Abstract
Mitokondriell dysfunktion spelar en betydande roll i åldrandet och vid neurodegenerativa sjukdomar inklusive flera ärftliga spinocerebellär ataxi och andra rörelserubbningar som är markerade av progressiv degeneration av cerebellum. Målet med detta protokoll är att bedöma mitokondriell dysfunktion Spinocerebellär ataxi typ 1 (SCA1) och bedöma effekten av farmakologisk målinriktning av metabolisk andning via vattenlösliga föreningen bärnstenssyra för att bromsa sjukdomsförloppet. Denna metod är tillämplig på andra cerebellär sjukdomar och kan anpassas till en mängd vattenlösliga terapier.
Ex vivo-analys av mitokondriell andning används för att detektera och kvantifiera sjukdomsrelaterade förändringar i mitokondriell funktion. Med genetiska bevis (opublicerade data) och proteomik tecken på mitokondriell dysfunktion i SCA1 musmodell utvärderar vi effekten av behandling med vattenlösliga metaboliska booster succinic syra genom upplösning av denna förening direkt i hemmaburen dricksvatten. Förmågan hos läkemedlet att passera blod-hjärnbarriären kan härledas med användning av högupplösande vätskekromatografi (HPLC). Effekten av dessa föreningar kan sedan testas med hjälp av flera beteende paradigm inklusive accelererande rotarod, balansbom test och footprint-analys. Cytoarchitectural integritet lillhjärnan kan bedömas med hjälp av immunofluorescens analyser som detekterar Purkinje cellkärnor och Purkinje cell dendriter och soma. Dessa metoder är robusta tekniker för att bestämma mitokondriell dysfunktion och effekten av behandling med vattenlösliga föreningar i cerebellär neurodegenerativ sjukdom.
Introduction
Mitokondrier är de viktigaste producenterna av adenosintrifosfat (ATP), en viktig coenzym för cellenergi, med de flesta av mitokondriell ATP framställs genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) med hjälp av elektrontransportkedja. Hjärnan, med tanke på dess höga metaboliska krav och dess beroende av oxidativ fosforylering för att driva neural aktivitet, är mycket känslig för mitokondriell dysfunktion. Som ett resultat, är mitokondriell dysfunktion aktiveras under åldrandet 1 och är implicerad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar 2, 3, 4. Härav följer att mitokondrierna är attraktiva terapeutiska mål för neurodegeneration.
I detta protokoll, har vi antagit användningen av Spinocerebellär ataxi typ 1 (SCA1) som förebild neurodegenerativ sjukdom för studier av mitokondrierl dysfunktion och utveckling av mitokondrie-inriktade terapier. SCA1 orsakas av en polyglutamine (polyQ) repeat expansions mutation i ataxin-1-genprodukten vilket utlöser progressiv degeneration av Purkinje-neuroner i cerebellum och neuroner i andra delar av hjärnan. Den transgena musen linje som används här (betecknad som den SCA1 mus), som uttrycker en polyQ-mutant ataxin-1-transgenen under kontroll av en Purkinje-cellspecifik promotor, möjliggör den riktade analys av Purkinje-cellkomponenten i SCA1 5. SCA1 möss genomgår gradvis Purkinje celldegeneration och utveckla ataktisk gång sex.
Mitokondriell komplex dysfunktion och mitokondrie-riktad behandling effekten kan utvärderas med ett batteri av molekylära och beteendemässiga analyser. Mitochondrial komplex dysfunktion mäts ex vivo genom andnings analyser som detekterar förändrad syreförbrukning inom cerebellar vävnad inärvaron av elektrontransportkedjan substrat och hämmare 7. Respirations analyser har tidigare använts med permeabiliserad vävnad, mitokondriella isolat, och hela vävnad 7, 8, 9. De gör det möjligt för direkt bedömning av mitokondriefunktion i motsats till morfologiska metoder för datainsamling såsom transmissionselektronmikroskopi eller immunofluorescensfärgning. Användningen av hela vävnad snarare än isolerade mitokondrier förhindrar snedvridet urval av friska mitokondrier som kan uppstå under isoleringsprocessen 7. Efter anpassning till protokollet som visas, är andningsanalysen en värdefull metod för att detektera mitokondriell dysfunktion i cerebellära neurodegenerativa sjukdomstillstånd.
Icke-specifika aktivatorer av metabolism kan användas för att sluta sig till mitokondriell dysfunktion i transgena möss modeller av neurodegenerativa disease och stöd i utvecklingen av nya terapier. Quercetin, koenzym Q10 och kreatin har alla visat sig lindra neurodegenerativ sjukdomspatologi hos patienter och i djurmodeller för neurodegenerativ sjukdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Här presenterar vi en ny metabolisk aktivator, bärnstenssyra, för att stimulera metabolismen och öka mitokondriefunktion i neurodegenerativ sjukdom. För att säkerställa att aktivatorn korsa blod-hjärnbarriären, var HPLC användas för att detektera leverans till neural vävnad hos behandlade möss 17.
