Introduction
O carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum no mundo, ea terceira principal causa de morte relacionada ao câncer, tornando-se um problema de saúde significativo 1,2. Para os pacientes que não são elegíveis para ressecção do tumor, ou aqueles aguardando transplante hepático, terapia loco-regional envolvendo embolização transarterial (TAE) ou quimioembolização transarterial (TACE) são aplicados como cuidados paliativos padrão 3,4. Estas terapias explorar a característica única de fornecimento de sangue duplo, no qual os tumores do fígado são alimentados quase exclusivamente pelo fluxo de sangue arterial hepático, enquanto o fígado circundante recebe a maioria do seu fornecimento de sangue a partir da veia portal de 5,6.
Devido às eficácias muito limitado de terapias estabelecidas de carcinoma hepatocelular, os vírus oncolí ticos têm emergido como agentes terapêuticos alternativos promissores. JX-594, recentemente renomeado Pexa-Vec, é um excluído-quinase vector vaccinia timidina, armado com granulócitos-macrophage-fator estimulador de colônias (GM-CSF), que foi concluída a fase II de ensaios clínicos para HCC 7. Mais recentemente, um vector recombinante do vírus da estomatite vesicular (VSV) que expressam o interferão-beta humano entrou numa fase I de ensaios clínicos para HCC-sorafenib refractário (NCT01628640). Como os vírus oncolí ticos aproximar-se a obtenção de aprovação para a aplicação clínica de HCC em pacientes, a necessidade de uma via de administração eficaz para alvejar doença multifocal é evidente. Enquanto a libertação sistémica é largamente ineficaz devido a transdução do tumor ineficiente, aplicações intratumorais poderia limitar a eficácia da terapia para o tumor injectado, deixando lesões microscópicas uninjectable sensíveis à progressão da doença.
Nós estabelecemos um método de isolamento da artéria hepática em ratos para administrar oncolytic vírus terapia de forma loco-regional para alvejar HCC ortotópico. Nós demonstramos que esta via de administração resultados em segurança e effective transdução de nódulos HCC multifocais, resultando no prolongamento de sobrevivência significativo em ratos imuno-competentes 8-10. Aqui, descrevemos o método de acesso, dissecando, e injetar na artéria hepática em ratos. Um esquema do processo é mostrado na Figura 1 (publicado anteriormente 9)
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Protocol
Nota: Os passos seguintes foram realizados em conformidade com as orientações da nossa instituição e o governo local da Baviera, Alemanha. Todas as tentativas para reproduzir este protocolo deve ser feita na adesão às diretrizes locais para o tratamento humano dos animais, como ditado pelo cuidado animal local e comitê de uso. Por exemplo, muitos institutos exigem que luvas estéreis são usados durante a cirurgia de roedores. Além disso, trabalhar com vírus deve ser realizada de acordo com os regulamentos locais, tendo o cuidado para a segurança pessoal e ambiental. Cuidados devem ser tomados para descartar adequadamente os resíduos contaminados e limpar instrumentos e espaço de trabalho (ou seja, por autoclavagem e limpar com um desinfectante antiviral adequado de acordo com as instruções do fabricante).
1. Preparações Antes de iniciar a cirurgia
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos (ie, por autoclavagem).
- Dilui-se o vírus para o aproprconcentração iate, que irá variar dependendo da toxicidade do vírus específico a ser utilizado e da susceptibilidade da estirpe de rato.
Nota: Por exemplo, quando se utiliza o vírus da estomatite vesicular em ratos Buffalo sexo masculino, que tipicamente injectar 10 7 pfu num volume de 1 ml, que é a dose máxima tolerada em que modelo.- Prefill o vírus (utilizando uma técnica asséptica) em seringas de 1 ml, e anexar 30 g de agulhas, tendo o cuidado de eliminar o ar da seringa e agulha.
- Prepare o espaço cirúrgico com todos os materiais e equipamentos necessários, e pulverizar a área com etanol para desinfectar. Encha um pequeno recipiente com solução salina estéril (0,9% NaCl) para umedecer compressas de gaze e aplicadores com ponta de algodão.
2. Preparação do Rato
- Administrar um analgésico (como especificado pelo Animal Care Committee e uso local), no apropriado dose de 30 min antes de se iniciar o procedimento cirúrgico. Por exemplo,administrar uma dose elevada de metamizol (100-200 mg / kg).
- Anestesiar ratos usando inalação (isoflurano) ou injectável (isto é, uma mistura de medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), e fentanilo (0,005 mg / kg), também conhecido como MMF) anestesia. Administrar isolflurane através de um vaporizador em 1-3% e ajustar conforme necessário para manter a respiração normal e do ritmo cardíaco.
