Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il quinto tumore più diffuso in tutto il mondo, e la terza causa di morte per cancro, che lo rende un problema significativo di salute 1,2. Per i pazienti che non sono ammissibili per la resezione del tumore, o di quelli in attesa di trapianto di fegato, terapia locoregionale coinvolgendo embolizzazione transarteriosa (TAE) o transarteriosa chemioembolizzazione (TACE) sono applicati come standard cure palliative 3,4. Queste terapie sfruttano la caratteristica unica di doppia alimentazione di sangue nel fegato per cui i tumori sono alimentati quasi esclusivamente da epatica flusso di sangue arterioso, mentre il fegato circostante riceve la maggior parte del suo apporto di sangue dalla vena porta 5,6.
A causa delle efficacies estremamente limitate di terapie stabilite per HCC, i virus oncolitici sono emersi come terapie alternative promettenti. JX-594, recentemente rinominato Pexa-Vec, è una timidina chinasi-cancellato vaccino vettore, armato di granulociti-macrophage fattore stimolante le colonie (GM-CSF), che ha completato la fase II della sperimentazione clinica per il carcinoma epatocellulare 7. Più di recente, un vescicolare vettore ricombinante virus della stomatite (VSV) che esprime l'interferone-beta umano è entrato in una fase I di sperimentazione clinica per il carcinoma epatocellulare sorafenib-refrattario (NCT01628640). Come i virus oncolitici si avvicinano a ottenere l'approvazione per l'applicazione clinica per il carcinoma epatocellulare nei pazienti, la necessità di una efficace via di somministrazione di indirizzare la malattia multifocale è evidente. Mentre la consegna sistemica è in gran parte inefficace a causa di trasduzione del tumore inefficiente, applicazioni intratumorale potrebbe limitare l'efficacia della terapia per il tumore iniettato, lasciando lesioni microscopiche uninjectable sensibili alla progressione della malattia.
Abbiamo stabilito un metodo per isolare l'arteria epatica nei ratti di somministrare la terapia virus oncolitici in maniera locoregionale per indirizzare HCC ortotopico. Abbiamo dimostrato che questa rotta amministrazione si traduce in sicurezza e effective trasduzione del multifocali noduli di HCC, con conseguente significativo prolungamento della sopravvivenza in topi immuno competenti 8-10. Qui, descriviamo il metodo di accesso, dissezione, e l'iniezione nell'arteria epatica nei ratti. Uno schema del procedimento è mostrato in Figura 1 (precedentemente pubblicato 9)
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Protocol
Nota: sono state eseguite le seguenti operazioni in conformità con le linee guida della nostra istituzione e il governo locale di Baviera, in Germania. Tutti i tentativi di riprodurre questo protocollo devono essere effettuati in aderenza con le linee guida locali per il trattamento umano degli animali, come dettato dalla cura degli animali locale e comitato uso. Ad esempio, molti istituti richiedono che guanti sterili sono indossati durante l'intervento roditore. Inoltre, il lavoro con i virus deve essere effettuata secondo le normative locali, facendo attenzione per la sicurezza personale ed ambientale. Si deve prestare attenzione al corretto smaltimento dei rifiuti contaminati e per pulire gli strumenti e spazio di lavoro (ad esempio, in autoclave e la pulizia con un disinfettante antivirale appropriata in base alle istruzioni del produttore).
1. Preparativi prima dell'intervento chirurgico Beginning
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (vale a dire, in autoclave).
- Diluire il virus al approprconcentrazione iate, che variano a seconda della tossicità del virus specifico utilizzato e la suscettibilità del ceppo di ratto.
Nota: Per esempio, quando si utilizzano virus della stomatite vescicolare nei ratti maschi Buffalo, di solito Iniettare 10 7 PFU in un volume 1 ml, che è la dose massima tollerata in quel modello.- Precompilare il virus (utilizzando una tecnica asettica) in 1 ml siringhe, aghi e allegare 30 G, avendo cura di eliminare l'aria dalla siringa e l'ago.
- Preparare lo spazio chirurgico con tutti i materiali e le attrezzature necessarie, e spruzzare la zona con etanolo per disinfettare. Riempire un piccolo recipiente con soluzione salina sterile (0,9% NaCl) per inumidire i tamponi di garza e applicatori con punta in cotone.
2. Preparazione del Rat
- Somministrare un analgesico (come specificato dalla commissione cura degli animali e uso locale), al appropriata dose di 30 min prima di iniziare la procedura chirurgica. Per esempio,somministrare una dose elevata di metamizolo (100-200 mg / kg).
- Anestetizzare il topo mediante inalazione (isoflurano) o iniettabili (cioè, una miscela di medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), e fentanil (0,005 mg / kg), noto anche come MMF) anestesia. Amministrare isolflurane attraverso un vaporizzatore al 1-3% e regolare come necessario per mantenere la respirazione normale e la frequenza cardiaca.
