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Medicine

पानी में घुलनशील यौगिकों के साथ Sca1 चूहे इलाज गैर विशेष mitochondrial समारोह को बढ़ावा देने के

Published: January 22, 2017 doi: 10.3791/53758

Abstract

Mitochondrial रोग उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में है और कई वंशानुगत spinocerebellar ataxias और सेरिबैलम के प्रगतिशील अध: पतन द्वारा चिह्नित अन्य आंदोलन विकारों सहित neurodegenerative रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य spinocerebellar गतिभंग टाइप 1 (Sca1) में mitochondrial रोग का आकलन और रोग प्रगति को धीमा करने के लिए पानी में घुलनशील यौगिक succinic एसिड के माध्यम से चयापचय श्वसन के औषधीय लक्ष्य-निर्धारण की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए है। यह दृष्टिकोण अन्य अनुमस्तिष्कीय रोगों के लिए लागू है और पानी में घुलनशील उपचारों के एक मेजबान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Mitochondrial श्वसन के पूर्व vivo विश्लेषण का पता लगाने और mitochondrial समारोह में इस रोग से संबंधित परिवर्तन यों इस्तेमाल किया जाता है। आनुवंशिक सबूत (अप्रकाशित डेटा) और Sca1 माउस मॉडल में mitochondrial रोग की प्रोटिओमिक सबूत के साथ, हम पानी में घुलनशील चयापचय बूस्टर के साथ उपचार की प्रभावकारिता का मूल्यांकनइस परिसर घर पिंजरे पीने के पानी में सीधे भंग द्वारा uccinic एसिड। रक्त मस्तिष्क बाधा पारित करने के लिए दवा की क्षमता उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग कर deduced किया जा सकता है। इन यौगिकों की प्रभावकारिता तो तेज करने rotarod, संतुलन बीम परीक्षण और पदचिह्न विश्लेषण सहित कई व्यवहार मानदंड का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है। सेरिबैलम के Cytoarchitectural अखंडता immunofluorescence assays कि Purkinje सेल नाभिक और Purkinje सेल dendrites और सोमा का पता लगाने का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। इन विधियों mitochondrial रोग और अनुमस्तिष्क neurodegenerative रोग में पानी में घुलनशील यौगिकों के साथ उपचार की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए मजबूत तकनीक है।

Introduction

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माइटोकॉन्ड्रिया adenosine triphosphate (एटीपी), सेलुलर ऊर्जा के लिए एक अनिवार्य कोएंजाइम के प्रमुख उत्पादकों, mitochondrial आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) के माध्यम से उत्पादन एटीपी इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला का उपयोग कर के बहुमत के साथ कर रहे हैं। मस्तिष्क, इसकी उच्च चयापचय की मांग और तंत्रिका गतिविधि शक्ति के लिए आक्सीकारक फास्फारिलीकरण पर अपनी निर्भरता को देखते हुए अत्यधिक mitochondrial रोग की संभावना है। नतीजतन, mitochondrial रोग उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान शुरू हो रहा है 1 और कई neurodegenerative रोगों 2, 3, 4 के रोगजनन में फंसा है। इसलिए, यह इस प्रकार है कि माइटोकॉन्ड्रिया neurodegeneration के लिए आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम माइटोकॉन्ड्रिया के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में neurodegenerative रोग spinocerebellar गतिभंग टाइप 1 (Sca1) के उपयोग को अपनाया हैएल शिथिलता और mitochondrial-लक्षित उपचारों के विकास। Sca1 ataxin -1 जीन उत्पाद है जो सेरिबैलम के Purkinje न्यूरॉन्स और मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों के न्यूरॉन्स के प्रगतिशील अध: पतन का घोड़ा में एक पॉलीग्लुटामाइन (polyQ) दोहराने विस्तार उत्परिवर्तन के कारण होता है। ट्रांसजेनिक माउस लाइन यहां इस्तेमाल किया (Sca1 माउस के रूप में नामित), जो एक Purkinje सेल विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में एक polyQ उत्परिवर्ती ataxin -1 transgene व्यक्त करता है, Sca1 5 Purkinje सेल घटक के लक्षित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। Sca1 चूहों क्रमिक Purkinje सेल अध: पतन से गुजरना और अनियमित चाल 6 का विकास।

Mitochondrial परिसर में शिथिलता और mitochondrial-लक्षित उपचार प्रभावकारिता आणविक और व्यवहार assays के एक बैटरी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। Mitochondrial परिसर में शिथिलता पूर्व vivo श्वसन assays कि में अनुमस्तिष्क ऊतक के भीतर बदल ऑक्सीजन की खपत का पता लगाने से मापा जाता हैइलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला substrates और अवरोधकों 7 की उपस्थिति। श्वसन assays पहले permeabilized ऊतक, mitochondrial वियोजन, और पूरे ऊतक 7, 8, 9 के साथ इस्तेमाल किया गया है। वे विपरीत इस तरह के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या immunofluorescence धुंधला के रूप में रूपात्मक डेटा संग्रह तरीकों mitochondrial समारोह का सीधा आकलन के लिए अनुमति देते हैं। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के बजाय पूरे ऊतक के उपयोग स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव की प्रक्रिया 7 के दौरान हो सकता है की पक्षपाती चयन रोकता है। जब प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित के रूप में दिखाया, श्वसन परख अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative रोग राज्यों में mitochondrial रोग का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है।

चयापचय की गैर विशिष्ट activators neurodegenerative diseas की ट्रांसजेनिक चूहों मॉडल में mitochondrial रोग अनुमान किया जा सकता हैई और नए उपचारों के विकास में सहायता। Quercetin, Coenzyme Q10 और creatine सभी रोगियों में और neurodegenerative रोग 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 के पशु मॉडल में neurodegenerative रोग विकृति सुधारने की दिशा में दिखाया गया है। यहाँ हम एक उपन्यास चयापचय उत्प्रेरक, succinic एसिड, चयापचय को उत्तेजित और neurodegenerative रोग में mitochondrial समारोह को बढ़ावा देने के लिए उपस्थित थे। यह सुनिश्चित करें कि उत्प्रेरक रक्त मस्तिष्क बाधा पार कर रहा है, एचपीएलसी इलाज चूहों 17 में तंत्रिका ऊतक को प्रसव पता लगाने के लिए नियुक्त किया गया था।

ऐसे succinic एसिड के रूप में पाचन लक्षित पानी में घुलनशील यौगिकों के उपचारात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, व्यवहार मानदंड और immunopathological अध्ययन की एक बैटरी का इस्तेमाल किया जा सकता है। दूमोटर समन्वय अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative रोग, पदचिह्न रनवे परख, किरण परख और तेज करने घूर्णन छड़ी परख में पाया घाटे को ई व्यवहार विकृति 6, 18, 19 के बचाव का पता लगाने के लिए किया जाता है। इन उपायों से अनुमस्तिष्क ऊतक 6, 20, 21 का एक निर्धारित lobule भीतर आणविक परत मोटाई (Purkinje सेल वृक्ष के समान कुंज लंबाई के रूप में परिभाषित) और Purkinje सेल सोमा मायने रखता है का आकलन करने से अनुमस्तिष्कीय cytoarchitecture की immunopathological आकलन के साथ पूरक हैं। यहाँ हम पता लगाने और पाचन लक्षित पानी में घुलनशील यौगिकों के साथ mitochondrial रोग के उपचार के लिए कई नयूरोपथोलोगिकल और व्यवहार के तरीकों प्रस्तुत करते हैं।