- Antes de prosseguir, certifique-se que o rato está totalmente sedado e incapaz de sentir dor por beliscar a almofada do pé e observando para uma reação.
- Aplique uma pomada veterinária para prevenir o ressecamento durante a anestesia.
- Raspar a área abdominal do esterno para baixo a apenas acima dos genitais usando uma pequena máquina de cortar cabelo veterinária. Tome cuidado para conseguir um barbear mais rente sem ferir a pele.
- Corrigir o rato para o leito cirúrgico utilizando fita na previsão e membros posteriores e, se estiver usando anestesia inalação, coloque o focinho em um cone de nariz de dimensões adequadas. Coloque uma almofada de aquecimentosob o rato para manter a temperatura corporal. Desinfecção da área abdominal com um desinfectante de grau cirúrgico, seguido de uma lavagem com álcool e aplicação de uma tinta anti-séptico.
3. A laparotomia
- Usando um pequeno bisturi curvo, tal como # 15, fazer uma pequena incisão vertical na camada de pele directamente ao longo da linha média. Estender a incisão até o processo xifóide. Em seguida, inciso a camada muscular, gentilmente levantando com um par de fórceps Adson para fazer uma incisão de bisturi, e em seguida, estender a incisão até o processo xifóide com uma tesoura cirúrgica. Tomar cuidado para não puncionar os órgãos da cavidade abdominal ou a danificar os pequenos vasos em ambos os lados do processo xifóide.
- Coloque um afastador através do abdômen para espalhar o músculo ea pele e expor toda a área abdominal.
- Umedeça dois 7,5 x 7,5 cm 2 compressas de gaze com soro fisiológico estéril e espalhar uma na parte superior do cirúrgicae uma abertura através da parte inferior, como se mostra na Figura 2A.
4. Isolamento da artéria hepática
- Usando duas compressas com aplicador de algodão umedecido umedecidas com soro fisiológico estéril, levante suavemente os intestinos e ceco para fora da cavidade abdominal, e colocá-los no cotonete gaze inferior. Dobre a gaze sobre a manter os órgãos úmido e para mantê-los fora do caminho.
- Usando duas compressas com aplicador de algodão umedecidos, gentilmente levante o lobo hepático lateral esquerdo, que será o lobo mais predominante, tendo em conta nesta fase. Virar o lóbulo para cima, e, usando uma tesoura pequena mola, cortar através da membrana fibrosa na parte inferior do lóbulo, permitindo que o lóbulo para ser completamente virado para cima e para descansar em cima da compressa de gaze previamente colocado. Dobre o cotonete de gaze sobre o lobo para segurá-la no lugar.
- Continue com o próximo lobo (caudado anterior), que agora é o lobo mais anterior em vista. com the auxílio de um microscópio de dissecção e uma pinça fina, dissecção da membrana fina em torno do lóbulo de modo a libertar e permitir que seja livremente virado para cima. Colocar o lóbulo debaixo da haste de gaze em conjunto com o lobo lateral esquerdo.
- Observe o lobo caudado posterior, que será agora visível. Repita o passo 4.3 para dissecar completamente a caudado lobo posterior e lançá-lo para cima e para dentro da gaze em conjunto com os lobos do fígado colocados anteriormente.
- Logo abaixo da posição original do lobo caudado, encontrar a artéria hepática comum, que será agora visível e facilmente reconhecida por sua forte pulsação. Após a artéria para o direito anatômico, observar o material membranoso espessura obscurecendo as artérias hepáticas gastroduodenais e apropriadas de vista. Usando uma pinça fina, levante-se este material e gentilmente rasgá-lo, tomando cuidado para evitar quaisquer pequenas embarcações na área. Use cotonetes aplicador de algodão para evitar qualquer sangramento que pode ocorrer.
- Localize a umrterial ramos, que será claramente visível, com o auxílio de um microscópio de dissecação, quando as membranas são adequadamente dissecadas.
- Utilizando duas pinças atraumáticas, finas, dissecar cuidadosamente a artéria hepática comum, artéria gastroduodenal, e a artéria hepática adequada de tal modo que eles são libertados a partir das membranas que rodeiam (Figura 2B).
5. Preparação da Artéria para Injecção
- Passar um 7-0 Prolene sutura debaixo da artéria gastroduodenal, e usar um micro-porta-agulhas para amarrar uma ligadura permanente na extremidade distal, logo acima da bifurcação (ver Figura 1 para a colocação adequada). Permitir que cerca de 2 polegadas de material de sutura restantes sobre as extremidades, e prenda-os com um suporte de agulha para puxar a artéria ensinado, como na Figura 2C.
