Abstract
Mitokondriel dysfunktion spiller en væsentlig rolle i aldringsprocessen og i neurodegenerative sygdomme, herunder flere arvelige spinocerebellar ataksi og andre bevægelsesforstyrrelser præget af progressiv degeneration af lillehjernen. Målet med denne protokol er at vurdere mitokondrielle dysfunktioner i Spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) og vurdere effekten af farmakologiske målretning af metabolisk respiration via vandopløselig forbindelse ravsyre til at bremse sygdommens progression. Denne fremgangsmåde kan anvendes til andre cerebellare sygdomme og kan tilpasses med en masse vandopløselige terapier.
Ex vivo-analyse af mitokondriel respiration anvendes til påvisning og kvantificering sygdomsrelaterede ændringer i mitokondrisk funktion. Med genetisk beviser (upublicerede data) og proteomisk dokumentation for mitokondriel dysfunktion i SCA1 musemodel, vi evaluere effekten af behandlingen med det vandopløselige metaboliske booster succinic syre ved opløsning af denne forbindelse direkte ind i hjemmet bur drikkevand. Evnen af medikamentet til at passere blod-hjerne-barrieren kan udledes ved anvendelse af højtydende væskekromatografi (HPLC). Effekten af disse forbindelser kan derefter testes ved hjælp af flere adfærdsmæssige paradigmer herunder den accelererende roterende stav, balance beam test og footprint-analyse. Cytoarchitectural integritet cerebellum kan vurderes ved anvendelse immunofluorescensassays der registrerer Purkinje cellekerner og purkinjecelle dendritter og soma. Disse metoder er robuste teknikker til bestemmelse mitokondriel dysfunktion og effekten af behandling med vandopløselige forbindelser i cerebellær neurodegenerativ sygdom.
Introduction
Mitokondrier er de vigtigste producenter af adenosintriphosphat (ATP), et essentielt coenzym for cellulær energi, med de fleste af mitokondrie ATP produceres ved oxidativ phosphorylering (OXPHOS) under anvendelse elektrontransportkæden. Hjernen, på grund af dens høje metaboliske krav og dens afhængighed af oxidativ phosphorylering til strømforsyning neurale aktivitet, er meget modtagelige for mitochondrial dysfunktion. Som følge heraf er mitokondriel dysfunktion udløses under modningen 1 og er impliceret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme 2, 3, 4. Derfor følger det, at mitokondrier er attraktive terapeutiske mål for neurodegeneration.
I denne protokol, har vi vedtaget at anvende Spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) som model neurodegenerativ sygdom for studiet af mitokondrierl dysfunktion og udvikling af mitokondrie-målrettede behandlinger. SCA1 er forårsaget af en polyglutamine (polyQ) repeat ekspansion mutation i ataxin-1-genproduktet, der udløser progressiv degeneration af Purkinje-neuroner i cerebellum og neuroner fra andre hjerneområder. Den transgene mus anvendes her line (betegnet som SCA1 mus), der udtrykker et polyQ-mutant ataxin-1-transgen under kontrol af en Purkinje-cellespecifik promotor, muliggør målrettet analyse af Purkinje-celle komponent SCA1 5. SCA1 mus undergår gradvis purkinjecelle degeneration og udvikle ataxiske gangart 6.
Mitokondriel kompleks dysfunktion og mitokondrie-målrettet behandling effektivitet kan evalueres med et batteri af molekylære og adfærdsmæssige analyser. Mitokondriel kompleks dysfunktion måles ex vivo ved respiration assays, der registrerer ændret oxygenforbrug inden cerebellare væv itilstedeværelsen af elektrontransportkæden substrater og inhibitorer 7. Respiration assays er tidligere blevet anvendt med permeabiliserede væv, mitokondrielle isolater, og hele væv 7, 8, 9. De gør det muligt for direkte vurdering af mitokondriefunktionen modsætning morfologiske dataindsamlingsmetoder såsom transmission elektronmikroskopi eller immunfluorescensfarvning. Brugen af hele væv snarere end isolerede mitokondrier forhindrer forudindtaget udvalg af sunde mitochondrier, der kan opstå i løbet af isolation proces 7. , Tilpasset protokol som vist, respiration assayet er en værdifuld metode til detektion mitokondriel dysfunktion i cerebellare neurodegenerative sygdomstilstande.
