Introduction
Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est le cinquième cancer le plus répandu dans le monde entier, et la troisième principale cause de décès lié au cancer, ce qui en fait un problème de santé important 1,2. Pour les patients qui ne sont pas admissibles pour la résection de la tumeur, ou ceux qui attendent une transplantation du foie, la thérapie locorégionale impliquant embolisation transarterial (TAE) ou chimioembolisation transarterial (TACE) sont appliquées en soins palliatifs norme 3,4. Ces thérapies exploitent la caractéristique unique de double alimentation de sang dans le foie par lequel les tumeurs sont nourris presque exclusivement par débit sanguin hépatique artérielle, tandis que le foie environnante reçoit la majorité de son approvisionnement en sang de la veine 5,6.
En raison des efficacités très limitées de thérapies établies pour HCC, les virus oncolytiques ont émergé comme thérapeutiques alternatives prometteuses. JX-594, récemment rebaptisé Pexa-Vec, est un vecteur de la vaccine kinase supprimé thymidine, armés de granulocytes-macrophage facteur de stimulation des colonies (GM-CSF), qui a terminé la phase II des essais cliniques pour le HCC 7. Plus récemment, un vecteur recombinant vésiculaire virus de la stomatite (VSV) exprimant l'interféron-bêta humain est entré dans une phase I d'essai clinique pour sorafenib réfractaire HCC (NCT01628640). En tant que virus oncolytiques à se rapprocher d'obtenir l'approbation pour une application clinique pour le HCC chez les patients, la nécessité d'une voie d'administration efficace pour cibler la maladie multifocale est évidente. Bien que l'administration systémique est largement inefficace en raison de la transduction de la tumeur inefficace, applications intratumoral pourraient limiter l'efficacité de la thérapie à la tumeur injectée, laissant des lésions microscopiques uninjectable sensibles à la progression de la maladie.
Nous avons établi un procédé d'isolement de l'artère hépatique chez le rat pour administrer la thérapie de virus oncolytique de façon locorégionale de cibler HCC orthotopique. Nous avons démontré que cette voie d'administration des résultats dans sûr et efficave transduction des nodules de CHC multifocales, ce qui entraîne une prolongation significative de la survie chez les rats immunocompétents 8-10. Ici, nous décrivons la méthode d'accès, à disséquer et à injecter dans l'artère hépatique chez le rat. Un schéma de la procédure est illustrée à la figure 1 (déjà publié 9)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Remarque: Les étapes suivantes ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices de notre institution et le gouvernement local de la Bavière, en Allemagne. Toutes les tentatives pour reproduire ce protocole doivent être faites dans le respect des directives locales concernant le traitement humain des animaux, comme dicté par les soins des animaux locaux et comité d'utilisation. Par exemple, de nombreux instituts exigent que des gants stériles sont portés pendant la chirurgie des rongeurs. En outre, le travail avec des virus doit être effectuée conformément aux réglementations locales, en prenant soin de la sécurité personnelle et environnementale. Des précautions doivent être prises pour éliminer correctement les déchets contaminés et nettoyer les instruments et espace de travail (c. -à- par autoclavage et le nettoyage avec un désinfectant antiviral approprié selon les instructions du fabricant).
1. Préparatifs avant la chirurgie Commençant
- Stériliser les instruments chirurgicaux (ie, par autoclavage).
- On dilue le virus à approprla concentration iate, qui variera en fonction de la toxicité du virus spécifique utilisé et de la sensibilité de la souche de rat.
Note: Par exemple, quand on utilise le virus de la stomatite vésiculaire chez les rats Buffalo, on injecte généralement de 10 7 pfu dans un volume de 1 ml, ce qui correspond à la dose maximale tolérée dans ce modèle.- Préremplir le virus (en utilisant une technique aseptique) dans 1 ml de seringues, et joindre les 30 G aiguilles, en prenant soin d'éliminer l'air de la seringue et l'aiguille.
- Préparer l'espace chirurgical avec tous les matériaux et l'équipement nécessaires, et pulvériser la zone avec de l'éthanol pour désinfecter. Remplir un petit récipient avec une solution saline stérile (NaCl à 0,9%) pour humidifier compresses de gaze et applicateurs de coton-tige.
2. Préparation du Rat
- Administrer un analgésique (comme spécifié par le comité de protection des animaux et l'utilisation locale), à la dose appropriée 30 min avant le début de l'intervention chirurgicale. Par exemple,administrer une dose élevée de metamizole (100-200 mg / kg).
- Anesthésier le rat par inhalation (isoflurane) ou par injection ( par exemple, un mélange de médétomidine (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg) et de fentanyl (0,005 mg / kg), également connu sous le nom MMF) l' anesthésie. Administrer isolflurane à travers un vaporisateur à 1-3% et ajuster si nécessaire pour maintenir la respiration normale et la fréquence cardiaque.
