溶瘤病毒的Transarterial管理局大鼠原位肝癌的局部治疗

Introduction

肝细胞癌（HCC）是世界上第五最常见的癌症，和与癌症有关的死亡的第三大原因，使其成为一个显著健康关注^1,2。对于谁是病人没有资格肿瘤切除术，或那些等待肝移植，局部治疗包括经动脉栓塞（TAE）或肝动脉化疗栓塞（TACE）应用于标准姑息治疗^3,4。这些疗法利用在肝脏肿瘤即是由肝动脉血流几乎完全喂双重血供的独特功能，而周围的肝脏受到多数来自门静脉^5,6其供血。

由于肝癌的治疗确立的极为有限的功效，溶瘤病毒已成为有前途的替代疗法。 JX-594，最近改名为Pexa-VEC，是胸苷激酶缺失牛痘病毒，具有粒米武装acrophage细胞集落刺激因子（GM-CSF），它已经完成了肝癌⁷ II期临床试验。最近，表达人干扰素-β的重组水泡性口炎病毒载体（VSV）已进入I期临床试验为索拉非尼耐火肝癌（NCT01628640）。作为溶瘤病毒靠拢经批准用于患者的临床应用为肝细胞癌，需要一个有效的给药途径对目标多焦点疾病是显而易见的。而全身性递送是很大程度上是无效的，由于低效肿瘤转导，瘤内的应用程序可能会限制疗法所注入的肿瘤的功效，留下uninjectable微观病变易患疾病的进展。

我们已经建立了分离大鼠肝动脉施用溶瘤病毒疗法在一个局部的方式定位到原位HCC的方法。我们已经证明，这种给药途径导致安全和effecti已经多焦点肝癌结节转导，导致免疫活性大鼠^8-10显著存活延长。这里，我们描述访问，解剖，并注入大鼠肝动脉的方法。该过程的图解示于图1（先前公布^9）

Protocol

注：已经按照我们机构的指导方针和德国巴伐利亚州的当地政府进行下面的步骤。所有尝试重现此协议必须在坚持进行与动物的人道待遇当地的指引，由当地动物护理和使用委员会的决定。例如，许多研究机构需要无菌手套被啮齿类手术期间磨损。此外，病毒工作必须按照当地的规定进行，注意个人和环境的安全。必须小心，以适当处理的被污染的废物和清洁工具和工作区（ 即，通过高压灭菌，并根据制造商的说明用适当的抗病毒消毒剂清洗）。

1.准备开始手术前

1. 消毒手术器械（即通过高压灭菌）。
2. 稀释病毒的appropr莱特浓度，这将取决于所使用的特定病毒的毒性和大鼠菌株的敏感性而变化。
   注意：例如，使用在雄性布法罗大鼠水泡性口炎病毒时，我们通常注入在1毫升体积，这是在该模型中的最大耐受剂量10 ⁷ pfu的。
   1. 预填病毒（使用无菌技术）的1ml注射器，并附加地下30针，注意从注射器和针头消除空​​气。
3. 制备具有所需的所有材料和设备的外科空间，并用乙醇消毒喷雾的区域。填写一个小插座用无菌生理盐水（0.9％氯化钠）为湿润的纱布拭子和棉签涂抹。

2.鼠的制备

1. 施用镇痛（如由当地动物护理和使用委员会指定），在适当的剂量30分钟开始的外科手术之前。例如，管理安乃近高剂量（100-200毫克/千克）。
2. 麻醉用吸入（异氟烷）或注射（ 即，美托咪定（0.15毫克/千克的混合物中），咪达唑仑（2毫克/千克），和芬太尼（0.005毫克/千克），也被称为MMF）麻醉大鼠。通过蒸发器在1-3％的管理isolflurane并根据需要调整，以维持正常的呼吸和心脏率。
   1. 在开始之前，确保大鼠完全镇静，无法按捏脚垫和观察的反应感到疼痛。
   2. 应用兽医眼膏，以防止在麻醉过程中干燥。
3. 从胸骨刮胡子腹部下降到只有用小兽推剪生殖器以上。请注意，以达到死里逃生不损伤皮肤。
4. 固定大鼠使用上fore-和后肢胶带手术床上，而且，如果采用吸入麻醉，将鼻子成适宜尺寸的鼻锥体。放置一个加热垫大鼠下方，以保持体温。消毒用外科手术级消毒剂腹部区域，接着是防腐涂料的醇冲洗和应用。

3.剖腹

1. 用小弯手术刀，如＃15，请直接沿中线皮肤层的小纵切口。延长切口到xyphoid过程。接着，用一对斜角肌挤压钳使手术刀切开轻轻抬起切开肌肉层，然后延长切口到手术剪刀xyphoid过程。小心不要刺破腹腔的器官或损坏的xyphoid过程两侧的小血管。
2. 将卷收器穿过腹部传播肌肉和皮肤和揭露整个腹部区域。
3. 滋润2 7.5×7.5 cm ²的纱布拭子用无菌生理盐水和分布在手术的最上面的一个开口和一个在底部，如在图2A所示。

