som möjliggör analys och screening av gener, transkript, proteiner och metaboliter som svar på exponering av patogener, biologiska molekyler, kemiska ämnen och joniserande strålning. I dessa storskaliga analyser stort antal individer krävs och flugan befolkningen bur som beskrivs här kan vara till stor hjälp för att få stora mängder material under olika faser av Drosophila livscykeln för sin analys och screening 18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. Oxford. 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Drosophila RNAi Screening Center [Internet]. , Available from: http://www.flyrnai.org/DRSC-PRC.html (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