För att utvärdera de terapeutiska effekterna av metaboliskt riktade vattenlösliga föreningar, såsom bärnstenssyra, kan användas ett batteri av beteendeparadigm och immunopatologiska studier. due för samordnings motor brister som konstaterats i cerebellar neurodegenerativ sjukdom, fotavtrycket banan analysen balk analys och accelererande roterande staven analys används för att detektera rädda beteende patologi 6, 18, 19. Dessa åtgärder kompletteras med immunpatologisk bedömning av cerebellär cytoarchitecture genom att bedöma molekylskikttjocklek (definierat som Purkinje cell dendritiska berså längd) och Purkinje cell soma räknas inom ett definierat lob av cerebellär vävnad 6, 20, 21. Här presenterar vi flera neuropatologiska och beteende metoder för upptäckt och behandling av mitokondriell dysfunktion med metaboliskt riktade vattenlösliga föreningar.
Vi använder ex vivo analys av mitokondrie-andning för att analysera mitokondriell dysfunktion i SCA1 transgenic mus. Dessutom visar vi att sjukdomssymptom och patologi förbättras genom den vattenlösliga mitokondriell booster bärnstenssyra, ytterligare blandar mitokondriell dysfunktion SCA1 sjukdomsförloppet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer IACUC riktlinjer vid Skidmore College för att arbeta med möss.
1. Behandling med vattenlösliga föreningar
- Upplösa bärnstensyra till en koncentration av 0,75 mg / ml i bur dricksvatten. Notera att alla vattenlösliga föreningen av intresse vid den önskade koncentrationen kan vara substituerade på detta stadium. Rör om lösningen för att säkerställa att föreningen är helt upplöst.
- Efter möss når önskad ålder av behandling, byt buren dricksvatten av behandlings tillstånd gruppen med lösningen i steg 1,1.
- Mäta vikten av både behandlings- och kontrollgruppen vattenflaskor dagligen för att säkerställa att både behandlade och kontrollmöss dricker samma mängd vatten. Använd dessa mätningar för att beräkna den totala läkemedelsdos per bur. Fortsätta behandlingen under hela experimentet och övervaka flaskvikt.
2. Footprint Analysis
- Placera banan på golvet ellerett bord i ett slutet rum. Ställ in banan på något uppåt mot hemma låda fodrad med sängkläder och belöning mat (t.ex. sötsliskig spannmål). Linje längd av banan med ett vitt papper. Tillåta ämnet acklimatisera i hemmet rutan under 5 min.
- Ta bort föremål från hemmet rutan och måla vänster och höger bakfötterna, respektive, med blå och röd giftfri vattenbaserad färg. Färgtryck kommer att användas för att beräkna Multiple Output beteendemätningar.
- Placera motivet i början av banan och att motivet att gå till hemmet rutan. När ämnet har nått hemma rutan stänga luckan, och tillåta ämnet att hålla sig inom hemmet box för en minut innan den återgår till den respektive buren. Rengör banan och hem låda med 30% etanol och ersätta sängkläder, belöna mat, och banan papper för nästa ämne.
- Kvantifiera antalet steg, bredd av grind, vinkel steg, och antalet varv som vidtagitsämnesvis enligt de analytiska metoder som beskrivs tidigare sex. En framgångsrik fotavtryck prövning definieras som minst 5 sekventiella fotspår där patienten gå mot målet rutan utan att vända sig eller stoppa.
3. Balk Analys
- Inrätta balk apparat enligt bar tvär specifikationer som beskrivs tidigare sex med följande 6 strålar: balk 1 = rektangulär, 28 mm bredd; balken 2 = rund, 28 mm diameter; balk 3 = rektangulär, 12 mm bredd; strålen 4 = rund, 12 mm diameter; balk 5 = rektangulär, 6 mm bredd; balk 6 = rund, 6 mm diameter. I ena änden av balken, inrätta ett mörkt hem låda med belöning mat.
- Att träna ämnen på strålen, montera apparaten med balken 3. Placera försiktigt motivet på änden av balken motsatt till hemmet rutan och låta ämnet att gå över. Låt varje ämne upp till tre 2-min försök att uppnå en lyckad körning, Definierat som passerar balken och in i hemmet rutan inom två minuter. I mellan försöken, låt ämnet resten i hemmet rutan i 2 min. Mellan individer, rengör strålen och hem låda med 30% etanol och ersätta belöningen mat som förberedelse för nästa ämne.
- Upprepa steg 3,2 gång per dag under de kommande två dagarna vilket resulterar i totalt 3 sekventiella utbildningsdagar. Testningen dag, dag 4, ska i tur och ordning följa utbildningsdagar.
- För att testa de ämnen på dag fyra, först montera apparaten med balken 1 och ställa in hem boxen som beskrivs i steg 3,1. Placera en videokamera framför apparaten och kontrollera att hela strålen apparaten kan tydligt fångas på video. Börja spela in och placera det första ämnet på balken motsatt till hemmet rutan, vilket gör att upp till 3 2-min försök att framgångsrikt slutföra en rättegång. I mellan försöken, tillåta föremål att vila under 2 min i hemmet rutan.