4.隔离肝动脉

1. 使用用无菌生理盐水浸湿2湿棉签拭子，轻轻提起肠子和盲肠出腹腔，并将它们放置在较低的纱布拭。折叠的纱布上，以保持湿润的器官，并将其持有的出路。
2. 使用两个浸湿棉签拭子，轻轻抬起左外侧肝叶，这将是鉴于在这个阶段最主要的耳垂。翻转叶向上，而且，使用一个小的一对弹簧剪刀，通过纤维膜的波瓣的侧切割，允许叶向上被完全翻转并停留在先前放置纱布拭子的顶部。折叠的纱布拭过耳垂举行到位。
3. 与下一个叶（前尾状），这是目前在视图中最前叶继续。随着日在解剖显微镜和细镊子电子辅助，以释放它并允许它向上可自由翻转解剖薄膜周围的瓣。与左外叶放置纱布拭下的叶在一起。
4. 观察后尾叶，现在将是可见的。重复步骤4.3完全剖析后尾状叶和翻转它与先前放置肝叶向上纱布里面在一起。
5. 只是尾状叶的原始位置下方，发现肝总动脉，它现在将可见并通过其强脉动容易识别。继动脉解剖权，观察厚膜材料遮挡从视图中的胃和适当的肝动脉。用细镊子，提起这种材料，轻轻撕开，注意避免这方面的任何小血管。用棉签拭子停止任何可能发生的出血。
   1. 找到一个rterial分支，这将是清晰可见用解剖显微镜的帮助下，当膜被正确解剖。
6. 使用两个细，无损伤钳子，小心解剖肝总动脉，胃十二指肠动脉，以及适当的肝动脉，使得它们从周围的膜（ 图2B）被释放。

5.制备动脉注射液

1. 通过胃十二指肠动脉下方7-0普理灵缝合，并使用微针器在远端绑一个永久的结扎，只是分叉（参见图1为妥善安置）以上。允许残留在两端的缝合材料的大约2英寸，并用针固定器拉教导的动脉，如在图2C夹紧它们。
2. 放在肝总动脉暂时阻止血液流动（ 图2C）一个小夹子。
   注：这是小鬼ortant到一旦针头从动脉除去防止大量出血。此外，动脉血流的堵塞将允许更慢病毒施用和更好的转导效率。
   1. 重要的是：迅速地工作来限制血流停止的时间量 - 5分钟夹紧共同肝动脉内执行动脉的注入和后续的结扎。
3. 如果可能的话，增加对解剖显微镜的放大倍数，使得胃十二指肠动脉处于锐聚焦，并出现大到足以精确地插入地下30针。放置注射器的针头插入胃十二指肠动脉的内腔和对柱塞慢慢推。
   注意：在针的正确位置将导致直接通过适当的肝动脉和朝向肝中流动的注射溶液。
   1. 进行注射非常缓慢最大限度地传导效率。
<利>一旦整个注射体积已经施用，慢慢缩回从动脉针头。
注意：不应该有从注射部位出血。在该出血确实发生的情况下，它表明该夹具没有正确放置并应快速调整。

6.闭幕

1. 通过第二个7-0普理灵缝合胃十二指肠动脉下方，领带注射部位上方的第二永久结​​扎。
2. 除去从肝总动脉的夹子。确认通过对肝脏的肝固有动脉血流已恢复。
   1. 切连字有始有终。
3. 确认有返回肠和肝脏腹腔前无出血。以阑尾在其原来的方向返回的照顾。
4. 缝合使用4-0薇乔缝合材料用弯针独立层肌肉和皮肤。地方continuou小号缝合1mm左右分开，紧紧地拉。
   1. 在缝合阶段，施用的镇痛如丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。
5. 从麻醉中移除老鼠。如果异氟烷已被使用，大鼠应恢复在几分钟内意识。如果MMF已被用作可注射麻醉，用皮下注射阿替美唑（0.75毫克/千克），氟马西尼（0.2毫克/千克），和纳洛酮（9.12毫克/千克）的拮抗它，这将逆转麻醉的效果并让动物在20分钟内恢复意识。保持温暖的大鼠与红外暖灯在初始阶段觉醒。
   1. 无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。
   2. 不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。
6. 监测大鼠术后遇险的病理体征，和后续与止痛药的要求当地动物护理和使用委员会。例如，丁丙诺啡可以在0.05毫克施用/ kg，每12小时。

Representative Results

有经验的，一个近100％的成功率（意味着动脉被成功解剖并注射，和动物存活手术）就可以实现。然而，在手术前（肿瘤负荷程度，潜在肝功能等 ）的大鼠的健康状况将很显然，在外科干预的结果发挥作用。手术后，大鼠可以预期经历短暂的体重减轻和肝酶的轻微，短暂升高，即使单独的缓冲液，无病毒，注射。