हम mitochondrial श्वसन के पूर्व vivo विश्लेषण का उपयोग Sca1 Tran में mitochondrial रोग का विश्लेषण करने के लिएsgenic माउस। इसके अलावा, हम बताते हैं कि इस बीमारी के लक्षण और पैथोलॉजी, पानी में घुलनशील mitochondrial बूस्टर succinic एसिड से सुधार कर रहे हैं और आगे Sca1 रोग प्रगति में mitochondrial रोग फंसाने।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल चूहों के साथ काम करने के लिए Skidmore कॉलेज में IACUC दिशा निर्देशों का पालन करती है।

1. पानी में घुलनशील यौगिकों के साथ उपचार

  1. पिंजरे पीने के पानी में 0.75 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए succinic एसिड भंग। ध्यान दें कि वांछित एकाग्रता में रुचि के किसी भी पानी में घुलनशील यौगिक इस स्तर पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है। समाधान हलचल यकीन है कि परिसर पूरी तरह से भंग कर रहा है बनाने के लिए।
  2. बाद चूहों उपचार के वांछित उम्र तक पहुँचने, 1.1 चरण में समाधान के साथ उपचार हालत समूह के घर पिंजरे पीने के पानी की जगह।
  3. दैनिक दोनों को उपचार और नियंत्रण समूह पानी की बोतलों के वजन को मापने के लिए सुनिश्चित करें कि दोनों का इलाज किया और नियंत्रण चूहों पानी की एक ही राशि पी रहे हैं। पिंजरे प्रति कुल दवा की खुराक की गणना करने के लिए इन मापों का प्रयोग करें। प्रयोग और मॉनिटर बोतल वजन भर में उपचार जारी है।

2. पदचिह्न विश्लेषण

  1. फर्श पर रनवे की जगह याएक सीमित कमरे में एक मेज। घर बॉक्स बिस्तर और इनाम भोजन के साथ लाइन में खड़ा करने की दिशा में एक मामूली ऊपर की ओर कोण (जैसे मीठा अनाज) के रनवे सेट करें। सफेद कागज के एक पत्रक के साथ रनवे की लंबाई लाइन। विषय 5 मिनट के लिए घर बॉक्स में acclimate करने की अनुमति दें।
  2. घर बॉक्स से इस विषय निकालें और बाएँ और दाएँ पिछले पैर रंग, क्रमशः, नीले और लाल गैर विषैले पानी आधारित पेंट के साथ। रंग प्रिंट एकाधिक आउटपुट व्यवहार माप की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. रनवे की शुरुआत में विषय की जगह है और इस विषय घर बॉक्स करने के लिए चलने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार इस विषय घर बॉक्स तक पहुँच गया है, जाल दरवाजा बंद है, और संबंधित घर पिंजरे में लौटने से पहले एक मिनट के लिए घर बॉक्स के भीतर रहने के अधीन अनुमति देते हैं। 30% इथेनॉल के साथ रनवे और घर बॉक्स को साफ करें और बिस्तर की जगह, खाद्य इनाम है, और अगले विषय के लिए रनवे कागज।
  4. लिया बदल जाता है की प्रगति की संख्या, फाटक की चौड़ाई, कदम के कोण, और संख्या योंविषय से पहले 6 वर्णित विश्लेषणात्मक तरीकों के अनुसार। एक सफल पदचिह्न परीक्षण के चारों ओर मोड़ या रोकने के बिना 5 अनुक्रमिक पैरों के निशान जो इस विषय में लक्ष्य बॉक्स की दिशा में चल रहा है की एक न्यूनतम के रूप में परिभाषित किया गया है।

3. बीम विश्लेषण

  1. बार पार निम्नलिखित 6 बीम के साथ पहले से वर्णित 6 विनिर्देशों के अनुसार बीम उपकरण सेट करें: किरण 1 = आयताकार, 28 मिमी चौड़ाई; किरण = 2 गोल, 28 मिमी व्यास; किरण 3 = आयताकार, 12 मिमी चौड़ाई; किरण = 4 गोल, 12 मिमी व्यास; किरण = 5 आयताकार, 6 मिमी चौड़ाई; किरण 6 = दौर, 6 मिमी व्यास। किरण के एक छोर पर, इनाम भोजन के साथ एक अंधेरे घर बॉक्स की स्थापना की।
  2. बीम पर विषयों के प्रशिक्षित करने के लिए, किरण 3 के साथ तंत्र को इकट्ठा धीरे घर बॉक्स करने के लिए बीम के सामने के अंत पर विषय जगह है, और विषय भर में चलने के लिए अनुमति देते हैं। प्रत्येक विषय के एक सफल चलाने को प्राप्त करने के लिए तीन-2 मिनट परीक्षणों की अनुमतिबीम को पार करने और 2 मिनट के भीतर घर बॉक्स में प्रवेश के रूप में परिभाषित किया। परीक्षणों के बीच में, 2 मिनट के लिए घर बॉक्स में विषय आराम करते हैं। विषयों के बीच में, 30% इथेनॉल के साथ बीम और घर बॉक्स साफ है और अगले विषय के लिए तैयार करने में इनाम भोजन की जगह।
  3. अगले दो दिनों के 3 अनुक्रमिक प्रशिक्षण दिनों के कुल में जिसके परिणामस्वरूप के लिए प्रति दिन एक बार दोहराएँ कदम 3.2। परीक्षण के दिन, 4 दिन, क्रमिक रूप से प्रशिक्षण दिन का पालन करना चाहिए।
  4. 4 दिन विषयों का परीक्षण करने के लिए, पहली किरण के साथ 1 तंत्र को इकट्ठा और कदम 3.1 में वर्णित के रूप में घर बॉक्स की स्थापना की। तंत्र के सामने एक वीडियो कैमरा की जगह और सत्यापित करें कि पूरा तंत्र किरण स्पष्ट रूप से वीडियो पर कब्जा कर लिया जा सकता है। रिकॉर्डिंग शुरू और घर बॉक्स करने के लिए बीम विपरीत पर पहला विषय जगह है, सफलतापूर्वक एक परीक्षण पूरा करने के लिए 3 2 मिनट के प्रयास करने के लिए अनुमति देता है। परीक्षणों के बीच में, घर बॉक्स में 2 मिनट के लिए आराम करने के लिए विषय की अनुमति है।
  5. संख्यात्मक क्रम में छह मुस्कराते हुए प्रत्येक पर विषय की परीक्षा के लिए जारी रखें,अगले किरण की शुरुआत से पहले घर बॉक्स में 2 मिनट के लिए आराम करने के लिए विषय की इजाजत दी। विषयों के बीच, प्रत्येक बीम और 30% इथेनॉल के साथ घर बॉक्स को साफ करने और प्रत्येक विषय के लिए तैयार करने में इनाम के भोजन की जगह।
    1. वीडियो टेप प्रत्येक परीक्षण और इस प्रकार के रूप में किरण प्रति विषय के प्रति सफल परीक्षणों की संख्या रिकॉर्ड: '1' को इंगित करता है विषय पर पहला परीक्षण सफल रहा था, '2' को इंगित करता है विषय पर दूसरा परीक्षण सफल रहा था, '3' को इंगित करता है विषय था तीसरे और अंतिम परीक्षण पर सफल, और '4' को इंगित करता है अधीन तीन परीक्षणों में से किसी पर सफल नहीं था।
  6. स्कोरर जो इस विषय की प्रयोगात्मक शर्तों को अंधा कर रहे हैं द्वारा परीक्षणों के उपाय footslips की वीडियो रिकॉर्डिंग का प्रयोग करें। hindfoot बीम की लंबाई भर में एक सैद्धांतिक midline नीचे कैमरा सूई के प्रत्यक्ष दृश्य में है कि के रूप में एक footslip को परिभाषित करें। कई स्कोरर से औसत footslip स्कोर।
  7. रों की संख्या का विश्लेषण करने के लिएuccessful परीक्षणों और footslips डेटा की संख्या, प्रत्येक जीनोटाइप और प्रयोगात्मक हालत पलटन के भीतर मतलब है और मानक त्रुटि की गणना। एक तरह से एनोवा और एकाधिक तुलना पद अस्थायी विश्लेषण का संचालन करता है, तो वहाँ उपचार और सफल परीक्षणों और footslips की संख्या की संख्या पर जीनोटाइप का एक प्रभाव है निर्धारित करने के लिए।

