Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más frecuente en todo el mundo, y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer, por lo que es un importante problema de salud 1,2. Para los pacientes que no son candidatos para la resección del tumor, o aquellos que esperan un trasplante de hígado, la terapia locorregional la técnica de embolización transarterial (TAE) o la quimioembolización transarterial (TACE) se aplican como estándar de cuidados paliativos 3,4. Estas terapias se aprovechan de la característica única de doble suministro de sangre en el hígado mediante el cual los tumores se alimentan casi exclusivamente por el flujo sanguíneo arterial hepática, mientras que el hígado circundante recibe la mayor parte de su suministro de sangre de la vena porta 5,6.
Debido a las eficacias extremadamente limitadas de las terapias establecidas para el CHC, virus oncolíticos han surgido como alternativas terapéuticas prometedoras. JX-594, recientemente rebautizada Pexa-Vec, es una quinasa eliminado en vectores vaccinia timidina, armado de granulocitos-macrophage factor estimulante de colonias (GM-CSF), que se ha completado la fase II de ensayos clínicos para el CHC 7. Más recientemente, un vector recombinante virus de la estomatitis vesicular (VSV) que expresa interferón beta humano ha entrado en una fase I de ensayos clínicos para el CHC sorafenib-refractario (NCT01628640). Como los virus oncolíticos se acercan más a la obtención de la aprobación para la aplicación clínica de HCC en pacientes, la necesidad de una vía de administración eficaz para apuntar enfermedad multifocal es evidente. Mientras que la administración sistémica es en gran parte ineficaz debido a la transducción de tumor ineficiente, aplicaciones intratumorales podrían limitar la eficacia de la terapia para el tumor inyectado, dejando lesiones microscópicas uninjectable susceptibles a la progresión de la enfermedad.
Hemos establecido un método de aislamiento de la arteria hepática en ratas para administrar la terapia virus oncolítico de una manera locorregional para apuntar HCC ortotópico. Hemos demostrado que esta vía de administración da como resultado seguro y effective la transducción de nódulos HCC multifocales, lo que resulta en una prolongación significativa la supervivencia en ratas inmunocompetentes 8-10. A continuación, se describe el método de acceso, disección, e inyectar en la arteria hepática en ratas. Un esquema del procedimiento se muestra en la Figura 1 (previamente publicado 9)
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Protocol
Nota: Los siguientes pasos se han realizado de acuerdo con las directrices de nuestra institución y el gobierno local de Baviera, Alemania. Todos los intentos de reproducir este protocolo se deben hacer en la adhesión a las directrices locales para el tratamiento humanitario de los animales, según lo dictado por el cuidado de animales local y el empleo. Por ejemplo, muchos institutos requieren que los guantes estériles se usan durante la cirugía de roedores. Por otra parte, el trabajo con los virus debe realizarse de acuerdo con las regulaciones locales, teniendo cuidado para la seguridad personal y ambiental. Se debe tener cuidado para disponer adecuadamente de residuos contaminados y para limpiar instrumentos y espacio de trabajo (es decir, por tratamiento en autoclave y la limpieza con un desinfectante antiviral apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante).
1. Preparativos antes de la cirugía A partir
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos (es decir, por tratamiento en autoclave).
- Diluir el virus a la correspondconcentración IATE, que variará dependiendo de la toxicidad del virus específico que está siendo utilizado y de la susceptibilidad de la cepa de rata.
Nota: Por ejemplo, cuando el uso de virus de la estomatitis vesicular en ratas Buffalo macho, por lo general la inoculación de 10 7 pfu en un volumen de 1 ml, que es la dosis máxima tolerada en ese modelo.- Rellenar previamente el virus (utilizando una técnica aséptica) en jeringuillas de 1 ml, y adjuntar 30 g de agujas, teniendo cuidado de eliminar el aire de la jeringa y la aguja.
- Preparar el espacio quirúrgico con todos los materiales y equipos necesarios, y rociar la zona con etanol para desinfectar. Llenar un pequeño recipiente con solución salina estéril (NaCl al 0,9%) para humedecer torundas de gasa y bastoncillos de algodón.
2. Preparación de la rata
- Administrar un analgésico (como se especifica por el comité de cuidado de los animales y el uso local), en la apropiada dosis 30 minutos antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. Por ejemplo,administrar una dosis alta de metamizol (100-200 mg / kg).
- Anestesiar la rata de usar la inhalación (isoflurano) o inyectable (es decir, una mezcla de medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), y el fentanilo (0,005 mg / kg), también conocido como MMF) anestesia. Administrar isolflurane a través de un vaporizador a 1-3% y ajustar según sea necesario para mantener la respiración normal y la frecuencia cardíaca.