- Fortsätt att testa föremål på var och en av de sex balkar i nummerordning,låta ämnet vila under 2 minuter i hemmet rutan innan nästa strålen. Mellan ämnen, rengör varje stråle och hem låda med 30% etanol och ersätta belöningen mat som förberedelse för varje ämne.
- Videoband varje försök och registrera antalet lyckade försök per individ och balk enligt följande: "1" anger ämnet var framgångsrik på den första rättegången, "2" indikerar ämnet var framgångsrik på andra försöket, "3" indikerar motivet var framgångsrik på den tredje och sista försöket, och "4" anger ämnet var inte framgångsrik på någon av de tre försöken.
- Använd videoinspelningar av försök mäter footslips av poäng som förblindade till de experimentella betingelserna i ämnet. Definiera en footslip som hindfoot som är i direkt bild av kameradoppning under en teoretisk mittlinje över längden av balken. Genomsnittlig footslip poäng från flera målskyttar.
- För att analysera antalet successful försök och antal footslips data, beräkna medelvärdet och standardfelet inom varje genotyp och experimentell betingelse kohort. Genomför envägs ANOVA och multipla jämförelser post-hoc-analys för att avgöra om det är en effekt av behandlingen och genotyp om antalet lyckade försök och antalet footslips.
4. Accelererande Rotarod
- Acklimatisera ämnen till analys rum 10 minuter före starten av försöket. Under denna acklimatiseringsperiod förbereda rotarod apparaten, rengöring varje spår av apparaten med 30% etanol.
- Öppna rotarod programvara och ange start inställningar till 4 varv per minut, accelerationsinställningar till 5 min och sista hastighetsinställningar till 40 rpm. Dessa inställningar ger en konstant acceleration 4-40 rpm under en period av 5 min. Möss kan stanna kvar på rotarod vid 40 rpm under ytterligare 5 min längre än accelerationsperioden med högst löplängd av 10 min.
- Post-acklimatisering, placera ämnen onto rotarod i sina respektive banor medan staven roterar vid 4 rpm. När alla ämnen i sina respektive banor, börjar den första rättegången. Spela latensen att falla med hjälp av instrumentets programvara; en sekundär timer kan användas som en backup.
- Efter rättegången avslutad låta varje ämne att vila i sina respektive körfält reservoarer i tio minuter innan nästa försök att förhindra trötthet.
- Upprepa steg 4,3 och 4,4 för totalt fyra försök.
- Upprepa steg från 4,3 till 4,5 för totalt fyra dagar i rad, fortsatt behandling under hela försöksperioden. Efter avslutad, kvantifiera latens att falla av roterande stav för varje försök per ämne 6.
5. Cerebellär Extraction och Fixering
- Avliva möss via kvävning med koldioxid enligt institutionella IACUC riktlinjer. Placera föremål i koldioxidkammare, och släpper ut koldioxid i kammaren. Kolla pådjuret vid alla tidpunkter under euthanizing steget och inte lämnar djuret utan uppsikt.
- När andningen har upphört och ämnen visar ingen återstående smärtupplevelse genom bakfoten genom att avlägsna föremål från kammaren och göra en överlägsen mittlinje snitt genom epitelvävnad från mitten av skallen kaudalt till basen genom epitelvävnad.
- Använda dissektion sax, klippa skallen från basen på ryggmärgen genom sagittal sutur till bregma. Skär i sidled genom varje coronal sutur innan du drar bort frontal, parietala och interparietal ben med trubbiga pincett.
- Använd trubbig pincett för att bryta ben i sidled till lillhjärnan. Använd pincett för att separera cerebellum från colliculi och hjärnstammen och extrudera det från resten av vävnaden. Separera lillhjärnan i vänster och höger halvklot med pincett.
- Placera omedelbart rätt cerebelli i flytande kväve för att spara för HPLC analys och vänstra cerebelli i på förhand kyld 4% paraformaldehyd (PFA) för vävnadsfixering. Skörda någon annan vävnad av intresse innan bryta aorta och kasta stommen enligt institutionella IACUC regler.
VARNING: PFA är en mycket giftig, brandfarlig och frätande. - Tjugofyra timmar efter extraktion, tvätta vävnaden fixeras i PFA (4% i PBS) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (tre gånger, 5 min / tvätt) innan de placeras vävnaden i 30% sackaros vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
6. Immunopathology Assay
- Fäst slangen av en släde mikrotom till ett handfat kran och en temperaturkontroll box. Använda kontrolltemperaturrutan för att kyla den mikrotom scenen till -25 ° C. Ställ snittjocklekar ratten till 50 um.
OBS: Om ratten på släden mikrotom inte når 50 um, ställa ratten på en tunnare inställning och multiplicera tjockleken genom att flytta inställningen i enlighet med (till exempel ställa in ddar e till 10 | j, m och skift fem gånger innan snittning för en total tjocklek av 50 | j, m). - Doppa en dime-storlek del av optimal temperatur Cutting (OTC) lösning på scenen. Innan OTC fryser använder pincett för att placera halvklotet, så att mitten sagittala snittyta är nedåt på OTC lagret. Arbeta snabbt, försiktigt orientera vävnaden med pincett så att den laterala spetsen av halvklotet är riktad mot bladet, överlägsen scenen. Låt OTC att frysa helt.