4. rotarod तेज

  1. परख कमरे 10 मिनट के परीक्षण की शुरुआत से पहले करने के लिए विषयों acclimate। इस दशानुकूलन अवधि के दौरान, rotarod तंत्र तैयार करते हैं, 30% इथेनॉल के साथ तंत्र की प्रत्येक गली की सफाई।
  2. rotarod सॉफ्टवेयर खोलें और 40 rpm के लिए 5 मिनट और अंतिम गति सेटिंग्स करने के लिए 4 rpm के लिए सेटिंग्स, त्वरण सेटिंग्स शुरू की स्थापना की। 5 मिनट की अवधि में 40 आरपीएम - ये सेटिंग्स 4 से लगातार त्वरण प्रदान करते हैं। चूहे 10 मिनट की एक अधिकतम रन लंबाई के लिए त्वरण अवधि से परे एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 40 rpm पर rotarod पर रह सकते हैं।
  3. पोस्ट-दशानुकूलन, जगह विषयों ओउनके संबंधित गलियों में rotarod Nto रॉड 4 rpm पर घूर्णन कर रहा है, जबकि। एक बार सभी विषयों उनके संबंधित गलियों में हैं, पहला परीक्षण शुरू करते हैं। विलंबता साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गिर करने के लिए रिकॉर्ड; एक माध्यमिक टाइमर एक बैकअप के रूप में नियोजित किया जा सकता है।
  4. परीक्षण पूरा होने के बाद दस मिनट के अगले परीक्षण करने से पहले थकान को रोकने के लिए उनके संबंधित लेन जलाशयों में आराम करने के लिए प्रत्येक विषय के लिए अनुमति देते हैं।
  5. दोहराएँ चार परीक्षणों की कुल के लिए कदम 4.3 और 4.4।
  6. दोहराएँ कदम 4.3 - 4.5 लगातार चार दिनों की कुल के लिए, जारी रखने के परीक्षण अवधि के दौरान उपचार। पूरा होने पर, विषय 6 प्रति प्रत्येक परीक्षण के लिए घूर्णन छड़ी गिर करने के लिए विलंबता यों।

5. अनुमस्तिष्क निष्कर्षण और फिक्सेशन

  1. संस्थागत IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation के माध्यम से चूहों euthanize। कार्बन डाइऑक्साइड के चेंबर में विषय प्लेस, और चैम्बर में कार्बन डाइऑक्साइड जारी। घड़ीeuthanizing चरण के दौरान हर समय जानवर और पशु छोड़ पहुंच से बाहर नहीं है।
  2. एक बार साँस लेने में नहीं रह गया है और विषयों हिंद पैर के दबाव से कोई शेष दर्द धारणा दिखाने के लिए, कक्ष से विषय को हटाने और दुमदारी उपकला ऊतकों के माध्यम से खोपड़ी के आधार करने के लिए खोपड़ी के बीच में से उपकला ऊतकों के माध्यम से एक बेहतर midline चीरा बनाते हैं।
  3. विच्छेदन कैंची का प्रयोग, शीर्षस्थान को बाण सीवन के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में आधार से खोपड़ी में कटौती। कुंद संदंश का उपयोग ललाट, पार्श्विका और interparietal हड्डियों से खींच से पहले प्रत्येक राज्याभिषेक सिवनी के माध्यम से laterally कट।
  4. सेरिबैलम के लिए हड्डी पार्श्व बंद तोड़ने के लिए कुंद संदंश का प्रयोग करें। colliculi और मस्तिष्क से सेरिबैलम अलग और ऊतक के बाकी हिस्सों से इसे बाहर निकालना संदंश का प्रयोग करें। संदंश के साथ छोड़ दिया और सही गोलार्द्धों में सेरिबैलम अलग करें।
  5. इसके तत्काल बाद तरल नाइट्रोजन में सही जगह अनुमस्तिष्क एचपीएलसी एना के लिए बचाने के लिएसेल और ऊतक निर्धारण के लिए पूर्व ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) में बाईं अनुमस्तिष्क। महाधमनी विच्छेद और संस्थागत IACUC नियमों के अनुसार शव को खारिज करने से पहले ब्याज के किसी भी अन्य ऊतक फसल।
    चेतावनी: पीएफए एक अत्यधिक विषाक्त ज्वलनशील, और संक्षारक है।
  6. चौबीस घंटे के बाद निकासी, ऊतक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पीएफए ​​(पीबीएस में 4%) में तय धोने (तीन बार, 5 मिनट / धोने) अप करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% sucrose में ऊतक रखने से पहले 2 सप्ताह।