我们先前已经证明了溶瘤性水泡性口炎病毒（VSV）或者在有效的肿瘤转导和肿瘤特异性病毒的复制，在原位，多灶性肝癌模型^-8,9-新城疫病毒（NDV）的结果的反式肝动脉给药。虽然这两种病毒在其肿瘤内动力学不同病毒复制的，在最大的病毒的复制，病毒繁殖的众多灶，就证明了LacZ报告基因阳性酶染色的各时间点，可专门内肝​​癌结节观察到的，而周围的肝脏没有表现出病毒的证据复制（ 图3和4中 ，此前公布的数据^8,9）。此外，随机选择的VSV-处理的肿瘤结节的形态测定分析表明，肿瘤转导效率不与肿瘤的大小（ 图3）相关。

此外，通过肝动脉递送治疗剂的能力，还提供了治疗与栓塞剂作为替代TACE结合的可能性。我们已经证明，通过在一个1混合溶瘤VSV：1的比例用淀粉降解的微球（DSM）栓塞剂和注入该悬浮液THRough肝动脉，我们可以实现大规模的大鼠肿瘤坏死非常显著的生存期延长轴承多发性结节肝癌^11。在DSM的反式肝动脉给药导致肿瘤结节的几乎完全栓塞，而对正常肝组织的灌注的影响最小，如通过动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）使用钆造影证实剂（ 图5，此前公布的数据^11）。

图1.肝动脉输注过程的示意图。肝血管（肝动脉，肝固有动脉，和胃十二指肠动脉）解剖用解剖显微镜的帮助。胃十二指肠动脉结扎和肝总动脉的时间块之后，1ml的PBS或VSV载体是通过适当的肝动脉经由胃十二指肠动脉给药。注射后，胃十二指肠动脉的近端部位结扎，以防止出血，肝总动脉的块被释放，肝血流量的recommencement被确认。这个数字，已经出版^9， 请点击这里查看该图的放大版本。

图2.肝动脉灌注过程的照片，一个剖腹鼠演示腹壁牵开器和纱布拭子（A）的位置。起重出肝叶，肝总动脉（指定CHA）和胃十二指肠动脉（指定GA）被识别和DIS后剪刀剪下（B）。结扎胃十二指肠动脉的远端后，将肝总动脉被暂时夹持（℃）。胃十二指肠动脉现在可以进行注射。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.转导和肝动脉给药后VSV的肿瘤选择性复制大鼠轴承多灶性肝癌。动物套装（N = 3 /时间点）在后第1天，病毒在30分钟和（B）牺牲（A）输液，并冷冻肝切片进行β-gal的表达。代表性的部分被以低（左）和更高的放大倍数（右）示出。箭头指示肿瘤病灶和HEPA之间的边界抽动实质。肿瘤大小与转染效率之间的（C）的关系。 HCC-含有肝切片进行形态测定分析进行分析以定量总肿瘤和X-gal的阳性区域。这个数字，已经出版^9， 请点击这里查看该图的放大版本。

图4. NDV / F3aa（L289A）处理导致肿瘤特异性的病毒复制在肝细胞癌（HCC）-bearing大鼠雄性布法罗大鼠轴承灶性原位HCC结节用rNDV / F3aa（L289A）（10 ⁸ TCID _50）处理肝动脉灌注，并在指定的时间点杀后处理（N = 3）。肝脏切片含肿瘤受到对β-gal染色。代表性的部分是在5X（概述）和20X（肿瘤和肝段的放大倍数）的放大倍率所示。病毒滴度通过肝和肿瘤裂解物的TCID ₅₀分析进行定量，并表示为平均值±SD。 NDV，新城疫病毒; TCID _50，50％组织培养感染剂量。请注意，这个数字已经从原来的形式⁸修改。这个数字，已经出版^8。 请点击此处查看本图的放大版本。

栓塞肝癌。MCA-RH7777荷瘤鼠，无论是nonembolized或肝动脉栓塞后，帝斯曼30分钟， 图5.动态对比增强磁共振成像与DCE-MRI进行成像。 （<STRONG> A）轴向T1称重平扫（A，C）及增强（B，D）图像显示缺乏栓塞肿瘤结节（D）的对比。 （B）中的数据进行定量中的肿瘤结节和邻近的正常肝组织的利益大小相等的区域测量的灰阶信号强度进行分析。一位代表数据集显示。这个数字，已经出版^11。 请点击此处查看本图的放大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary clippers	Aesculap	GT415	Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
30 G Needles	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml syringes	Braun	9161406V	Tuberculin syringe
Disposable scalpel	Feather	2975#15	#15 blade
Standard surgical scissors	Fine Science Tools	14001-13	Sharp/blunt, for opening skin and muscle
Adson forcep	Fine Science Tools	1101-12	With teeth, for grasping skin and muscle
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery
Gauze swabs	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use
Cotton-tipped applicator swabs	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Fine-tipped foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09	For delicate cutting
Micro-needle holder	Fine Science Tools	12076-12	For ligating gastroduodenal artery
Needle holder	Fine Science Tools	12005-15	Tungsten carbide jaws
7-0 Prolene sutures	Ethicon	8648H	Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery
4-0 Vicryl sutures	Ethicon	V3040H	With curved needle attached
Infrared warming lamp	Beurer	IL11	For maintaining body temperature post-operatively