- Prima di procedere, assicurarsi che il ratto è completamente sedato e in grado di sentire dolore pizzicando il rilievo del piede e osservando una reazione.
- Applicare una pomata occhio veterinaria per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Radere la zona addominale dallo sterno verso il basso per appena sopra i genitali con un piccolo tagliatore di capelli veterinaria. Fare attenzione per ottenere una rasatura senza ferire la pelle.
- Fissare il ratto al letto chirurgico con del nastro sulla zampe anteriori e posteriori, e, se si utilizza l'anestesia per inalazione, mettere il muso in un cono di dimensioni adeguate. Posizionare una piastra elettricasotto il topo per mantenere la temperatura corporea. Disinfettare la zona addominale utilizzando un disinfettante grado chirurgico, seguito da un risciacquo di alcol e l'applicazione di una vernice antisettica.
3. laparotomia
- Usando un piccolo bisturi curvo, ad esempio # 15, fare una piccola incisione verticale nello strato pelle direttamente lungo la linea mediana. Estendere l'incisione fino al processo xifoideo. Avanti, incidere lo strato muscolare delicatamente sollevando con un paio di pinze Adson per fare un'incisione bisturi, e quindi estendere l'incisione fino al processo xifoideo con le forbici chirurgiche. Fare attenzione a non forare organi della cavità addominale o danneggiare i piccoli vasi su entrambi i lati del processo xifoideo.
- Posizionare un divaricatore attraverso l'addome per diffondere il muscolo e pelle ed esporre l'intera zona addominale.
- Inumidire due 7,5 x 7,5 cm 2 tamponi di garza con soluzione fisiologica sterile e diffondere uno nella parte superiore della chirurgicaapertura ed una parte inferiore, come mostrato nella Figura 2A.
4. Isolamento dell'arteria epatica
- Utilizzando due tamponi di cotone imbevuto applicatori inumiditi con soluzione fisiologica sterile, sollevare delicatamente l'intestino e cieco fuori della cavità addominale, e metterli sul tampone di garza inferiore. Piegare la garza sopra per mantenere gli organi umido e di tenerli fuori del modo.
- Utilizzando due tamponi di cotone inumiditi applicatori, sollevare delicatamente il lobo epatico laterale sinistro, che sarà il lobo più predominante in considerazione in questa fase. Vibrazione lobo verso l'alto, e, utilizzando un piccolo paio di forbici primavera, tagliare la membrana fibrosa sul lato inferiore del lobo, permettendo il lobo di essere completamente capovolta verso l'alto e riposo sopra il tampone di garza precedentemente posizionato. Piegare il tampone di garza sopra il lobo per tenerlo in posizione.
- Continuare con la prossima lobo (caudato anteriore), che è ora il lobo più anteriore in vista. con esimoe aiuto di un microscopio da dissezione e pinza sottile, sezionare la sottile membrana che circonda il lobo per rilasciarlo e farlo liberamente capovolto verso l'alto. Posizionare il lobo sotto il tampone di garza insieme con il lobo laterale sinistro.
- Osservare il lobo posteriore caudato, che sarà ora visibile. Ripetere il passaggio 4.3 di sezionare completamente il caudato lobo posteriore e flip verso l'alto e dentro la garza con i lobi del fegato precedentemente posizionati.
- Appena sotto la posizione originaria del lobo caudato, trovare l'arteria epatica comune, che sarà ora visibile e facilmente riconoscibile per la sua forte pulsazioni. Dopo l'arteria verso destra anatomica, osservare il materiale membranoso spessore oscurare le arterie epatiche gastroduodenali e propri da vista. Utilizzando una pinza sottile, sollevare questo materiale e delicatamente strappare, avendo cura di evitare eventuali piccoli vasi in questo settore. Usare tamponi di cotone applicatori per fermare qualsiasi emorragia che potrebbero verificarsi.
- Individuare l'unarami rterial, che sarà ben visibile con l'aiuto di un microscopio da dissezione quando le membrane siano correttamente sezionati.
- Utilizzando due fini, pinze atraumatiche, sezionare con cura l'arteria epatica comune, l'arteria gastroduodenale, e l'arteria epatica adeguata in modo tale che essi sono liberati dalle membrane che circondano (Figura 2b).
5. Preparazione della Artery iniettabile
- Passare un Prolene di sutura 7-0 sotto l'arteria gastroduodenale, e utilizzare un micro-ago-titolare di legare una legatura permanente alla fine distale, appena sopra la biforcazione (vedi Figura 1 per il corretto posizionamento). Attendere circa 2 pollici di materiale di sutura rimanenti sulle estremità, e bloccare con un supporto dell'ago per tirare l'arteria insegnato, come in Figura 2C.