6. इम्युनोपैथोलोजी परख

  1. एक सिंक नल और एक तापमान नियंत्रण बॉक्स के लिए एक स्लेज microtome की ट्यूबिंग संलग्न। डिग्री सेल्सियस -25 के लिए microtome चरण शांत करने के लिए तापमान नियंत्रण बॉक्स का उपयोग करें। 50 माइक्रोन तक सेक्शनिंग मोटाई डायल सेट करें।
    नोट: यदि स्लेज microtome पर डायल 50 माइक्रोन तक पहुँच नहीं है, एक पतले स्थापित करने के लिए डायल सेट और सेटिंग तदनुसार स्थानांतरण द्वारा मोटाई गुणा (उदाहरण के लिए डी सेट10 माइक्रोन के लिए ial और 50 माइक्रोन) की कुल मोटाई के लिए सेक्शनिंग से पहले पांच बार पाली।
  2. मंच पर अधिकतम तापमान काटना (ओटीसी) समाधान का एक पैसा भी आकार के हिस्से थपका। इससे पहले कि ओटीसी जमा देता है, गोलार्द्ध की स्थिति के लिए तो यह है कि मध्य-बाण कटौती की सतह ओटीसी परत पर नीचे का सामना करना है संदंश का उपयोग करें। जल्दी से काम करते हुए, धीरे संदंश के साथ ऊतक उन्मुख इतना है कि गोलार्द्ध के पार्श्व टिप ब्लेड, चरण के लिए बेहतर की ओर इशारा कर रहा है। ओटीसी पूरी तरह से फ्रीज करने की अनुमति दें।
    1. परतों में कार्य करना, ऊतक ओटीसी अगले परत जोड़ने से पहले पूरी तरह से फ्रीज करने के लिए अनुमति के आसपास अतिरिक्त ओटीसी जोड़ें। ऊतक और फ्रीज के शीर्ष पर ओटीसी की एक पतली परत जोड़ें।
  3. धारा ऊतक, काटने ब्लेड पर बराबर शरीर के वजन का वितरण करते हुए सेक्शनिंग। एक उचित लेबल अच्छी तरह से थाली 1x पीबीएस युक्त में एक अच्छा कलाकार तूलिका और जगह का उपयोग वर्गों लीजिए। वर्गों के बीच, फिर से सेट पर काटने मोटाई, Microtome डायल स्लेज, यदि आवश्यक हो तो 50 माइक्रोन के लिए।
  4. यूरिया समाधान [पीबीएस में 0.01 एम यूरिया] के साथ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में पीबीएस बदलें और बर्फ पर थाली जगह है। जब तैयार है, बर्फ और फोड़ा वर्गों से प्लेट यूरिया के घोल में तीन बार 15 एस के लिए हर बार immunolabeling के लिए epitopes नकाब उतारना को हटा दें। यह कदम आसानी से एक हीटिंग तापमान उबलते करने के लिए सेट ब्लॉक पर थाली रखकर पूरा किया जा सकता है। प्रत्येक उबलते कदम के बीच बर्फ पर ऊतक वर्गों युक्त थाली शांत।
    नोट: यदि यूरिया प्रदर्शन कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में अवरुद्ध, प्राथमिक एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी और DAPI कदम, भर में 100 μL की मात्रा का उपयोग करें। एक अलग आकार में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जाता है, अभिकर्मक की मात्रा के हिसाब से समायोजित करें। एक हीटिंग ब्लॉक के एवज में, एक माइक्रोवेव यूरिया में ऊतकों के नमूनों फोड़ा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उच्च शक्ति तीन 15 एस अंतराल के लिए सेटिंग पर माइक्रोवेव नमूने हैं।
  5. पोस्ट उबलते, वर्गों, तीन बार, वर्तमान समाधान को हटाने हर बार धोने के समाधान की जगह1x पीबीएस के साथ और 10 मिनट के लिए आंदोलन।
  6. गधा सीरम समाधान (3% सामान्य गधा सीरम, पीबीएस में 0.3% ट्राइटन X-100) कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे के लिए सीरम में ऊतक incubating द्वारा साथ ब्लॉक वर्गों। गधा सीरम समाधान निकालें।
  7. 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी Calbindin और 1 के साथ लेबल धारा: गधा सीरम समाधान में 2,000 विरोधी ataxin -1 एंटीबॉडी (11NQ) 16 और कोमल आंदोलन के साथ 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. (: 500 एलेक्सा स्त्राव-488-विरोधी बकरी और 1: 500 एलेक्सा स्त्राव-594-विरोधी खरगोश गधा सीरम समाधान में पतला एंटीबॉडी 1) 4 डिग्री सेल्सियस पर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी में वर्गों incubating से पहले कदम 6.5 में के रूप में पीबीएस के साथ वर्गों धो लें कोमल आंदोलन के साथ 48 घंटे के लिए।
  9. वर्गों पीबीएस के साथ तीन बार DAPI के साथ लेबलिंग सेल नाभिक से पहले कदम 6.5 (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) समाधान पीबीएस में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला के रूप में धो लें। DAPI ऊष्मायन दस मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। समाधान सुझाएn और कदम 6.5 में के रूप में पीबीएस से धो लें।
  10. बढ़ते मध्यम photobleaching को कम करने के साथ 2% जिलेटिन लेपित स्लाइड पर माउंट ऊतक। Coverslip और नेल पॉलिश के साथ सील।
  11. एक स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के साथ brightfield प्रकाश के तहत सेरिबैलम के प्राथमिक विदर का पता लगाने। एक 10X UIS2 उद्देश्य से स्कैन और क्रमिक रूप से एक DM488 / 559 एनएम के साथ संयोजन के रूप में DAPI, AlexaFluor-488 और AlexaFluor-594 चैनलों 405 एनएम डायोड लेजर, एक 488 एनएम आर्गन गैस लेजर और एक 559 एनएम लेजर डायोड, क्रमशः का उपयोग कर, उत्तेजित dichroic बीम फाड़नेवाला। अलग और SDM490 और SDM560 बीम splitters और एक BA575-675 bandpass फिल्टर, क्रमशः का उपयोग कर प्रकाश उत्सर्जित इकट्ठा।
    1. प्रत्येक चैनल के लिए, जेड = 20 माइक्रोन और कदम = 0.1 माइक्रोन के साथ प्राथमिक विदर के भीतर एक Z ढेर का निर्माण। अंतिम छवि के लिए एक आकार मार्कर में जोड़ने के लिए confocal खुर्दबीन के साथ प्रदान की पोस्ट प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक लेजर, फिल्टर और fluorophores availabili के आधार पर प्रतिस्थापित किया जा सकताTy। अगर AlexaFluor-488 या AlexaFluor-594 का पता लगाने के कमजोर है, एक गैलियम फास्फाइड (GaAsP) उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टर यदि उपलब्ध सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