Ikke-specifikke aktivatorer af metabolisme kan anvendes til at udlede mitokondriel dysfunktion i transgene musemodeller af neurodegenerative disease og støtte i udviklingen af nye terapier. Quercetin, coenzym Q10 og kreatin har alle vist sig at lindre neurodegenerativ sygdom patologi hos patienter og i dyremodeller af neurodegenerativ sygdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Her præsenterer vi en hidtil ukendt metabolisk aktivator, ravsyre, stimulere stofskiftet og øge mitokondriefunktion i neurodegenerativ sygdom. For at sikre, at aktivatoren krydser blodhjernebarrieren, blev HPLC anvendt til at påvise levering til neuralt væv i behandlede mus 17.
For at evaluere de terapeutiske virkninger af metabolisk målrettet vandopløselige forbindelser, såsom ravsyre, kan anvendes et batteri af adfærdsmæssige paradigmer og immunopatologiske undersøgelser. duE den motoriske mangler på cerebellar neurodegenerativ sygdom, fodaftryk landingsbanen assay stråle assay og accelererende roterende stang-assay anvendes til at opdage redning af adfærdsmæssig patologi 6, 18, 19. Disse foranstaltninger suppleres med immunpatologisk vurdering af cerebellare cytoarchitecture ved at vurdere molekylær lagtykkelse (defineret som purkinjecelle dendritiske lysthus længde) og purkinjecelle soma tæller inden for et afgrænset lobule af cerebellar væv 6, 20, 21. Her præsenterer vi flere neuropatologiske og adfærdsmæssige metoder til påvisning og behandling af mitokondriel dysfunktion med metabolisk målrettet vandopløselige forbindelser.
Vi bruger ex vivo analyse af mitokondriel respiration til at analysere mitokondriel dysfunktion i SCA1 transgenic mus. Endvidere viser vi, at sygdomssymptomer og patologi forbedres ved den vandopløselige mitokondrie booster ravsyre, yderligere implicerer mitokondriel dysfunktion i SCA1 sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger IACUC retningslinjer på Skidmore College for at arbejde med mus.
1. Behandling med vandopløselige forbindelser
- Opløs ravsyre til en koncentration på 0,75 mg / ml i bur drikkevand. Bemærk, at enhver vandopløselig forbindelse af interesse i den ønskede koncentration kunne erstattes på dette stadium. Stir løsning til at sørge for, at forbindelsen er helt opløst.
- Efter mus når den ønskede alder af behandling, udskifte hjembur drikkevand af behandlingen tilstand gruppen med opløsningen i trin 1.1.
- Vejning af både behandlings- og kontrolgrupper gruppe vandflasker dagligt for at sikre, at både behandlede og kontrolmus drikker den samme mængde vand. Brug disse målinger til at beregne det samlede dosis lægemiddel pr bur. Fortsæt behandlingen i hele eksperimentet og monitor flaske vægt.
2. Footprint Analyse
- Placer landingsbanen på gulvet elleren tabel i et lukket rum. Indstil landingsbanen i lidt opad mod hjemmet kasse foret med strøelse og belønning mad (f.eks sukkerholdige korn). Linje længden af landingsbanen med et ark hvidt papir. Lad patienten akklimatisere i hjemmet boksen i 5 min.
- Fjern emnet fra hjemmet boksen og male venstre og højre bagben med henholdsvis blå og røde ugiftige vandbaseret maling. De maling udskrifter vil blive brugt til at beregne flere output adfærdsmæssige målinger.
- Placer emnet i begyndelsen af landingsbanen og lade emnet at gå til hjemmet kassen. Når emnet har nået hjem boksen lukke lemmen, og tillade emnet at blive i hjemmet boksen i et minut før returnering til det respektive bur. Rengør landingsbanen og hjem boks med 30% ethanol og erstatte strøelse, belønne mad, og landingsbane papir til næste emne.
- Kvantificer antal skridt, bredde gate, vinkel trin, og antal omgange tagetefter emne ifølge analysemetoderne tidligere 6 beskrevne. En vellykket fodaftryk forsøg defineres som et minimum af 5 sekventielle fodspor, hvor emnet er walking mod mål boksen uden at vende sig eller stoppe.
3. Beam Analysis
- Opsæt stråle ifølge specifikationer bar cross tidligere beskrevne 6 med følgende 6 bjælker: beam 1 = rektangulære, 28 mm bredde; beam 2 = runde, mm i diameter 28; bjælken 3 = rektangulære, 12 mm bredde; beam 4 = runde, mm i diameter 12; beam 5 = rektangulær, 6 mm bredde; bjælke 6 = rund, 6 mm i diameter. I den ene ende af bjælken, nedsat en formørket hjem kasse med belønning mad.