- Mettere un piccolo morsetto sulla arteria epatica comune per bloccare temporaneamente il flusso di sangue (Figura 2C).
Nota: Questo è important evitare sanguinamento massivo volta l'ago viene rimosso dalla arteria. Inoltre, il blocco del flusso di sangue arterioso permette la somministrazione virus lento e migliore efficienza di trasduzione.- Importante: Lavorare velocemente per limitare la quantità di tempo che il flusso di sangue viene arrestata - effettuare l'iniezione e la successiva legatura dell'arteria entro 5 minuti bloccaggio dell'arteria epatica comune.
- Se possibile, aumentare l'ingrandimento del microscopio da dissezione, tale che l'arteria gastroduodenale è a fuoco e sembra abbastanza grande per inserire con precisione il ago G 30. Inserire l'ago della siringa nel lume dell'arteria gastroduodenale e lentamente spingere lo stantuffo.
Nota: posizionamento corretto dell'ago comporterà la soluzione iniettata scorre direttamente attraverso il corretto arteria epatica e verso il fegato.- Eseguire l'iniezione molto lentamente per massimizzare l'efficienza di trasduzione.
<li> Una volta che l'intero volume di iniezione è stato somministrato, retrarre lentamente l'ago dalla arteria.
Nota: Non ci dovrebbero essere sanguinamento dal sito di iniezione. Nel caso che il sanguinamento si verifica, indica che il morsetto non è correttamente posizionato e deve essere regolato rapidamente.
6. chiusura
- Passare un secondo 7-0 Prolene sutura sotto l'arteria gastroduodenale, e legare una seconda legatura permanente al di sopra del sito di iniezione.
- Rimuovere la fascetta dalla arteria epatica comune. Verificare che il flusso di sangue attraverso l'arteria epatica corretto verso il fegato è stata ripristinata.
- Tagliare le estremità delle legature.
- Verificare che non vi è alcun sanguinamento, prima di tornare l'intestino e il fegato alla cavità addominale. Fare attenzione che l'appendice viene restituito il suo orientamento originale.
- Suturare la muscolo e pelle in strati separati utilizzando 4-0 Vicryl materiale di sutura con un ago curvo. luogo fissa Sus suture di circa 1 mm l'uno dall'altro e tirare con forza.
- Durante la fase di sutura, somministrare un analgesico come buprenorfina (0,05 mg / kg).
- Rimuovere ratto dall'anestesia. Se è stato utilizzato isoflurano, il ratto dovrebbe riprendere conoscenza in pochi minuti. Se MMF è stato usato come una anestesia iniettabile, antagonizzare con un'iniezione sottocutanea di atipamezolo (0,75 mg / kg), flumazenil (0,2 mg / kg), e naloxone (9.12 mg / kg), che invertire gli effetti dell'anestesia e consentire agli animali di recuperare la coscienza entro 20 min. Mantenere ratti caldo con una lampada a raggi infrarossi riscaldamento durante la fase di risveglio iniziale.
- Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
- Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
- Monitorare ratti post-operatoria per i segni patologici di disagio, e followcon analgesici, come richiesto dalla commissione cura degli animali e uso locale. Ad esempio, la buprenorfina può essere somministrato a 0,05 mg / kg ogni 12 ore.
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Representative Results
Con l'esperienza, un tasso di successo quasi il 100% (il che significa che l'arteria è stato dissezionato successo e iniettata, e l'animale sopravvissuto chirurgico) può essere raggiunto. Tuttavia, lo stato di salute del ratto prima dell'intervento chirurgico (grado di carico tumorale, la funzione epatica sottostante, etc.) sarà ovviamente un ruolo nel risultato dell'intervento chirurgico. Dopo l'intervento chirurgico, i ratti può aspettare che una perdita di peso transitoria e una leggera, innalzamento transitorio degli enzimi epatici, anche se tampone da solo, senza virus, è stato iniettato.
Abbiamo precedentemente dimostrato che la somministrazione arteriosa trans-epatica di oncolytic virus della stomatite vescicolare (VSV) o virus della malattia di Newcastle (NDV) si traduce in efficienza di trasduzione del tumore e la replicazione del virus tumore-specifica, in un ortotopico, multifocale modello HCC 8,9. Anche se i due virus differiscono nella loro cinetica intratumoraledi replicazione del virus, in corrispondenza dei rispettivi punti temporali di replicazione del virus massima, numerosi focolai di propagazione del virus, come evidenziato dalla colorazione enzimatica positivo per il gene reporter LacZ, potrebbe essere osservata esclusivamente all'interno noduli di HCC, mentre il fegato circostanti hanno mostrato alcuna prova di virus replica (Figura 3 e 4, precedentemente pubblicati dati 8,9). Inoltre, l'analisi morfometrica dei noduli tumorali VSV trattati selezionati casualmente dimostrato che l'efficienza di trasduzione del tumore non correla con dimensioni del tumore (Figura 3).