7. बढ़ाता आणविक परत मोटाई और Purkinje सेल नंबर

  1. का उपयोग ImageJ, सना हुआ प्राथमिक विदर का एक z ढेर छवि को खोलने और मेनू पट्टी, 'रंग' छवि टैब से और 'विभाजित चैनल' रंग से 'छवि' का चयन करके अपने लाल, नीले और हरे रंग चैनलों में प्रत्येक छवि को विभाजित टैब।
  2. प्रत्येक चैनल कि विभाजित किया गया था की एक अधिकतम Z प्रक्षेपण बनाएँ। जब ब्याज के चैनल छवि खुला है, मेनू पट्टी से 'छवि' का चयन, 'धारा' टैब से छवि टैब और 'जेड परियोजना' से 'धारा'। 'जेड-परियोजना' कमांड मेनू के भीतर, चुनें 'मैक्स Z प्रक्षेपण' और क्लिक करें 'ठीक है'। प्रत्येक चैनल के लिए दोहराएँ।
  3. वें से 'प्लगइन्स' का चयन करके सेल काउंटर प्लगइन खोलेंई मेनू पट्टी, प्लगइन्स टैब से 'विश्लेषण' और 'सेल काउंटर "विश्लेषण टैब से।
    नोट: ImageJ और ImageJ सेल काउंटर प्लगइन सामग्री और उपकरणों की तालिका में प्रदान की वेबसाइटों पर डाउनलोड किया जा सकता है।
  4. ataxin-1-लेबल नाभिक कि प्राथमिक विदर के पूर्वकाल और कूल्हों लंबाई की एक पूर्व निर्धारित 200 माइक्रोन खिंचाव के साथ झूठ की गणना के द्वारा Purkinje कोशिकाओं की संख्या यों। सीमा मानचित्र मेन्यू बार से 'छवि' का चयन करके ataxin -1 लेबल नाभिक के मामले में ब्याज की चैनल (लाल रंग का एक सीमा नक्शा बनाने के लिए समायोजित करें टैब से छवि टैब और 'दहलीज' से, का उपयोग करें 'समायोजित' )।
    1. एक पिक्सेल सीमा है कि मात्रा का ठहराव (उदाहरण के लिए 31-225 पिक्सल) के दौरान सामान्य हो सकते हैं चुनें। दहलीज विंडो में "डार्क पृष्ठभूमि" बॉक्स को चेक करके छवियों से शोर त्यागें। छवि संकेत गिनती में आसानी के लिए उलटा किया जा सकता।
  5. यों आणविक परत thicकदम 7.1 और 7.2 में 'के रूप में विभाजित चैनल' और 'दहलीज नक्शा' उपकरण का उपयोग कर ग्रीन चैनल में kness। एक गाइड के रूप में प्रत्येक छवि पर आकार मार्कर का उपयोग करना, बेतरतीब ढंग से प्रत्येक प्राथमिक विदर छवि के 200 माइक्रोन हिस्सों नामित दो में से प्रत्येक के भीतर तीन आणविक परत लंबाई मापने। Purkinje वृक्ष के समान कुंज के बाहर का अंत करने के लिए Purkinje सोमा के आधार पर Purkinje वृक्ष के समान कुंज के समीपस्थ अंत से माप कर।
  6. रिकार्ड Purkinje सेल मायने रखता है और साधन के रूप में आणविक परत मोटाई प्लस या माइनस मानक त्रुटि। कोशिकाओं की संख्या और वृक्ष के समान कुंज की लंबाई पर उपचार की स्थिति या जीनोटाइप के प्रभाव का परीक्षण करने के बाद अनौपचारिक विश्लेषण कई तुलना के साथ एक तरह से एनोवा प्रदर्शन करना।

8. अनुमस्तिष्क succinic एसिड सांद्रता के बाद इलाज के HPLC विश्लेषण

  1. विश्लेषण के लिए नमूना की तैयारी
    1. पहले प्रत्येक काटा सही अनुमस्तिष्कीय गोलार्द्ध वजनएचपीएलसी विश्लेषण में उपयोग करें। एक पूर्व ठंडा Dounce homogenizer में एक समय में कीमा hemispheric हिस्सों एक और 75:25 के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें (मात्रा) के द्वारा पानी: प्रत्येक homogenized आधे से 17 मेथनॉल समाधान।
    2. एक संकीर्ण पूर्व ठंडा homogenizer का उपयोग, मोटे तौर पर 5 Dounce स्ट्रोक के साथ ऊतक टूट गया। जारी पतले एक व्यापक homogenizer के साथ प्रत्येक ऊतक का नमूना भरती करने के लिए, 20 Dounce स्ट्रोक आवेदन।
    3. homogenates स्थानांतरण पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब। प्रत्येक नमूना के बाद, बर्फ के ठंडे पानी के 0.5 एमएल के साथ homogenizer कुल्ला: मेथनॉल समाधान और microcentrifuge ट्यूब कुल्ला जोड़ें।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1300 XG पर और एक साफ microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा अपकेंद्रित्र homogenate नमूने हैं।
    5. 10 kilodalton (केडीए) नाममात्र आणविक वजन सीमा के एक पुनर्जीवित सेलूलोज़ फिल्टर के साथ रखे एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर। तुरंत एचपीएलसी विश्लेषण चल यदि नहीं, तो दुकान -80 डिग्री पर छान नमूनेसी।
  2. एचपीएलसी इंस्ट्रूमेंटेशन और शर्तें
    1. कम से कम 30 सेमी की लंबाई और एक उच्च प्रदर्शन तरल chromatograph के लिए 7 माइक्रोन का एक कण के आकार के साथ एक आयन अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ संलग्न।
    2. तैयार है और 1 मिमी एसीटेट बफर की पर्याप्त मात्रा 5 का पीएच को समायोजित देगास।
    3. 0.8mL / मिनट की एक मोबाइल चरण वेग के साथ एचपीएलसी सेट करें। एक यूवी की तुलना डिटेक्टर का उपयोग करते हैं, तो 224 एनएम के तरंग दैर्ध्य डिटेक्टर का चयन करें। इन परिस्थितियों में succinic एसिड के लिए विशिष्ट क्षालन बार 10 और 12 मिनट के बीच हैं।
  3. चल रहा है और मानक और नमूनों का विश्लेषण
    1. 0 और 250 पीपीएम के बीच succinic एसिड सांद्रता के साथ एसीटेट बफर मोबाइल चरण में मानकों का एक सेट तैयार करें।
    2. प्रत्येक मानक चलाने के लिए और शिखर क्षेत्र प्रत्येक रन से मापा का उपयोग कर एक अंशांकन वक्र तैयार करते हैं।
    3. एक बार एक सटीक मानक की अवस्था प्राप्त की है, एसीटेट बफर में पतला पहले से तैयार नमूने चलाते हैं।माप की अधिक से अधिक सटीकता के लिए, नमूने succinic एसिड के ज्ञात सांद्रता कि मोबाइल चरण में पतला कर दिया है साथ नुकीला जा सकता है। तीन प्रतियों में सभी नमूनों चलाएँ।
    4. एचपीएलसी chromatograms विश्लेषण अंशांकन वक्र का उपयोग और उसके बाद नमूना मात्रा से गुणा और मूल नमूना जन द्वारा विभाजित करके नमूनों की succinic एसिड एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए।

9. पूर्व विवो अनुमस्तिष्क Mitochondrial कार्यक्षमता का विश्लेषण एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड नियंत्रण इकाई का उपयोग