- Colocar uma pequena braçadeira na artéria hepática comum para bloquear temporariamente o fluxo de sangue (Figura 2C).
Nota: Este é important para prevenir hemorragia massiva uma vez que a agulha é removida da artéria. Além disso, o bloqueio do fluxo de sangue arterial vai permitir a administração de vírus mais lento e uma melhor eficácia de transdução.- Importante: Trabalho rapidamente para limitar a quantidade de tempo que o fluxo de sangue é interrompido - executar a injecção e subsequente ligação da artéria dentro de 5 min de aperto da artéria hepática comum.
- Se possível, aumentar a ampliação no microscópio de dissecação, de modo a que a artéria gastroduodenal está em foco e aparece grande o suficiente para inserir de forma precisa a agulha G 30. Coloque a agulha da seringa de injecção para dentro do lúmen da artéria gastroduodenal e lentamente empurrar o êmbolo.
Nota: A colocação apropriada da agulha vai resultar na solução injectada que flui directamente através da artéria hepática e adequada para o fígado.- Realizar a injecção muito lentamente para maximizar a eficiência de transdução.
<li> Uma vez que todo o volume de injecção ter sido administrada, lentamente retrair a agulha a partir da artéria.
Nota: Não deve haver sangramento no local da injecção. No caso em que a hemorragia ocorre, isso indica que a braçadeira não está correctamente colocada e deve ser ajustada rapidamente.
6. Encerramento
- Passe uma segunda 7-0 Prolene sutura abaixo da artéria gastroduodenal, e amarrar uma segunda ligadura permanente acima do local da injeção.
- Remover o grampo da artéria hepática comum. Confirmar que o fluxo de sangue através da artéria hepática própria para o fígado foi restaurado.
- Corte as pontas soltas das ligaduras.
- Confirmar que não há sangramento antes de devolver os intestinos e fígado para a cavidade abdominal. Tome cuidado para que o apêndice é devolvido em sua orientação original.
- Suturar o músculo e pele em camadas separadas utilizando material de sutura 4-0 vicryl com uma agulha curva. lugar continuous suturas cerca de 1 mm de distância e puxe com força.
- Durante a fase de sutura, administrar um analgésico tal como buprenorfina (0,05 mg / kg).
- Remover rato da anestesia. Se isoflurano foi usado, o rato deve recuperar a consciência dentro de alguns minutos. Se o MMF tem sido usado como uma anestesia injectável, antagonizam com uma injecção subcutânea de atipamezol (0,75 mg / kg), flumazenil (0,2 mg / kg), e naloxona (9,12 mg / kg), o que irá reverter os efeitos da anestesia e permitir que os animais a recuperar a consciência dentro de 20 min. Mantenha ratos quentes com uma lâmpada de aquecimento infravermelha durante a fase inicial despertar.
- Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Monitorar ratos pós-operatório para os sinais patológicos de aflição, e acompanhamento-se com analgésicos, conforme exigido pela comissão de cuidados com os animais e uso local. Por exemplo, a buprenorfina pode ser administrada em 0,05 mg / kg a cada 12 horas.
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Representative Results
Com a experiência, uma taxa de sucesso de quase 100% (o que significa que a artéria foi dissecada com sucesso e injectada, e o animal sobreviveu cirurgia) pode ser alcançado. No entanto, o estado de saúde do rato antes da cirurgia (grau de carga do tumor, a função hepática de base, etc) irá, obviamente, ter um papel no resultado da intervenção cirúrgica. Após a cirurgia, os ratos podem ser esperados para detectar a perda de peso transiente e uma ligeira elevação, transitória das enzimas hepáticas, mesmo tampão sozinho, sem vírus, injectou-se.
Temos anteriormente demonstrado que a administração arterial trans-hepática de oncolytic vírus da estomatite vesicular (VSV) ou Newcastle vírus da doença (NDV) resulta na transdução de tumor eficiente e replicação do vírus específicos do tumor, em uma ortotópico, multifocal modelo HCC 8,9. Embora os dois vírus diferem na sua cinética intratumoraisda replicação do vírus, nos respectivos pontos de tempo de replicação de vírus máxima, numerosos focos de propagação de vírus, tal como evidenciado por coloração enzimática positivo para o gene repórter LacZ, pode ser observado exclusivamente no interior de nódulos HCC, enquanto os fígados circundantes não mostraram nenhuma evidência de vírus replicação (Figura 3 e 4, os dados previamente publicados 8,9). Além disso, a análise morfométrica dos nódulos de tumor tratados com VSV seleccionados aleatoriamente demonstrado que a eficiência de transdução de tumor não se correlaciona com o tamanho do tumor (Figura 3).