- Avant de continuer, assurez-vous que le rat est complètement sous sédation et incapable de ressentir la douleur en pinçant le coussinet plantaire et en observant une réaction.
- Appliquer une pommade vétérinaire oculaire pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
- Rasez la zone abdominale du sternum vers le bas juste au-dessus des organes génitaux à l'aide d'une petite tondeuse à cheveux vétérinaire. Prenez soin de réaliser un rasage de près sans blesser la peau.
- Fixer le rat au lit chirurgicale en utilisant du ruban sur le membres antérieurs et postérieurs, et, si vous utilisez l'anesthésie par inhalation, placer le museau dans un cône de nez de taille appropriée. Placez un coussin chauffantsous le rat pour maintenir la température corporelle. Désinfecter la zone abdominale à l'aide d'un désinfectant de qualité chirurgicale, suivie d'un rinçage à l'alcool et à l'application d'une peinture antiseptique.
3. laparotomie
- En utilisant un petit scalpel courbe, par exemple # 15, une petite incision verticale dans la couche de peau directement le long de la ligne médiane. Prolongez l'incision jusqu'à le processus xiphoïde. Ensuite, inciser la couche musculaire en soulevant doucement avec une paire de pinces Adson pour faire une incision de scalpel, puis étendre l'incision jusqu'au processus xiphoïde avec des ciseaux chirurgicaux. Prenez soin de ne pas percer les organes de la cavité abdominale ou endommager les petits vaisseaux de chaque côté du processus xiphoïde.
- Placer un écarteur sur l'abdomen pour répandre le muscle et la peau et d'exposer l'ensemble de la région abdominale.
- Humidifiez deux 7,5 x 7,5 cm 2 tampons de gaze avec du sérum physiologique stérile et répandre un à travers le haut de la chirurgieet une ouverture à travers le fond, comme représenté sur la figure 2A.
4. Isolement de l'artère hépatique
- En utilisant deux tampons applicateurs de coton humidifiés humidifiés avec du sérum physiologique stérile, soulevez doucement les intestins et caecum hors de la cavité abdominale, et les placer sur le tampon de gaze inférieure. Pliez la gaze sur de garder les organes humide et de les tenir à l'écart.
- En utilisant deux humidifiés tampons de coton applicateurs, soulevez doucement le lobe du foie latéral gauche, qui sera le lobe le plus prédominant en vue à ce stade. Retournez le lobe vers le haut, et, en utilisant une petite paire de ciseaux à ressort, couper à travers la membrane fibreuse sur la face inférieure du lobe, permettant le lobe d'être complètement basculé vers le haut et se reposer sur le dessus du tampon de gaze placé précédemment. Pliez le tampon de gaze sur le lobe de le maintenir en place.
- Continuer avec le lobe suivant (le caudé antérieur), qui est maintenant le lobe plus antérieur en vue. Avec ee l'aide d'un microscope à dissection et une pince fine, disséquer la fine membrane entourant le lobe afin de le libérer et lui permettre d'être librement basculé vers le haut. Placez le lobe sous le tampon de gaze avec le lobe latéral gauche.
- Observer le lobe caudé postérieur, qui va maintenant être visible. Répétez l'étape 4.3 de disséquer complètement le caudé lobe postérieur et retourner vers le haut et à l'intérieur de la gaze avec les lobes du foie placés précédemment.
- Juste en dessous de la position d'origine du lobe caudé, trouver l'artère hépatique commune, qui va maintenant être visible et facilement reconnaissable par sa forte pulsation. Après l'artère vers la droite anatomique, observer la matière membraneuse épaisse obscurcit les artères hépatiques gastroduodénaux et appropriées de la vue. En utilisant une pince fine, soulever ce matériel et déchirer doucement, en prenant soin d'éviter les petits vaisseaux dans ce domaine. Utiliser des écouvillons de coton applicateurs pour arrêter tout saignement qui pourrait se produire.
- Localisez la unerterial branches, qui sont bien visibles à l'aide d'un microscope à dissection lorsque les membranes sont correctement disséqués.
- L' utilisation de deux fines pinces atraumatiques, disséquer soigneusement l'artère hépatique commune, artère gastro - duodénale, et l'artère hépatique propre tels qu'ils sont libérés des membranes entourant (figure 2B).
5. Préparation de l'artère pour injection
- Passez une Prolene suture 7-0 sous l'artère gastro - duodénale, et utiliser une aiguille porte micro-attacher une ligature permanente à l'extrémité distale, juste au- dessus de la bifurcation (voir la figure 1 pour un placement correct). Permettre à environ 2 pouces de matériau de suture restant sur les extrémités et les serrer avec un porte-aiguille pour tirer l'artère enseignée, comme sur la figure 2C.