  1. पहले पोटेशियम क्लोराइड की एक बूंद को लागू करने से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर एक क्लार्क प्रकार इलेक्ट्रोड बनाने के लिए (50% KCl w / v) प्लेटिनम कैथोड पर समाधान, वाणिज्यिक तंबाकू का एक 1.5 सेमी 2 टुकड़ा काट रोलिंग कागज और धीरे खत्म पेपर रखने प्लैटिनम कैथोड।
    1. कैथोड और polytetrafluoroethylene (PTFE) कागज का एक टुकड़ा 2.5 सेमी 2 के साथ आसपास के एनोड कवर और snuggly दोनों memb सुरक्षितहे छल्ले के साथ Ranes, यकीन है कि वहाँ बनाने झिल्ली के भीतर कोई सिलवटों या बुलबुले हैं। अच्छी तरह से आसपास में 50% KCl समाधान ड्रिप।
  2. परख के चेंबर में premade इलेक्ट्रोड को सुरक्षित और हवा संतृप्त पानी से भरना। 30 डिग्री सेल्सियस के लिए चैम्बर गरम करें, समाधान के लिए एक 0.8 सेमी हलचल बार जोड़ें और साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 70 rpm पर हलचल। शून्य ऑक्सीजन चैम्बर की स्थापना से जांचना। ऐसा करने के लिए, क्रमानुसार समाधान के लिए एजेंट को कम करने सोडियम dithionite के कुछ क्रिस्टल जोड़ें।
    1. एक बार अंशांकन हासिल की है, 70% इथेनॉल के साथ एक बार चैम्बर धोने, और फिर चैम्बर श्वसन बफर के 1.5 एमएल में acclimate करने के लिए अनुमति देता है (5 मिमी 2 MgCl, 60 मिमी KCl, 100 मिमी mannitol, 10 मिमी से पहले विआयनीकृत पानी के साथ छह बार धोने के.एच. 2 4 पीओ, 0.5 मिमी ना 2 EDTA, 60 मिमी Tris एचसीएल [7.4 पीएच]) 7।
      नोट: सोडियम dithionite के सभी निशान को पूरी तरह से मापने के लिए प्रयास करने से पहले धोने चरणों के दौरान हटा दिया जाना चाहिएश्वसन प्रयोगों के दौरान ऑक्सीजन सांद्रता।
  3. धीरे homogenate बफर के 0.5 एमएल में तौला अनुमस्तिष्कीय गोलार्द्धों homogenize (0.25 एम सुक्रोज, 0.5 मिमी EDTA, 50 मिमी Tris एचसीएल [7.4 पीएच])। एक साफ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब homogenate स्थानांतरण और परख शुरुआत तक ठंडा रखने के लिए।
  4. चैम्बर के लिए homogenate जोड़ें, 2 एमएल के अंतिम मात्रा तक पहुंच गया। digitonin या सैपोनिन (5 मिलीग्राम / एमएल) के 40 μL जोड़कर अनुमस्तिष्कीय homogenate permeabilize; homogenized ऊतक 10 मिनट के लिए सेते दें।
    ध्यान दें: digitonin और सैपोनिन विषाक्त कर रहे हैं, और ऊष्मायन बार एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए।
  5. ऑक्सीजन की खपत रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, सक्रियण और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण श्रृंखला में क्रमश: substrates और अवरोधकों का उपयोग करते हुए (प्रति सब्सट्रेट 3 मिनट रिकॉर्डिंग) के निषेध के माध्यम mitochondrial समारोह का निर्धारण।
    1. इस प्रकार के रूप में साफ सीरिंज का उपयोग कर substrates जोड़ें: 10 μL 2 एम ग्लूटामेट [अंतिम एकाग्रता (एफसी) 0.01 एम],5 μL 0.8 मीटर Malate [एफसी 2 मिमी], 20 μL 0.5 एम adenosine diphosphate (ADP) [एफसी 5 मिमी], 1 μL 1 मिमी rotenone [एफसी 0.5 माइक्रोन के], 20 μL 1M succinic एसिड [10 मिमी], 1 μL 5 मिमी antimycin एक [एफसी 2.5 सुक्ष्ममापी], 1 μL 0.8 मीटर एस्कॉर्बेट [एफसी 0.4 मिमी], और 5 μL 0.2 एम tetramethyl-P-PHENYLENEDIAMINE (TMPD)। [एफसी 0.5 मिमी] जब चैम्बर के लिए substrates जोड़ने प्रणाली में हवा बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहना होगा।
      नोट: प्रत्येक सब्सट्रेट और अवरोध से प्रेरित कार्यात्मक प्रभाव के बारे में विस्तृत जानकारी एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 7 में वर्णित है। व्यक्तिगत खुराक प्रतिक्रिया घटता substrates और तैयारी / ऊतकों / प्रजातियों में अवरोधकों पहले से अध्ययन नहीं की इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए उत्पन्न करने की आवश्यकता हो सकती है। इसी तरह, प्रोटोकॉल के ऊतकों की जन्मजात चयापचय प्रवृत्तियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है / प्रजातियां ऐसी सब्सट्रेट वरीयताओं के रूप में अध्ययन किया जा रहा है।
  6. डेटा संग्रह पूरा हो गया है एक बार, धीरे से एकअनुमस्तिष्कीय homogenates spirate और इथेनॉल और विआयनीकृत पानी के साथ चैम्बर साफ। एक बार साफ, अतिरिक्त अनुमस्तिष्कीय homogenate नमूने के रूप में लंबे समय के PTFE झिल्ली बरकरार है के रूप में करने के लिए अतिरिक्त अंशांकन बिना चलाया जा सकता है। अंतिम पूरा, विआयनीकृत पानी और इथेनॉल और सिलिका जेल या शोषक के साथ दुकान के साथ स्वच्छ इलेक्ट्रोड के बाद।
    नोट: के बीच एक ही दिन चलाता है, विआयनीकृत पानी सुनिश्चित करना है कि झिल्ली बाहर सूखा नहीं है के साथ चैम्बर भरें।
  7. साधन सॉफ्टवेयर के द्वारा बनाई गई डाटा शीट का प्रयोग, दो मिनट शुरुआत श्वसन डेटा का निर्यात 40 मिनट के बाद एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के लिए सब्सट्रेट अलावा।
  8. सब्सट्रेट या अवरोध प्रति श्वसन की दर की गणना। एस्कॉर्बेट-TMPD सब्सट्रेट अलावा दौरान श्वसन दर से कुल श्वसन विभाजित करके डेटा मानक के अनुसार।
    नोट: श्वसन दर आगे जो neurodegeneration प्रयोगों में विशेष रूप से वांछनीय हो सकता है ऊतक के प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत हो सकता हैजिसमें ऊतक सामग्री भिन्न हो सकते हैं। ऐसा करने के लिए, एक मानक प्रोटीन परख में उपयोग के लिए नमूना homogenate (कदम 9.3 से) के 50 μL सुरक्षित रखते हैं।

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Representative Results

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succinic एसिड के साथ अनुमस्तिष्कीय माइटोकॉन्ड्रिया के औषधीय लक्ष्य-निर्धारण के माध्यम से हम अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative रोग Sca1 के एक माउस मॉडल में mitochondrial रोग को रोकने के लिए सक्षम हैं। Succinate डिहाइड्रोजनेज, succinic एसिड, का विहित इलेक्ट्रॉन दाता उपचार और नयूरोपथोलोगिकल मूल्यांकन के दूसरे सप्ताह के दौरान एक महीने के लिए Sca1 चूहों के घर पिंजरे पीने के पानी में भंग कर दिया गया, व्यवहार मूल्यांकन शुरुआत के साथ उपचार (चित्रा 1 ए) के बाद। के रूप में पदचिह्न परख, किरण परख और rotarod परख में तेजी से मापा succinic एसिड उपचार 22 Sca1 चूहों के प्रदर्शन को बेहतर बनाता है। व्यवहार का पता चला सुधार बढ़ाया इंगित करता मोटर समन्वय और मोटर सीखने (चित्रा 1 बी-डी)।

व्यवहार के प्रदर्शन का बचाव सेरे के संरक्षण के साथ संगीत कार्यक्रम में पाया गया थाbellar ऊतक (चित्रा 2)। Succinic एसिड उपचार काफी Purkinje सेल शव संरक्षित और इलाज Sca1 चूहों की तुलना में इलाज Sca1 चूहों में अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर में आणविक परत मोटाई (Purkinje सेल वृक्ष के समान कुंज विस्तार का संकेत) की वृद्धि हुई। Purkinje सेल वृक्ष के समान लंबाई और Purkinje सेल शरीर की गिनती समग्र अनुमस्तिष्कीय cytoarchitecture 5 के मजबूत उपायों प्रदान करते हैं।