- Att arbeta i lager, lägga till ytterligare OTC runt vävnaden låta OTC att frysa helt innan du lägger nästa lager. Lägga ett tunt lager av OTC på toppen av vävnaden och frysa.
- Avsnitt vävnaden, fördela lika kroppsvikt på kapskivan medan snittning. Samla sektioner med hjälp av en konstnär pensel och plats i en lämpligt märkt väl platta som innehåller 1x PBS. Mellan sektionerna, på nytt ställa skär tjocklek påsläde mikrotom urtavla, om nödvändigt, till 50 ^ m.
- Ersätta PBS i varje brunn av den väl plattan med urealösning [0,01 M urea i PBS] och placera plattan på is. När du är klar, ta bort plattan från is och koka avsnitt i urealösning tre gånger under 15 sekunder varje gång för att demaskera epitoper för immunmärkningen. Detta steg kan lätt åstadkommas genom att placera plattan på ett värmeblock inställt till kokpunkten. Mellan varje kokningssteget, kyla platta innehållande avsnitten vävnads på is.
OBS: Om du utför urea, blockering, primär antikropp, sekundär antikropp och DAPI steg i en 96-brunnar, använder 100 mikroliter volymer hela. Om en annan storlek väl används, justera reagensvolymer i enlighet därmed. I stället för ett värmeblock, kan en mikrovågsugn användas för att koka vävnadsprover i urea. Mikrovågsugn prov på en hög effektinställning för tre 15 s intervall. - Post kokning, tvätta sektioner tre gånger, varje gång avlägsnar föreliggande lösning, som ersätter den lösningmed 1x PBS och omrörning i 10 minuter.
- Blockdelar med åsna serumlösning (3% normalt donkey serum, 0,3% Triton X-100 i PBS) genom att inkubera vävnaden i serum under en timme med försiktig omrörning vid rumstemperatur. Avlägsna åsna serumlösning.
- Etikett sektioner med 0,2 | j, g / ml anti-calbindin och 1: 2000 anti-ataxin-1-antikropp (11NQ) 16 i donkey serumlösning och inkubera vid 4 ° C under 72 h med försiktig omrörning.
- Tvätta sektioner med PBS som i steg 6,5 före inkubering sektioner i lämplig sekundär antikropp (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-get och en: 500 Alexa Fluor-594-anti-kanin-antikroppar utspädda i åsna serumlösning) vid 4 ° C under 48 h med försiktig omrörning.
- Tvätta sektioner tre gånger med PBS som i steg 6,5 före märkning cellkärnor med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) lösning späddes till en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml i PBS. DAPI inkubation bör inte överstiga tio minuter. avlägsna Solution och tvätta med PBS som i steg 6,5.
- Mount vävnad på 2% gelatinbelagda objektglas med monteringsmedium för att minska fotoblekning. Täckglas och försegla med nagellack.
- Med en svep konfokalmikroskop lokalisera primära spricka i lillhjärnan i bright ljus. Med en 10X UIS2 mål, skanna och sekventiellt exciterar DAPI, Alexafluor-488 och Alexafluor-594 kanaler med en 405 nm diodlaser, en 488 nm argongas laser och en 559 nm diodlaser, respektive, i samband med en DM488 / 559 nm dikroitisk strålsplittrare. Separat och samla emitterade ljuset med hjälp av SDM490 och SDM560 stråldelare och en BA575-675 bandpassfilter, respektive.
- För varje kanal, konstruera en z-stack inuti primär fissuren med z = 20 ^ m och steg = 0,1 ^ m. Använd efterbehandling programvara som följer med konfokalmikroskop att lägga i en storleksmarkör till den slutliga bilden.
OBS: Alternativa lasrar, filter och fluoroforer kan ersättas baserat på availability. Om Alexafluor-488 eller Alexafluor-594 upptäckt är svag, kan en galliumfosfid (GaAsP) högkänslig detektor användas för att öka signal om det finns.
- För varje kanal, konstruera en z-stack inuti primär fissuren med z = 20 ^ m och steg = 0,1 ^ m. Använd efterbehandling programvara som följer med konfokalmikroskop att lägga i en storleksmarkör till den slutliga bilden.
7. Kvantifiera Molecular Tjocklek och Purkinje Cell Tal
- Med hjälp av ImageJ, öppna ett z-stack bild av målat primära spricka och dela varje bild i sina röda, blå och gröna kanaler genom att välja "Bild" från menyraden, "Färg" på fliken Bild och "Split kanaler" från Color flik.
- Skapa en max Z projektion av varje kanal som delades. När kanal bilden av intresse är öppen, välj "Bild" från menyraden, "avsnitt" från fliken Bild och "Z-projekt" på fliken "Sektioner". Inom "Z-projektet" menykommando välj "Max Z projektion" och klicka på "Ok". Upprepa för varje kanal.
- Öppna Cell Counter plugin genom att välja "Plugins" från the menyraden, "Analysera" på fliken Plugins och "Cell Counter" på fliken Analysera.