- Antes de continuar, asegúrese de que la rata está completamente sedado y no pueda sentir dolor pellizcando la almohadilla de la pata y la observación de una reacción.
- Aplicar un ungüento oftálmico veterinario para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Afeitar el área abdominal desde el esternón hasta justo por encima de los genitales utilizando una pequeña cortadora de cabello veterinaria. Tenga cuidado para conseguir un afeitado apurado sin dañar la piel.
- Fijar la rata en el lecho quirúrgico utilizando cinta adhesiva en las patas delanteras y las patas traseras, y, si se utiliza la anestesia de inhalación, coloque el hocico en un cono de la nariz de dimensiones adecuadas. Coloque una almohadilla térmicapor debajo de la rata para mantener la temperatura corporal. Desinfectar la zona abdominal usando un desinfectante de grado quirúrgico, seguido de un enjuague con alcohol y la aplicación de una pintura antiséptico.
3. La laparotomía
- Usando un pequeño bisturí curvo, tal como # 15, hacer una pequeña incisión vertical en la capa de la piel directamente a lo largo de la línea media. Extender la incisión hasta el proceso xifoides. A continuación, una incisión en la capa muscular levantando suavemente hacia arriba con un par de pinzas de Adson para hacer una incisión con bisturí, y luego extender la incisión hasta el proceso xifoides con tijeras quirúrgicas. Tener cuidado de no perforar los órganos de la cavidad abdominal o de dañar los pequeños vasos en cada lado del proceso xifoides.
- Coloque un retractor a través del abdomen para difundir el músculo y la piel y exponer toda la zona abdominal.
- Humedecer dos 7,5 x 7,5 cm 2 hisopos de gasa con solución salina fisiológica estéril y se extiende uno en la parte superior de la cirugíala apertura y uno en la parte inferior, como se muestra en la Figura 2A.
4. Aislamiento de la arteria hepática
- El uso de dos hisopos de aplicador de algodón humedecido humedecidos con solución salina fisiológica estéril, levante suavemente los intestinos y el ciego fuera de la cavidad abdominal, y colocarlos en el hisopo de gasa inferior. Doble la gasa sobre los órganos de mantener húmeda y para mantenerlos fuera del camino.
- El uso de dos hisopos aplicador de algodón humedecido, levante suavemente el lóbulo hepático lateral izquierdo, que será el lóbulo más predominante en vista en esta etapa. Da la vuelta al lóbulo hacia arriba, y, usando un pequeño par de tijeras de primavera, cortar a través de la membrana fibrosa en la parte inferior del lóbulo, permitiendo que el lóbulo a ser completamente volteado hacia arriba y descansar en la parte superior de la torunda de gasa previamente colocado. Doblar el hisopo de gasa sobre el lóbulo para mantenerlo en su lugar.
- Continuar con el siguiente lóbulo (el caudado anterior), que es ahora el lóbulo más anterior a la vista. con THe ayuda de un microscopio de disección y pinzas finas, diseccionar la membrana delgada que rodea el lóbulo con el fin de liberarlo y permitir que se volcó libremente hacia arriba. Coloque el lóbulo debajo de la torunda de gasa junto con el lóbulo lateral izquierdo.
- Observar el lóbulo caudado posterior, que ahora serán visibles. Repita el paso 4.3 para diseccionar completamente el caudado lóbulo posterior y darle la vuelta hacia arriba y hacia el interior de la gasa junto con los lóbulos del hígado previamente colocados.
- Justo debajo de la posición original del lóbulo caudado, encontrar la arteria hepática común, que ahora serán visibles y fácilmente reconocido por su fuerte pulsación. A raíz de la arteria hacia la derecha anatómica, observar el material membranoso de espesor oscureciendo las arterias hepáticas gastroduodenales y propios de la vista. Con unas pinzas finas, levanta este material y suavemente arrancarla, teniendo cuidado de evitar cualquier vasos pequeños en esta área. Use hisopos de algodón del aplicador para detener cualquier sangrado que puede ocurrir.
- Busque la unaramas rterial, que será claramente visible con la ayuda de un microscopio de disección cuando las membranas se disecan correctamente.
- El uso de dos, una pinza atraumática finas, diseccionar cuidadosamente la arteria hepática común, la arteria gastroduodenal, y la arteria hepática propia de tal manera que se liberan de las membranas que rodean (Figura 2B).
5. Preparación de la arteria para Inyección
- Pasar una sutura de prolene 7-0 por debajo de la arteria gastroduodenal, y el uso de un micro-porta-agujas para atar una ligadura permanente en el extremo distal, justo por encima de la bifurcación (véase la figura 1 para la colocación adecuada). Permitir aproximadamente 2 pulgadas de material de sutura restantes en los extremos, y la abrazadera con un soporte de aguja para tirar de la arteria enseñado, como en la figura 2C.