- Placer une petite pince sur l'artère hépatique commune pour bloquer temporairement le flux sanguin (figure 2C).
Note: Ceci est important pour prévenir une hémorragie massive, une fois que l'aiguille est retirée de l'artère. En outre, le blocage du flux sanguin artériel permettra une lente administration virale et une meilleure efficacité de transduction.- Important: Travaillez rapidement pour limiter la quantité de temps que le flux sanguin est arrêté - effectuer l'injection et la ligature ultérieure de l'artère à 5 min de serrage de l'artère hépatique commune.
- Si cela est possible, d'augmenter le grossissement du microscope à dissection, de telle sorte que l'artère gastroduodénale est mise au point précise et semble assez grand pour insérer avec précision l'aiguille G 30. Placer l'aiguille de la seringue d'injection dans la lumière de l'artère gastroduodénale et pousser doucement sur le piston.
Remarque: Le positionnement correct de l'aiguille se traduira par la solution injectée coule directement dans l'artère hépatique propre et vers le foie.- Effectuer l'injection très lentement pour maximiser l'efficacité de transduction.
<li> Une fois que le volume d'injection entier a été administrée, se rétracte lentement l'aiguille de l'artère.
Note: Il devrait y avoir aucun saignement à partir du site d'injection. Dans le cas où le saignement ne se produit, cela signifie que la pince ne sont pas correctement placé et doit être ajustée rapidement.
6. clôture
- Passez une seconde 7-0 Prolene suture sous l'artère gastro-duodénale, et attacher une deuxième ligature permanente au-dessus du site d'injection.
- Retirer la pince de l'artère hépatique commune. Assurez-vous que le flux sanguin dans l'artère hépatique propre vers le foie a été restauré.
- Couper les extrémités libres des ligatures.
- Vérifiez qu'il n'y a pas de saignement avant de retourner les intestins et le foie dans la cavité abdominale. Veillez à ce que l'appendice est retourné dans son orientation d'origine.
- Suturer le muscle et la peau dans des couches séparées à l'aide du matériel de suture 4-0 Vicryl avec une aiguille courbe. Lieu continuous sutures environ 1 mm de distance et tirez fermement.
- Pendant la phase de formation de sutures, d'administrer un analgésique tel que la buprénorphine (0,05 mg / kg).
- Retirer le rat de l'anesthésie. Si isoflurane a été utilisé, le rat doit reprendre conscience en quelques minutes. Si le MMF a été utilisé comme une anesthésie injectable, antagoniser avec une injection sous-cutanée d'atipamézole (0,75 mg / kg), le flumazénil (0,2 mg / kg) et de la naloxone (9,12 mg / kg), ce qui inverse les effets de l'anesthésie et permettre aux animaux de retrouver la conscience dans les 20 min. Gardez rats chauds avec une lampe chauffante à infrarouge pendant la phase de réveil initiale.
- Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
- Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
- Surveiller les rats post-opératoire pour les signes pathologiques de détresse, et le suiviavec des analgésiques comme l'exige le comité de protection des animaux et l'utilisation locale. Par exemple, la buprénorphine peut être administré à 0,05 mg / kg toutes les 12 heures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avec l'expérience, un taux de réussite de près de 100% (ce qui signifie que l'artère a été disséqué avec succès et injecté, et l'animal a survécu à la chirurgie) peut être atteint. Cependant, l'état de santé du rat avant la chirurgie (degré de charge de la tumeur, la fonction hépatique sous - jacente, etc.) sera évidemment jouer un rôle dans le résultat de l'intervention chirurgicale. Après la chirurgie, les rats peuvent être attendus à une perte de poids transitoire et une légère élévation transitoire des enzymes hépatiques, même si le tampon seul, sans virus, a été injecté.
Nous avons précédemment démontré que l' administration artérielle trans-hépatique du oncolytique du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) ou le virus de la maladie de Newcastle (NDV) se traduit par une transduction tumorale efficace et la réplication du virus spécifique d' une tumeur, dans un orthotopique, multifocale modèle CHC 8,9. Bien que les deux virus diffèrent dans leur cinétique intratumoralde la réplication virale, aux points temporels de la réplication virale maximale, de nombreux foyers de propagation du virus, comme le montre la coloration enzymatique positif pour le gène rapporteur LacZ respectifs, a pu être observé exclusivement à l'intérieur des nodules HCC, tandis que les foies environnants ne présentaient aucun signe de virus la réplication (figure 3 et 4, les données publiées antérieurement 8,9). En outre, l' analyse morphométrique des nodules de tumeur traitées avec du VSV choisis au hasard ont démontré que l' efficacité de transduction de la tumeur ne se corrèle pas avec la taille de la tumeur (figure 3).