OBS: ImageJ och ImageJ Cell Counter plugin kan laddas ner på de webbplatser som anges i tabellen för material och utrustning. - Kvantifiera antalet Purkinje-celler genom räkning ataxin-1-märkta kärnor som ligger längs en förutbestämd 200 fim sträcka av främre och bakre längder av den primära fissuren. Använd tröskeln kartan genom att välja "Bild" från menyraden, "Justera" från fliken Bild och "Threshold" från fliken Justera för att göra en tröskel karta över kanalen av intresse (röd när det gäller ataxin-1 märkt kärnor ).
- Välj en pixelområde som kan normaliseras genom kvantifieringen (31-225 pixlar till exempel). Kasta buller från bilderna genom att markera "Mörk bakgrund" rutan i Threshold fönstret. Bildsignal kan inverteras för att underlätta att räkna.
- Kvantifiera molekylskikt thickness i den gröna kanalen med hjälp av "Split kanaler" och "Threshold Karta" verktyg som i steg 7.1 och 7.2. Använda storleksmarkör på varje bild som en guide, slumpmässigt mäta tre molekylära skikt längder inom varje två betecknade 200 um sträckor av varje primär spricka bild. Göra mätningar från den proximala änden av Purkinje dendritiska arbor vid basen av Purkinje soma till den distala änden av Purkinje dendritiska arbor.
- Record Purkinje celler och molekylära skikttjocklek som medel plus eller minus standardfelet. Utföra en-vägs ANOVA med multipla jämförelser post-hoc-analys för att testa effekten av behandlingsbetingelser eller genotyp på antalet celler och längden på den dendritiska arbor.
8. HPLC-analys av Cerebellar bärnstenssyra koncentrationer Efterbehandling
- Framställning av prov för analys
- Väg varje skördade rätt cerebellär hemisfären föreanvändning i HPLC-analys. Mala hemispheric halvor en åt gången i en förut kyld Dounce homogenisator och tillsätt 0,5 ml av 75:25 (volym) vatten: metanol-lösning till varje homogeniserad halv 17.
- Med hjälp av en smal pre-kyld homogenisator, grovt bryta upp vävnaden med 5 Dounce stroke. Fortsätt till fint finhacka varje vävnadsprov med en bredare homogenisator, tillämpa 20 Dounce stroke.
- Överför homogen att i förväg kyld mikrocentrifugrör. Efter varje prov, skölj homogeniseringsanordning med 0,5 ml av iskallt vatten: metanol-lösning och tillsätt sköljn till mikrocentrifugrör.
- Centrifugera homogenat proverna vid 1300 xg under 30 min vid 25 ° C och samla supernatanten i ett rent mikrocentrifugrör.
- Filtrera supernatanten genom en centrifugal filterenhet inrymt med en regenererad cellulosafilter av 10 kilodalton (kDa) nominell molekylviktsgräns. Om inte omedelbart kör HPLC-analys, lagra filtrerade prover vid -80 °C.
- HPLC Instrumentation och villkor
- Fäst en kromatografikolonn jon uteslutning med en längd av minst 30 cm och en partikelstorlek av 7 pm till en högpresterande vätskekromatograf.
- Förbereda och avlufta en tillräcklig mängd av ett mM acetatbuffert justerad till ett pH-värde av 5.
- Ställ in HPLC med en mobilfas hastighet 0,8 ml / min. Om du använder en UV-vis detektor, välj en detektor våglängd 224 nm. Typiska elueringstider för bärnstenssyra under dessa förhållanden är mellan 10 och 12 minuter.
- Löpning och analysera standarder och prover
- Bered en uppsättning standarder i acetatbuffert mobil fas med bärnstenssyrakoncentrationer mellan 0 och 250 ppm.
- Kör varje standard och förbereda en kalibreringskurva med topparean mätt från varje körning.
- När väl en korrekt standardkurva erhålls genom att köra tidigare framställda prover utspädda i acetatbuffert.För större noggrannhet för mätningen kan proverna spetsade med kända koncentrationer av bärnstenssyra som har spätts ut i den mobila fasen. Kör alla prover i tre exemplar.
- Analysera HPLC-kromatogram för bestämning av bärnstenssyra koncentration av proverna med hjälp av kalibreringskurvan och sedan multiplicera med provvolymen och dividera med ursprungliga provmassan.
9. Ex vivo analys av Cerebellar Mitochondrial Funktionalitet Använda en syreelektrod Control Unit
- Skapa en Clark-elektrod med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system genom att först applicera en droppe kaliumklorid (50% KCl w / v) lösningen på platina katod, skär en 1,5 cm 2 bit av kommersiella tobaksrullpapper och försiktigt placera papperet platinakatod.
- Täck katoden och omgivande anoden med en 2,5 cm 2 bit av polytetrafluoreten (PTFE) papper och snuggly säkra både MedlRanes med O-ringar, vilket gör att det inte finns några veck eller bubblor i membranen. Droppa 50% KCl-lösning i den omgivande väl.