एचपीएलसी इलाज चूहों से अनुमस्तिष्क ऊतक पर प्रदर्शन किया गया था कि succinic एसिड पिंजरे पीने के पानी में भंग सत्यापित करने के लिए सफलतापूर्वक रक्त मस्तिष्क बाधा और प्रवेश कर अनुमस्तिष्क ऊतक पार कर गया। एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उपचार आगे की लंबाई बदलती अनुमस्तिष्क ऊतक (आंकड़े 3 ए-बी) तक पहुँचने का एक व्यावहारिक रास्ता के रूप में succinic एसिड की जी भरकर उपचार का समर्थन करता है। हमारे श्वसन प्रयोगों पर जा रहे हैं और हमारे परिणामों के एक अनुसंधान में प्रकाशित किया जाएगापांडुलिपि। यहां हम बताते हैं कि हम सफलतापूर्वक अलग-अलग इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला substrates और अवरोधकों (चित्रा 3 सी) के अलावा पर अनुमस्तिष्कीय आक्सीकारक फास्फारिलीकरण परिसरों के माध्यम से श्वसन की दर रिकॉर्ड कर सकते हैं। अंत में, हम श्वसन परख का उपयोग Sca1 माउस सेरिबैलम में आक्सीकारक फास्फारिलीकरण घाटे और succinic एसिड उपचार द्वारा उन घाटे के उत्क्रमण को दिखाने के लिए होगा।

आकृति 1
चित्रा 1: उपचार योजना और पदचिह्न परख, बीम परख से प्रतिनिधि डेटा और rotarod तेजी। (ए) succinic एसिड उम्र के 17 सप्ताह के शुरुआत में चार सप्ताह के लिए Sca1 चूहों के घर पिंजरे पीने के पानी में भंग कर दिया गया। Sca1 चूहों की उम्र के 5 हफ्तों में गतिभंग phenotype प्रदर्शित करने के लिए शुरू करते हैं। योजनाबद्ध में नहीं दर्शाया तीन साथियों नियंत्रण कर रहे हैं: ve succinic एसिड का इलाज wildtype चूहों,hicle इलाज Sca1 चूहों और वाहन का इलाज wildtype चूहों। व्यवहार के मूल्यांकन के रूप में इस उपचार की अवधि के दौरान आयोजित की गई: सप्ताह 17 के दौरान पदचिह्न परख, सप्ताह 18 के दौरान किरण परख और सप्ताह 19. दौरान rotarod में तेजी उम्र के 20 सप्ताह में चूहों बलिदान किया गया और अनुमस्तिष्क ऊतक इम्युनोपैथोलोजी assays, एचपीएलसी assays और के लिए काटा गया था श्वसन assays। (बी) के पदचिह्न परख से प्रतिनिधि डेटा एक वाहन का इलाज wildtype चाल (ऊपर), वाहन का इलाज Sca1 चाल (मध्य) और एक succinic एसिड का इलाज Sca1 चाल (नीचे) दिखा। (सी) बीम विश्लेषण डेटा succinic एसिड उपचार के साथ Sca1 चूहों के बीम के प्रदर्शन में सुधार (एक सफल चलाने के लिए परीक्षणों की संख्या के रूप में मापा जाता है) दिखा। (* पी <0.05)। (डी) succinic एसिड उपचार में काफी वृद्धि हुई है के रूप में विलंबता द्वारा दिखाया गया गिर करने के लिए Sca1 22 चूहों के rotarod प्रदर्शन तेज करने को बेहतर बनाता है (* पी <0.05)। सीडी पुनः में त्रुटि सलाखोंमतलब की मानक त्रुटि Flect। महत्व एक तरह से एनोवा और एकाधिक तुलना के बाद अनौपचारिक विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Purkinje सेल मायने रखता है और आणविक परत मोटाई इम्युनोपैथोलोजी assays से प्रतिनिधि डेटा। (ए) Purkinje कोशिकाओं की गिनती परख से प्रतिनिधि परिणाम एक वाहन का इलाज नियंत्रण ट्रांसजेनिक अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर (ऊपर), वाहन का इलाज Sca1 अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर (मध्य) और एक succinic एसिड का इलाज Sca1 अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर (नीचे) के लिए दाग दिखा ATXN1 पॉजिटिव नाभिक (लाल) और DAPI (नीला) के साथ counterstained। व्हाइट लाइनों ऊतक के 200 माइक्रोन क्षेत्रों को दर्शातीकोशिकाओं की गिनती के लिए नामित। यह विशेष रूप से विश्लेषण के लिए, एक नियंत्रण ट्रांसजेनिक माउस पर व्यक्त एक Purkinje सेल विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण के तहत एक गैर रोगजनक ATXN1 जीन एक wildtype माउस के बजाय इस्तेमाल किया गया था क्योंकि ट्रांसजेनिक नियंत्रण सुविधाओं को आसानी से परमाणु Purkinje ATXN1 के detectable स्तर और wildtype माउस नहीं करता। नियंत्रण ट्रांसजेनिक माउस एक अनियमित phenotype या अनुमस्तिष्कीय neurodegeneration प्रदर्शित नहीं करता है। (बी) आणविक परत मोटाई परख से प्रतिनिधि परिणाम एक वाहन का इलाज wildtype अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर (ऊपर), वाहन का इलाज Sca1 अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर (मध्य) और एक succinic एसिड का इलाज Sca1 अनुमस्तिष्कीय प्राथमिक विदर (नीचे) दिखा Calbindin के लिए दाग , Purkinje कोशिकाओं के एक मार्कर (सफेद)। तीन अनुमस्तिष्कीय सेल परतों के दो Calbindin के साथ देखे जा सकते हैं। (Purkinje सेल निकायों से मिलकर) मध्य Purkinje सेल परत सबसे बाहरी परत आणविक के साथ दिखाई देता है (Purkinje सीई से मिलकरडालूँगा dendrites)। आणविक परत के ऊतक के प्राकृतिक परतों के कारण प्राथमिक विदर के बीच में प्रकट होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एचपीएलसी और श्वसन assays से प्रतिनिधि परिणाम है। 250 पीपीएम succinic एसिड एसीटेट बफर में पतला और मापा एचपीएलसी चोटी के नीचे क्षेत्र के खिलाफ साजिश रची करने के लिए जाना जाता है सांद्रता के (ए) मानक वक्र। लाइन के समीकरण में इलाज के ऊतकों के नमूनों से अज्ञात succinic एसिड सांद्रता गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (बी) के उपचार के अलग अलग समय के बाद माउस अनुमस्तिष्क ऊतक से प्रतिनिधि खुराक प्रतिक्रिया succinic एसिड चोटियों (या तो 0, 1 या 5 सप्ताह)। शर्तों के तहतवर्णित है, succinic एसिड आम तौर पर 10 और 12 मिनट के बीच eluted। (सी) वाहन का इलाज wildtype माउस अनुमस्तिष्क ऊतक से प्रतिनिधि श्वसन रन। नीली रेखा को दर्शाया गया है ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन, धराशायी लाल रेखा श्वसन दर में परिवर्तन और ठोस लाल रेखा धराशायी लाइन का एक smoothed संस्करण को दर्शाया गया है दर्शाया गया है। डी = digitonin के अलावा, जी / एम = ग्लूटामेट / Malate, एक = ADP के अलावा, आर = rotenone के अलावा के अलावा, एस = succinic एसिड के अलावा, ए.ए. = antimycin ए और ए / टी = एएससी के अलावा के अलावा / TMPD। सभी substrates बार चित्रा में चित्रित पर और प्रोटोकॉल (कदम 9.5) में वर्णित सांद्रता में जोड़ा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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के रूप में वर्णित इन तरीकों का इस्तेमाल कर रहे हैं, वे पता लगाने और अनुमस्तिष्क neurodegenerative रोग चूहों मॉडल में आक्सीकारक फास्फारिलीकरण की मध्यस्थता mitochondrial रोग को समाप्त करने में सक्षम हैं। संयुक्त जैव रासायनिक और व्यवहार assays अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative रोग विकृति को mitochondrial योगदान की सीमा निर्धारित करने के लिए बहुआयामी तरीके हैं। succinic एसिड के साथ चूहों के इलाज के चयापचय को उत्तेजित और mitochondrial समारोह को बढ़ावा देने के द्वारा, हम अनुमस्तिष्कीय व्यवहार घाटे और अनुमस्तिष्क अध: पतन का एक बचाव दिखाने के लिए सक्षम हैं।

यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रणाली अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative रोग के संभावित इलाज के लिए पानी में घुलनशील पाचन लक्षित यौगिकों की एक विस्तृत विविधता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Succinic एसिड आसानी से 0.75 मिलीग्राम / एमएल जो पिंजरे पीने के पानी के माध्यम से सरल प्रसव के लिए अनुमति देता है और पूरक खाना छर्रों के सृजन की जरूरत नहीं है पर पानी में घुलनशील है। अन्य पानी में घुलनशीलयौगिकों आसानी से प्रोटोकॉल में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। पाचन लक्षित यौगिकों कि पानी में घुलनशील नहीं इस्तेमाल कर रहे हैं, तो हमारी कार्यप्रणाली आसानी से पूरक खाना छर्रों 11, 12 के साथ इलाज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जब एक नया परिसर का परीक्षण, यह एचपीएलसी विश्लेषण या अन्य उपयुक्त पहचान पद्धति के माध्यम से उपचार शुरू होने से पहले दवा की अनुमस्तिष्कीय पैठ सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

रोग के मूल्यांकन की बैटरी अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative विकृतियों का पता लगाने में उनकी सूचना प्रभावकारिता के कारण चुना गया था। अनुमस्तिष्कीय neurodegenerative रोग सहित विभिन्न एससीए, और Friedreich गतिभंग 6, 23, 24 के पदचिह्न परख, किरण परख और rotarod परख व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं आकलन। ये विशेष व्यवहार के मूल्यांकन जोरदार अनुमस्तिष्कीय अध: पतन के साथ सहसंबंधी। हालांकि, अन्य behavioraएल मानदंड प्रतिस्थापित या जरूरत के रूप में जोड़ा जा सकता है।

Ataxin -1 और Calbindin साथ Sca1 चूहों में Purkinje कोशिकाओं की लेबलिंग व्यापक रूप से Sca1 मॉडल 5, 20, 21 में अनुमस्तिष्कीय अध: पतन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्य न्यूरोनल चयनात्मक एंटीबॉडी और ऊतक क्षेत्रों के रूप में की जरूरत neurodegeneration के शमन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

श्वसन विश्लेषण शिथिलता या मरम्मत अनुमस्तिष्क ऊतक से अलग-अलग mitochondrial परिसरों के भीतर की विशिष्ट पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। जॉब ऊतक कटाई और परख चल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के बीच के समय को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह नोट करने के लिए ऊतक की एकरूपता विश्लेषण किया जा रहा महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, अनुमस्तिष्क ऊतक दाना न्यूरॉन्स जो हमारे मॉडल में Sca1 transgene व्यक्त नहीं करते के घने होते हैं। इसलिए, इस का एक महत्वपूर्ण कदमप्रोटोकॉल अगर पूरे अनुमस्तिष्कीय श्वसन ऑक्सीडेटिव जटिल कार्य का पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका है निर्धारित करने के लिए है। ट्रांसजेनिक Sca1 माउस सेरिबैलम में श्वसन परिवर्तन सूक्ष्म हो सकता है और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए विषयों की बढ़ी संख्या की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल में विस्तृत व्यवहार और नयूरोपथोलोगिकल विधियों के संयोजन Sca1 रोग के अलग मात्रा का ठहराव प्रदान करते हैं और मजबूती के साथ पानी में घुलनशील यौगिकों के साथ इलाज पर सुधार का पता लगाने कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के महत्व को विभिन्न उपचार और माउस मॉडल की एक विविध सरणी के लिए अपने व्यापक अनुकूलन क्षमता में है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल तकनीक के कई महंगे उपकरण या जटिल तकनीक की आवश्यकता है और इसलिए एक स्नातक अनुसंधान की स्थापना के लिए उपयुक्त हैं नहीं है। इस प्रोटोकॉल के भविष्य अनुप्रयोगों परिसर के उम्र पर निर्भर वितरण पर उपचार प्रभावकारिता की डिग्री का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine diphosphate Sigma Aldrich A2754 ADP
Ascorbate Sigma Aldrich A7631
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153 BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D9542 DAPI
Digitonin Sigma Aldrich D141
Dithiothreitol Sigma Aldrich D0632 DTT
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Glutamate Sigma Aldrich 1446600
Malate Sigma Aldrich 6994
Mannitol Sigma Aldrich M4125
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Potassium-lactobionate Bio-Sugars 69313-67-3
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saponin Sigma Aldrich 47036
Succinic Acid Sigma Aldrich S3674
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma Aldrich T7394 TMPD
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284
Urea Sigma Aldrich U0631
Vectashield mounting medium Vector Labs H-1000
Antibodies
11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody Life Technologies A-11015
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody Life Technologies A-11012
Calbindin antibody (goat) Santa Cruz C-20
Animals
Control transgenic mice Harry Orr, Ph.D. A02 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 mice Harry Orr, Ph.D. B05 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype mice The Jackson Laboratory 001800
Equipment
ESM-100L microtome ERMA Sledge microtome
Fluoview FV1200 Confocal Microscope Olympus
Glycerol-gelatin slides FD Neuro Technologies PO101
Hamilton syringe Sigma Aldrich VCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit Hansatech Instruments
P.T.F.E. paper Cole-Parmer UX-08277-15
Rotallion Rotarod PPP&G contact corresponding author for information
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Software
ImageJ National Institute of Health http://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (for ImageJ) National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) PPP&G contact corresponding author for information
Phidget21.dll (required for rotarod software) DLL-Files.com https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35, (2), 193-210 (2012).
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पानी में घुलनशील यौगिकों के साथ Sca1 चूहे इलाज गैर विशेष mitochondrial समारोह को बढ़ावा देने के
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Ferro, A., Carbone, E., Marzouk, E., Siegel, A., Nguyen, D., Polley, K., Hartman, J., Frederick, K., Ives, S., Lagalwar, S. Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function. J. Vis. Exp. (119), e53758, doi:10.3791/53758 (2017).More

Ferro, A., Carbone, E., Marzouk, E., Siegel, A., Nguyen, D., Polley, K., Hartman, J., Frederick, K., Ives, S., Lagalwar, S. Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function. J. Vis. Exp. (119), e53758, doi:10.3791/53758 (2017).

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