- Coloque una pequeña pinza en la arteria hepática común para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo (Figura 2C).
Nota: Esta es importante para prevenir el sangrado masivo una vez que la aguja se retira de la arteria. Además, el bloqueo del flujo sanguíneo arterial permitirá la administración del virus más lento y una mayor eficiencia de transducción.- Importante: Trabajar rápidamente para limitar la cantidad de tiempo que el flujo sanguíneo se detiene - realizar la inyección y la posterior ligadura de la arteria dentro de 5 min de pinzamiento de la arteria hepática común.
- Si es posible, aumentar la ampliación en el microscopio de disección, de modo que la arteria gastroduodenal es en un enfoque nítido y aparece lo suficientemente grande como para insertar con precisión la aguja G 30. Coloque la aguja de la jeringa de inyección en el lumen de la arteria gastroduodenal y empuje lentamente el émbolo.
Nota: La colocación correcta de la aguja resultará en la solución inyectada fluye directamente a través de la arteria hepática propia y hacia el hígado.- Realizar la inyección muy lentamente para maximizar la eficiencia de transducción.
<li> Una vez se ha administrado todo el volumen de la inyección, se retrae lentamente la aguja de la arteria.
Nota: No debe haber sangrado del sitio de inyección. En el caso de que el sangrado se produce, esto indica que la abrazadera no está correctamente colocado y debe ajustarse rápidamente.
6. Cierre
- Pasar una segunda sutura de prolene 7-0 por debajo de la arteria gastroduodenal, y atar una segunda ligadura permanente por encima del punto de inyección.
- Retire la abrazadera de la arteria hepática común. Confirmar que el flujo de sangre a través de la arteria hepática propia hacia el hígado se ha restaurado.
- Cortar los extremos sueltos de las ligaduras.
- Confirmar que no hay sangrado antes de devolver los intestinos y el hígado a la cavidad abdominal. Tenga cuidado de que el apéndice se devuelve en su orientación original.
- Suturar el músculo y la piel en capas separadas utilizando material de sutura Vicryl 4-0 con una aguja curva. lugar continuous suturas de aproximadamente 1 mm de distancia y tirar con fuerza.
- Durante la fase de sutura, administrar un analgésico tal como buprenorfina (0,05 mg / kg).
- Retire la rata de la anestesia. Si se ha utilizado isoflurano, la rata debe recuperar la consciencia dentro de varios minutos. Si MMF se ha utilizado como una anestesia inyectable, antagonizar con una inyección subcutánea de atipamezol (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg), y la naloxona (9,12 mg / kg), que revertir los efectos de la anestesia y permitir que los animales puedan recobrar el conocimiento dentro de los 20 min. Mantener calientes ratas con una lámpara de calentamiento por infrarrojos durante la fase inicial de despertar.
- No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
- No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Supervisar las ratas después de la operación para detectar signos patológicos de la angustia, y el seguimientocon analgésicos como es requerido por el comité de cuidado y uso de animales local. Por ejemplo, la buprenorfina puede administrarse a 0,05 mg / kg cada 12 horas.
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Representative Results
Con la experiencia, se puede lograr una tasa de éxito de casi el 100% (lo que significa que la arteria se diseccionó y se inyecta con éxito, y el animal sobrevivió cirugía). Sin embargo, el estado de salud de la rata antes de la cirugía (grado de carga tumoral, la función hepática subyacente, etc.), obviamente, jugar un papel en el resultado de la intervención quirúrgica. Después de la cirugía, las ratas se puede esperar que experimentar pérdida de peso transitoria y una ligera elevación, transitoria de las enzimas hepáticas, incluso si tampón solo, sin virus, se inyectó.
Hemos demostrado previamente que la administración arterial trans-hepática de oncolítico virus de la estomatitis vesicular (VSV) o resultados virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) en la transducción de tumores eficiente y la replicación del virus específico de tumor, en un ortotópico, multifocal modelo HCC 8,9. Aunque los dos virus se diferencian en su cinética intratumoralesde la replicación del virus, en los respectivos puntos de tiempo de la replicación del virus de la máxima, numerosos focos de propagación de virus, como se evidencia por la tinción enzimática positivo para el gen reportero LacZ, pudo observarse exclusivamente dentro de los nódulos de HCC, mientras que los hígados de los alrededores no mostraron evidencia de virus replicación (Figura 3 y 4, previamente publicado datos 8,9). Además, el análisis morfométrico de los nódulos tumorales tratados con VSV seleccionados al azar demostró que la eficacia de transducción tumor no se correlaciona con el tamaño del tumor (Figura 3).