- Säkra färdiga elektroden i testkammaren och fylls med luft-mättad vatten. Värma kammaren till 30 ° C, tillsätt en 0,8 cm omrörarstav till lösningen och rör om vid 70 rpm med användning av instrumentets programvara. Kalibrera kammaren genom att etablera noll syre. För att göra detta, seriellt lägga till några kristaller av reduktionsmedel natriumditionit till lösningen.
- När kalibreringen har uppnåtts, tvätta kammaren en gång med 70% etanol, och tvätta sedan sex gånger med avjoniserat vatten innan man tillåter kammaren för att acklimatisera sig i 1,5 ml respiration buffert (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
OBS: måste alla spår av natriumditionit tas bort helt under tvättstegen innan du försöker mätasyrehalter under andningsförsök.
- När kalibreringen har uppnåtts, tvätta kammaren en gång med 70% etanol, och tvätta sedan sex gånger med avjoniserat vatten innan man tillåter kammaren för att acklimatisera sig i 1,5 ml respiration buffert (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
- homogenisera försiktigt de uppvägda cerebellära hemisfärerna i 0,5 ml homogenat-buffert (0,25 M sackaros, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Överför homogenatet till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara kylda tills analysen påbörjas.
- Lägg homogenatet till kammaren, att nå en slutlig volym av 2 ml. Permeabilize cerebellär homogenatet genom att tillsätta 40 mikroliter av digitonin eller saponin (5 mg / ml); tillåta homogeniserad vävnad för att inkubera under 10 min.
OBS: Digitonin och saponin är giftiga, och inkubationstider bör hållas till ett minimum. - Till att börja inspelningen syreförbrukning, bestämma mitokondriefunktion genom aktivering och hämning av oxidativ fosforylering kedjan med substrat och hämmare, respektive (3 min inspelningar per substrat).
- Lägg till substrat med användning av rena sprutor enligt följande: 10 mikroliter 2 M glutamat [slutlig koncentration (fc) 0,01 M]5 mikroliter 0,8 M malat [fc 2 mM], 20 mikroliter 0,5 M adenosindifosfat (ADP) [fc 5 mM], 1 pl 1 mM rotenon [fc 0,5 uM], 20 mikroliter 1 M bärnstenssyra [10 mM], 1 mikroliter 5 mM antimycin A [fc 2,5 uM], 1 mikroliter 0,8 M askorbat [fc 0,4 mM], och 5 mikroliter 0,2 M tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] När du lägger substrat till kammaren vara noga med att inte införa luftbubblor i systemet.
OBS! Detaljerad information om den funktionella konsekvens som orsakas av varje substrat och inhibitor beskrivs i ett tidigare publicerat protokoll 7. Individuella dos-responskurvor kan behöva genereras för att bestämma optimala koncentrationer av substrat och inhibitorer i beredningar / vävnader / arter som inte tidigare studerats. På samma sätt kan protokollet optimeras för medfödda ämnesomsättnings tendenser vävnaden / arter som studeras, såsom substratpreferenser.
- Lägg till substrat med användning av rena sprutor enligt följande: 10 mikroliter 2 M glutamat [slutlig koncentration (fc) 0,01 M]5 mikroliter 0,8 M malat [fc 2 mM], 20 mikroliter 0,5 M adenosindifosfat (ADP) [fc 5 mM], 1 pl 1 mM rotenon [fc 0,5 uM], 20 mikroliter 1 M bärnstenssyra [10 mM], 1 mikroliter 5 mM antimycin A [fc 2,5 uM], 1 mikroliter 0,8 M askorbat [fc 0,4 mM], och 5 mikroliter 0,2 M tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] När du lägger substrat till kammaren vara noga med att inte införa luftbubblor i systemet.
- När datainsamlingen är klar, försiktigt enspirate lillhjärnan homogen och rengör kammaren med etanol och avjoniserat vatten. När ren, ytterligare cerebellära homogenat prover kan köras utan ytterligare kalibrering för så länge PTFE membran förblir intakt. Efter fullbordandet, ren elektrod med avjoniserat vatten och etanol och butik med silikagel eller torkmedel.
OBS: Mellan samma dag körs, fylla kammaren med avjoniserat vatten säkerställa att membranet inte torkar ut. - Använda databladet som skapats av instrumentets programvara, export 40 minuter av andnings uppgifter börjar två minuter efter substrattillsats till ett kalkylprogram.
- Beräkna graden av andning per substrat eller hämmare. Normalisera uppgifter genom att den totala andning av andningsfrekvensen under askorbat-TMPD substrattillsats.
OBS: Respirationshastigheten kan vidare normaliseras till proteinhalten i den vävnad som kan vara särskilt önskvärt i neurodegenerering experimenti vilken vävnadshalt kan variera. För att göra det, reservera 50 mikroliter av provet homogenatet (från steg 9,3) för användning i en standardproteinanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom farmakologisk målinriktning av cerebellär mitokondrier med bärnstenssyra kan vi förhindra mitokondriell dysfunktion i en musmodell av lillhjärnan neurodegenerativ sjukdom SCA1. Den kanoniska elektrondonator av succinatdehydrogenas, bärnstenssyra, löstes i buren dricksvatten SCA1 möss för en månad, med beteendebedömning början under andra behandlingsveckan och neuropatologiska bedömning efter behandling (Figur 1A). Bärnstenssyrabehandling 22 förbättrar prestanda SCA1 möss mätt med fotavtryck analysen balk analys och accelererande rotarod analys. Beteende förbättringar upptäckts indikerar förbättrad koordination och motorisk inlärning (Figur 1B-D).