En outre, l'aptitude à délivrer des agents thérapeutiques à travers l'artère hépatique offre également la possibilité de combiner le traitement avec un agent d'embolisation comme une alternative à la TACE. Nous avons démontré que, par mélange oncolytiques du VSV à un rapport 1: 1 avec une microsphère d'amidon dégradable (DSM) Agent d'embolisation et de perfuser la suspension ThrOugh l'artère hépatique, nous pourrions réaliser une nécrose tumorale massive et très importante prolongation de la survie chez les rats portant HCC multifocale nodules 11. l'administration artérielle trans-hépatique du DSM a donné lieu à une embolisation presque complète de nodules de tumeur, tout en ayant un effet minimal sur la perfusion de tissu hépatique normal, comme le montre l'imagerie par résonance magnétique à contraste amélioré dynamique (DCE-MRI) en utilisant un contraste à base de gadolinium Agent (Figure 5, les données 11 précédemment publié).
Figure 1. Représentation schématique de la procédure hépatique de la perfusion artérielle. Les vaisseaux hépatiques (de l' artère hépatique commune, l' artère hépatique propre, et l' artère gastro - duodénale) sont disséqués à l'aide d'un microscope à dissection. Après ligature de l'artère gastro-duodénale et le bloc temporel de l'artère hépatique commune,1 ml de PBS ou VSV vecteur sont administrés par l'intermédiaire de l'artère gastroduodénale par l'artère hépatique adéquate. Après l'injection, le site proximal de l'artère gastroduodénale est ligaturé afin d'éviter des saignements, le bloc de l'artère hépatique commune est libérée, et la reprise du flux sanguin hépatique est confirmée. Ce chiffre a été publié précédemment 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Photographies de la procédure de perfusion artérielle hépatique. Un rat laparotomisés démontre le placement des rétracteurs de paroi et gaze écouvillons abdominaux (A). Après avoir soulevé les lobes hépatiques, l'artère hépatique commun (CHA désigné) et de l'artère gastroduodénale (GA désignée) sont identifiés et disdisséqués (B). Après ligature de l'extrémité distale de l'artère gastroduodénale, l'artère hépatique commune est temporairement bloqué (C). L'artère gastro - duodénale est maintenant prête pour l' injection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. transduction et la réplication de tumeur sélective de VSV après l' administration de l' artère hépatique chez des rats porteurs HCC multifocale. Ensembles d'animaux (n = 3 / point de temps) ont été sacrifiés (A) à 30 min et (B) au jour 1 post-virus sections de perfusion, et le foie congelé ont été colorées pour l'expression β-gal. sections représentatives sont indiquées au bas (à gauche) et supérieur grossissements (à droite). Les flèches indiquent les frontières entre les lésions tumorales et hepaparenchyme tic. (C) Relation entre la taille de la tumeur et l' efficacité de transduction. coupes de foie de HCC contenant ont été analysées par analyse morphométrique pour quantifier la tumeur totale et les zones de X-gal-positives. Ce chiffre a été publié précédemment 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. NDV / F3aa (L289A) Résultats de traitement dans la réplication virale spécifique de la tumeur dans le carcinome hépatocellulaire (HCC) , des rats -bearing. Des rats mâles Buffalo portant multifocales nodules HCC orthotopique ont été traités avec rNDV / F3aa (L289A) (10 8 TCID 50) par perfusion artérielle hépatique, et tué à l'heure indiquée points de post-traitement (n = 3). sections de foie contenant la tumeur ont été soumisà la ß-gal coloration. Des sections représentatives sont présentés à 5X (aperçu) et 20X (grossissement de coupes de tumeur et foie) grossissement. Les titres viraux ont été quantifiés par une analyse TCID50 du foie et des tumeurs lysat, et sont exprimés par la moyenne ± écart - type. NDV, le virus de la maladie de Newcastle; DICT 50, la dose infectieuse de culture tissulaire à 50%. Remarque, cette figure a été modifiée de sa forme originale 8. Ce chiffre a été publié précédemment 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Dynamique imagerie par résonance magnétique à contraste amélioré des rats embolisés HCC. Mca-RH7777 portant une tumeur, soit nonembolized ou 30 min après l' embolisation artérielle hépatique avec DSM, ont été imagée avec DCE-MRI. (<strong> A) précontraste Axial T1-pesé (a, c) et après injection (b, d) les images montrent le manque de contraste dans les nodules tumoraux embolisés (d). (B) Les données ont été analysé quantitativement en mesurant l' intensité du signal d'échelle de gris dans les régions de taille égale d'intérêt des nodules tumoraux et tissu normal adjacent du foie. Un ensemble de données représentatif est montré. Ce chiffre a été publié antérieurement 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