Inoltre, la capacità di fornire agenti terapeutici attraverso l'arteria epatica offre anche la possibilità di combinare la terapia con un agente embolizzazione come alternativa alla TACE. Abbiamo dimostrato che, miscelando oncolytic VSV ad un rapporto 1: 1 con una microsfera amido degradabile (DSM) agente embolizzazione e infondendo il thr sospensioneough l'arteria epatica, potremmo ottenere necrosi tumorale enorme e molto significativo prolungamento della sopravvivenza nei ratti cuscinetto multifocale HCC noduli 11. somministrazione arteriosa trans-epatico del DSM comportato una embolizzazione quasi completa dei noduli tumorali, pur avendo un effetto minimo sulla perfusione normale tessuto epatico, come dimostrato dalla dinamica risonanza magnetica con contrasto (DCE-MRI) utilizzando un contrasto gadolinio agente (Figura 5, precedentemente pubblicato dati 11).
Figura 1. Rappresentazione schematica del procedimento di infusione arteriosa epatica. I vasi epatici (arteria epatica comune, corretta dell'arteria epatica e arterie gastroduodenale) sono sezionati con l'aiuto di un microscopio da dissezione. Dopo legatura dell'arteria gastroduodenale e blocco temporale dell'arteria epatica comune,1 ml di PBS o VSV vettoriale vengono somministrati attraverso l'arteria gastroduodenale attraverso la corretta dell'arteria epatica. Dopo l'iniezione, il sito prossimale dell'arteria gastroduodenale è legatura per impedire il sanguinamento, il blocco dell'arteria epatica comune viene rilasciato, e la ripresa del flusso epatico viene confermata. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Fotografie del procedimento di infusione arteriosa epatica. Un ratto laparotomized dimostra il posizionamento del riavvolgitore muro e garza tamponi addominali (A). Dopo aver sollevato i lobi epatici, l'arteria epatica comune (CHA designato) e l'arteria gastroduodenale (designato GA) sono identificati e dissected (B). Dopo legando l'estremità distale dell'arteria gastroduodenale, l'arteria epatica comune è fissata temporaneamente (C). L'arteria gastroduodenale è ora pronto per l'iniezione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. trasduzione e la replica del tumore-selettiva di VSV dopo la somministrazione arteria epatica in ratti portatori HCC multifocale. Set di animali (n = 3 / punto di tempo) sono stati sacrificati (A) a 30 min e (B) al giorno 1 post-virus infusione, e del fegato congelato sezioni sono state colorate per l'espressione β-gal. sezioni rappresentative sono mostrati a basse (a sinistra) e più alti ingrandimenti (a destra). Le frecce indicano i confini tra le lesioni tumorali e HEPAparenchima tic. (C) Rapporto tra le dimensioni del tumore e l'efficienza di trasduzione. HCC contenenti sezioni di fegato sono stati analizzati mediante analisi morfometrica quantificare tumorale totale e zone X-gal positive. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. NDV / F3aa (L289A) i risultati del trattamento in replicazione del virus tumore-specifica nel carcinoma epatocellulare (HCC) ratti -bearing. Ratti maschi Buffalo cuscinetti multifocali noduli di HCC ortotopiche sono stati trattati con rNDV / F3aa (L289A) (10 8 TCID50) per infusione arteriosa epatica, e uccisi al momento indicato punti post-trattamento (n = 3). Tumore contenenti sezioni di fegato sono stati sottopostidi beta-gal colorazione. sezioni rappresentative sono iscritti al 5X (panoramica) e 20X (ingrandimento di sezioni tumorali e fegato) ingrandimento. Titoli virali sono stati quantificati dalla TCID50 analisi del fegato e del tumore lisato, e sono espressi come media ± SD. NDV, Newcastle virus della malattia; TCID50, 50% della dose infettante coltura tissutale. Nota, questa cifra è stato modificato dalla sua forma originale 8. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Dinamico risonanza magnetica con contrasto di HCC. MCA-RH7777 ratti portatori di tumore embolizzati, sia nonembolized o 30 minuti dopo l'embolizzazione arteriosa epatica con DSM, sono stati ripreso con DCE-MRI. (<strong> A) precontrasto assiale T1-pesato (a, c) contrasto e post (b, d) immagini mostrano la mancanza di contrasto in noduli tumorali embolizzati (d). (B) I dati sono stati analizzati quantitativamente misurando intensità di segnale in scala di grigi nelle regioni di uguali dimensioni di interesse di noduli tumorali e adiacente normale tessuto epatico. Un insieme di dati rappresentativi è mostrata. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 11. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
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