Räddning av beteende prestanda hittades i samförstånd med en bevarandet av cereBellar vävnad (Figur 2). Bärnstenssyra behandling signifikant bevarade Purkinje cellkroppar och ökad molekylskikttjocklek (tecken på Purkinje cell dendritiska berså förlängning) i lillhjärnan primära spricka i behandlade SCA1 möss jämfört med obehandlade SCA1 möss. Purkinje cell dendritiska längd och Purkinje cellkroppen räknas ge kraftfulla åtgärder av övergripande cerebellär cytoarchitecture 5.
HPLC utfördes på den cerebellär vävnad från behandlade möss för att verifiera att bärnstensyra upplöst i buren dricksvatten framgångsrikt korsade blod-hjärnbarriären och penetreras cerebellär vävnad. En dosresponskurva variera längden av behandlingen ytterligare stöd efter behag behandling av bärnstenssyra som ett lönsamt sätt att nå cerebellär vävnad (figurerna 3A-B). Våra andnings experiment pågår och våra resultat kommer att publiceras i en forskningmanuskript. Här visar vi att vi framgångsrikt kan spela in hastigheten för andning genom cerebellära oxidativ fosforylering komplex vid tillsats av varierande elektrontransportkedjan substrat och inhibitorer (figur 3C). I slutändan kommer vi att använda andnings analys för att visa oxidativ fosforylering underskott i SCA1 mus lillhjärnan och återföring av dessa underskott av bärnstenssyrabehandling.
Figur 1: behandlingsschema och representativa uppgifter från Footprint-analys, Beam analys och snabbare Rotarod. (A) Bärnstenssyra löstes i hembur dricksvatten av SCA1 möss i fyra veckor med början vid 17 veckors ålder. SCA1 möss börjar visa ataxi fenotyp vid 5 veckors ålder. Ej visad i den schematiska är tre kontroll kohorter: bärnstenssyrabehandlade vildtyp möss, vedonet behandlade SCA1 möss och vehikelbehandlade vildtyp möss. Beteende bedömningar genomfördes under behandlingsperioden på följande sätt: fotavtryck analys under vecka 17, balk analys under vecka 18 och accelererande rotarod under vecka 19. Vid 20 veckors ålder avlivades mössen och cerebellär vävnad skördades för immunpatologi analyser, HPLC-analyser och respirations analyser. (B) Representativa data från fotavtrycket analysen påvisar ett vehikelbehandlad vildtyp gait (överst), vehikelbehandlade SCA1 gait (mitten) och en bärnstenssyrabehandlade SCA1 gait (botten). (C) Beam analysdata visar förbättrad balk prestanda (mätt som antal försök för en lyckad körning) av SCA1 möss med bärnstenssyrabehandling. (* P <0,05). (D) Bärnstenssyra behandling signifikant förbättrar accelererande rotarod prestanda SCA1 22 möss, såsom visas av en ökad latens för att falla (* p <0,05). Felstaplar i CD reflektera standardfelet av medelvärdet. Signifikans bestämdes genom en-vägs ANOVA och multipla jämförelser post-hoc-analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa uppgifter från de Purkinje celler och molekylär Tjocklek immunopatologi analyser. (A) Representativa resultat från Purkinje cellräkningar assay visar en vehikelbehandlad kontroll transgen cerebellär primära fissure (överst), vehikelbehandlade SCA1 cerebellär primära fissure (mitten) och en bärnstenssyrabehandlade SCA1 cerebellär primära fissure (botten) färgades för ATXN1-positiva kärnor (röd) och motfärgades med DAPI (blå). Vita linjer skildra 200 um regioner av vävnadavsedda för cellräkning. För denna speciella analys, en styr transgen mus som överuttrycker en icke-patogen ATXN1 genen under kontroll av en Purkinje cellspecifik promotor användes i stället för en vildtyp mus eftersom de transgena kontrollfunktioner lätt detekterbara nivåer av nukleärt Purkinje ATXN1 och vildtyp-mus gör inte. Styr transgen mus visar inte en ataxic fenotyp eller cerebellär neurodegeneration. (B) Representativa resultat från skikttjockleken assay molekyl visar en vehikelbehandlad vildtyp cerebellär primära fissure (överst), vehikelbehandlade SCA1 cerebellär primära fissure (mitten) och en bärnstenssyrabehandlade SCA1 cerebellär primära fissure (botten) färgades för calbindin , en markör för Purkinje celler (vit). Två av de tre cerebellära cellskikt kan visualiseras med calbindin. Den mellersta Purkinje cellager (bestående av Purkinje cellkroppar) är synliga tillsammans med det yttersta molekylära skikt (bestående av Purkinje cell dendriter). Den molekylära skiktet visas i mitten av det primära fissur på grund av de naturliga veck av vävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat från HPLC och respiration analyser. (A) Standardkurva av kända koncentrationer upp till 250 ppm bärnstenssyra utspädd i acetatbuffert och plottades mot området under den uppmätta HPLC-topp. Ekvationen