Además, la capacidad para suministrar agentes terapéuticos a través de la arteria hepática también ofrece la posibilidad de combinar la terapia con un agente de embolización como una alternativa a TACE. Hemos demostrado que, mediante la mezcla de oncolítico VSV en una relación 1: 1 con una microesfera de almidón degradable (DSM) agente de embolización y la infusión de la suspensión through la arteria hepática, podríamos lograr necrosis tumoral masiva y muy significativa prolongación de supervivencia en ratas con multifocal HCC nódulos 11. administración arterial Trans-hepática del DSM resultó en una embolización casi completa de los nódulos tumorales, mientras que tiene un efecto mínimo en la perfusión de tejido normal del hígado, como lo demuestra la formación de imágenes por resonancia magnética realzada con contraste dinámico (DCE-MRI) utilizando un contraste de gadolinio agente (Figura 5, los datos publicados previamente 11).
Figura 1. Representación esquemática del procedimiento de infusión arterial hepática. Los vasos hepáticos (arteria hepática común, la arteria hepática adecuada, y la arteria gastroduodenal) se diseccionaron con la ayuda de un microscopio de disección. Después de la ligación de la arteria gastroduodenal y el bloque temporal de la arteria hepática común,se administran 1 ml de PBS o vector VSV través de la arteria gastroduodenal través de la arteria hepática propia. Después de la inyección, el sitio proximal de la arteria gastroduodenal se ligó para evitar el sangrado, el bloque de la arteria hepática común se libera, y la reanudación del flujo de sangre hepática se confirma. Esta cifra ha sido publicado previamente 9. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fotografías del procedimiento de infusión arterial hepática. Una rata laparotomizados demuestra la colocación de los retractores de pared y de gasa hisopos abdominales (A). Después de levantar los lóbulos hepáticos, la arteria hepática común (CHA designado) y la arteria gastroduodenal (designado GA) son identificados y disdiseccionados (B). Después de ligar el extremo distal de la arteria gastroduodenal, la arteria hepática común se sujeta temporalmente (C). La arteria gastroduodenal ya está listo para la inyección. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Transducción y replicación tumor-selectivo de VSV después de la administración de la arteria hepática en ratas con HCC multifocal. Conjuntos de animales (n = 3 / punto de tiempo) se sacrificaron (A) en 30 min y (B) al día 1 post-virus infusión, y el hígado congelado secciones se tiñeron para la expresión β-gal. secciones representativas se muestran a bajas (izquierda) y aumentos superiores (derecha). Las flechas indican las fronteras entre las lesiones tumorales y HEPAparénquima tic. (C) La relación entre el tamaño tumoral y la eficiencia de transducción. secciones de hígado HCC-que contienen se analizaron por análisis morfométrico para cuantificar total del tumor y las áreas X-gal-positivo. Esta cifra ha sido publicado previamente 9. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. NDV / F3aa (L289A) los resultados del tratamiento en la replicación del virus específico de tumor en el carcinoma hepatocelular (CHC) ratas llevando los. Ratas macho Buffalo que llevan nódulos HCC ortotópico multifocales se trataron con rNDV / F3aa (L289A) (10 8 TCID 50) por infusión arterial hepática, y mató a la hora indicada puntos de post-tratamiento (n = 3). secciones de hígado que contiene Tumor-se sometieronde ß-gal tinción. secciones representativas se muestran en 5X (visión general) y 20X (ampliación de las secciones del tumor y el hígado) magnificación. Los títulos virales se cuantificaron por TCID 50 análisis de hígado y tumor lisado, y se expresan como la media ± SD. NDV, virus de la enfermedad de Newcastle; DICT 50, 50% de la dosis infecciosa de cultivo de tejidos. Tenga en cuenta, esta figura ha sido modificado desde su forma original 8. Esta cifra ha sido publicado previamente 8. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La resonancia magnética con contraste dinámico de las ratas que tenían tumores HCC. MCA-RH7777 embolizados, ya sea nonembolized o 30 min después de la embolización arterial hepática con DSM, se obtuvieron imágenes con RM-RT. (<strong> A) precontraste pesado-T1 axial (a, c) y poscontraste (b, d) las imágenes muestran la falta de contraste en los nódulos tumorales embolizados (d). (B) Los datos se analizaron cuantitativamente mediante la medición de las intensidades de señal de escala de grises en las regiones de igual tamaño de interés de los nódulos tumorales y tejido hepático normal adyacente. Un conjunto de datos representativo se muestra. Esta cifra ha sido publicado previamente 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
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- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
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