Além disso, a capacidade para entregar agentes terapêuticos através da artéria hepática também oferece a possibilidade de combinar a terapia com um agente de embolização, como uma alternativa ao TACE. Nós demonstramos que, por mistura oncolítico VSV numa razão de 1: 1 com uma microesfera de amido degradáveis (DSM) agente de embolização e infundindo o Thr suspensãoough da artéria hepática, poderíamos alcançar necrose tumoral maciça e prolongamento de sobrevivência muito significativa em ratos tendo multifocal HCC nódulos 11. administração arterial trans-hepática do DSM resultou numa embolização quase completa de nódulos de tumor, e tem um efeito mínimo sobre a perfusão de tecido de fígado normal, tal como demonstrado por ressonância magnética contrastada dinâmica (DCE-MRI) usando um contraste de gadolínio agente (Figura 5, 11 dados anteriormente publicados).
Figura 1. Representação esquemática do processo de infusão arterial hepática. Os vasos hepáticos (artéria hepática comum, artéria hepática adequada, e artéria gastroduodenal) são dissecados com o auxílio de um microscópio de dissecação. Após ligadura da artéria gastroduodenal e bloqueio temporal da artéria hepática comum,1 ml de PBS ou de VSV vector são administrados através da artéria gastroduodenal através da artéria hepática adequada. Após a injecção, o sítio proximal da artéria gastroduodenal é ligada a prevenir o sangramento, o bloco da artéria hepática comum é liberado, e o recomeço do fluxo sanguíneo hepático é confirmada. Este número foi publicado anteriormente 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fotografias do processo de infusão arterial hepática. Um rato laparotomizadas demonstra a colocação dos cotonetes afastador parede e gaze abdominais (A). Depois de levantar os lobos hepáticos, a artéria hepática comum (CHA designado) e artéria gastroduodenal (designado GA) são identificados e dissected (B). Após ligação da extremidade distai da artéria gastroduodenal, a artéria hepática comum é fixada temporariamente (C). A artéria gastroduodenal está agora pronto para a injecção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Transdução e replicação do tumor-selectiva de VSV após a administração da artéria hepática em ratos portadores do carcinoma hepatocelular multifocal. Conjuntos de animais (n = 3 / ponto de tempo) foram sacrificados (A) a 30 min e (B) no dia 1 pós-vírus de infusão, e de fígado congelado secções foram coradas para expressão β-gal. secções representativas são mostrados em baixas (esquerda) e maiores ampliações (direita). As setas indicam as fronteiras entre lesões tumorais e hepaparênquima Tic. (C) Relação entre o tamanho do tumor e eficácia de transdução. HCC contendo secções do fígado foram analisados por análise morfométrica para quantificar tumoral total e áreas de X-gal positivos. Este número foi publicado anteriormente 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. NDV / F3aa (L289A) os resultados do tratamento na replicação do vírus específicos do tumor em carcinoma hepatocelular (HCC) ratos -bearing. Ratos machos Buffalo rolamento multifocais nódulos HCC ortotópicos foram tratados com rNDV / F3aa (L289A) (10 8 TCID 50) por infusão arterial hepática, e matou na hora indicada assinala pós-tratamento (n = 3). Tumor contendo secções do fígado foram submetidosa p-gal coloração. secções representativas são mostrados em 5X (visão geral) e 20X (ampliação de secções de tumor e fígado) de ampliação. Títulos virais foram quantificadas por análise de TCID50 fígado e tumor lisado, e são expressos como a média ± DP. NDV, vírus da doença de Newcastle; TCID 50, dose infecciosa de cultura de tecido de 50%. Note-se, este valor foi modificado a partir de sua forma original é 8. Este número foi publicado anteriormente 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Dinâmica ressonância magnética com contraste de ratos portadores de tumores HCC. MCA-RH7777 embolização, seja nonembolized ou 30 min após a embolização da artéria hepática com DSM, foram fotografadas com DCE-MRI. (<forte> A) pré-contraste axial T1-pesado (a, c) e pós-contraste (b, d) as imagens mostram falta de contraste em nódulos tumorais embolizados (d). (B) Os dados foram analisados quantitativamente, medindo intensidades de sinal de escala de cinzentos nas regiões de tamanho igual de interesse de nódulos de tumor e tecido de fígado normal adjacente. Um conjunto de dados representativo é mostrado. Este número foi publicado anteriormente 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
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