för linjen användes för att beräkna okända bärnstenssyrakoncentrationer från behandlade vävnadsprover. (B) Representativa dos-responsbärnstenssyra toppar från mus cerebellär vävnad efter olika tider av behandling (antingen 0, 1 eller 5 veckor). Under de betingelserbeskrivits, bärnstenssyra typiskt eluerade mellan 10 och 12 min. (C) representant andning springa från vehikelbehandlade vildtyp mus cerebellär vävnad. Den blå linjen visar förändringen i syrekoncentration, visar den streckade röda linjen ändringen i andningsfrekvensen och det fasta röda linjen visar en glättad version av den streckade linjen. D = tillsats av digitonin, G / M = tillsats av glutamat / malat, A = tillsats av ADP, R = tillsats av rotenon, S = tillsats av bärnstenssyra, AA = tillsats av antimycin A och A / T = tillsats av ASC / TMPD. Alla substrat tillsattes vid de tider som visas i figuren och i de koncentrationer som beskrivs i protokollet (steg 9,5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om dessa metoder används som beskrivs, de kan upptäcka och minska oxidativ fosforylering-medierad mitokondriell dysfunktion i cerebellära neurodegenerativa sjukdomar musmodeller. De kombinerade biokemiska och beteendemässiga analyser är mångfacetterade metoder för att bestämma omfattningen av mitokondriella bidrag till cerebellär neurodegenerativ sjukdom patologi. Genom att behandla möss med bärnstenssyra för att stimulera ämnesomsättningen och öka mitokondriefunktion, har vi möjlighet att visa en räddning av cerebellära beteendestörningar och cerebellär degeneration.
Den metod som presenteras här kan användas för att testa en mängd olika vattenlösliga metaboliskt riktade föreningar för potentiell behandling av cerebellär neurodegenerativ sjukdom. Bärnstenssyra är lättlösligt i vatten vid 0,75 mg / ml som möjliggör enkel leverans via bur dricksvatten och inte nödvändigt att skapa kompletterade foderpellets. Andra vattenlösligaföreningar kan lätt ersättas i protokollet. Om du använder metaboliskt riktade föreningar som inte är vattenlösliga, kan vår metod kan lätt anpassas för behandling med kompletterade foderpellets 11, 12. Vid provning av en ny förening, är det viktigt att kontrollera lillhjärnan penetration av läkemedlet innan behandling via HPLC-analys eller annat lämpligt detektionsmetod.
Batteriet i patologiska bedömningar valdes på grund av deras redovisade effektivitet vid detektering av cerebellära neurodegenerativa sjukdomar. De fotavtryck analys är balkanalys och rotarod analys ofta används bedömningar av cerebellär neurodegenerativ sjukdom inklusive olika SCAs och Friedreichs ataxi 6, 23, 24. Dessa särskilda beteende bedömningar korrelerar starkt med cerebellär degeneration. Men andra behavioral paradigm kan vara substituerad eller tillsättas efter behov.
Märkningen av Purkinje celler i SCA1 möss med ataxin-1 och calbindin används ofta för att upptäcka lill degeneration i SCA1 modeller 5, 20, 21. Andra neuronal-selektiva antikroppar och vävnadsområden kan användas för att visualisera lindring av neurodegeneration efter behov.
Andning analys är ett kraftfullt verktyg för specifik detektion av dysfunktion eller reparation inom enskilda mitokondriella komplex från cerebellär vävnad. Försiktighet bör vidtas för att minimera tiden mellan skörd av vävnad och kör analysen för att uppnå reproducerbara resultat. Det är också viktigt att notera homogeniteten hos vävnaden som analyseras. Specifikt består cerebellär vävnad överväldigande av granulära neuroner som inte uttrycker den SCA1 transgenen i vår modell. Därför ett kritiskt steg i dennaprotokollet är att avgöra om hela cerebellär andning är en livskraftig metod för detektion av oxidativ komplex funktion. Andning förändringar i den transgena SCA1 musen lillhjärnan kan vara subtil och kan kräva ökat antal individer för att uppnå statistiskt signifikanta resultat.
Kombinationen av beteende- och neuropatologiska metoder som beskrivs i detta protokoll ge ett påvisbart kvantifiering av SCA1 sjukdom och kan kraftigt upptäcka förbättring vid behandling med vattenlösliga föreningar. Betydelsen av detta protokoll är i sitt breda anpassningsförmåga till olika behandlingar och en mångfald av musmodeller. Dessutom är många av de tekniker som används i detta protokoll inte kräver dyr utrustning eller komplicerad teknik och är därför lämpliga för en grund forskningsmiljö. Framtida tillämpningar av detta protokoll kommer att användas för att bedöma graden av behandlingseffektivitet på åldersberoende leverans av föreningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