- At træne fag på bjælken, samle apparatet med bjælken 3. Placer forsigtigt emnet på enden af bjælken modsat hjem boksen, og lade emnet at gå på tværs. Tillad hvert emne op til tre 2-min forsøg for at opnå en vellykket løb, Defineret som at krydse bjælken og ind i hjemmet boksen inden for 2 min. I mellem forsøg, lad emnet hvile i hjemmet boksen i 2 min. I mellem forsøgspersoner, rense strålen og hjem boks med 30% ethanol og erstatte belønning fødevarer som forberedelse til det næste emne.
- Gentag trin 3.2 gang om dagen i de næste to dage, fordi det i alt 3 sekventielle uddannelsesdage. Afprøvningen dag, dag 4, bør sekventielt følge træningsdage.
- For at teste de emner på dag 4, første samle apparatet med bjælken 1 og opsætte hjem kassen som beskrevet i trin 3.1. Placer et videokamera foran apparatet og kontrollere, at den fulde stråle apparat kan tydeligt fanget på video. Begynd optagelse og placere første emne på bjælken modsat hjem boksen, giver mulighed for op til 3 2-min forsøg på at fuldføre en retssag. I mellem forsøg tillade underlagt hvile i 2 minutter i hjemmet boksen.
- Fortsæt med at teste emne på hver af de seks bjælker i nummerorden,lade emnet hvile i 2 minutter i hjemmet boksen, før du begynder den næste stråle. Mellem fag, rengøre hver bjælke og hjemmet boks med 30% ethanol og erstatte belønning mad som forberedelse til hvert fag.
- Videobånd hvert forsøg og registrere antallet af vellykkede forsøg pr genstand per stråle som følger: '1' angiver emnet var en succes på den første retssag, "2" angiver emnet var en succes på den anden retssag, "3" angiver emnet var succes på den tredje og sidste forsøg, og '4' angiver emnet ikke lykkedes på nogen af de tre forsøg.
- Brug videooptagelser af forsøg måle footslips af holdrekorder der blændet til de eksperimentelle betingelser for emnet. Definer en footslip som Poterne, der er i direkte visning af kameraets dyppe under en teoretisk midterlinjen på kryds af bjælken. Gennemsnitlige footslip scoringer fra flere Scorers.
- For at analysere antallet af successful forsøg og antal footslips data, beregne middelværdien og standardafvigelsen inden for hver genotype og eksperimentel tilstand kohorte. Foretage envejs ANOVA og multiple sammenligninger post-hoc analyse for at bestemme, om der er en virkning af behandlingen og genotype på antallet af vellykkede forsøg og antallet af footslips.
4. Hurtigere rotarod
- Akklimatisere emner til prøverum 10 min før starten af forsøget. I løbet af denne akklimatiseringsperiode forberede rotarod apparat, rengøring hver bane af apparatet med 30% ethanol.
- Åbn rotarod software og sæt starte indstillinger til 4 rpm, acceleration indstillinger til 5 min og sidste hastigheder til 40 rpm. Disse indstillinger giver en konstant acceleration fra 4 - 40 omdrejninger i minuttet i løbet af et tidsrum på 5 min. Mus kan forblive på roterende stav ved 40 rpm i yderligere 5 min over accelerationen varighed for en maksimal runlængde på 10 min.
- Post-akklimatisering, sted fag onto rotarod i deres respektive baner mens stangen roterer ved 4 opm. Når alle emner er i deres respektive baner, begynder den første retssag. Optag latenstiden til at falde ved hjælp af instrumentet software; en sekundær timer kan anvendes som en backup.
- Efter forsøg færdiggørelse, tillade hvert emne til hvile i deres respektive lane reservoirer i ti minutter før det næste forsøg for at forhindre træthed.
- Gentag trin 4.3 og 4.4 for i alt fire forsøg.
- Gentag trin 4,3-4,5 i alt fire på hinanden følgende dage, fortsat behandling i hele forsøgsperioden. Ved afslutning, kvantificere latenstid at falde ned fra roterende stang til hvert forsøg per emne 6.
5. cerebellare Udvinding og Fiksering
- Afliv mus via kuldioxid kvælning efter institutionelle IACUC retningslinjer. Placer emne ind i kuldioxid kammer, og slip kuldioxid ind i kammeret. Urdyret på alle tidspunkter i løbet af euthanizing trin, og ikke forlader dyret uden opsyn.
- Når åndedrættet ophører og fag viser ingen resterende smerteopfattelse af bagben tryk, fjern genstand fra kammer og gøre en overlegen midtlinjeincision gennem epitelvæv fra midten af kraniet kaudalt til basen af kraniet gennem epitelvæv.
- Brug af dissektion saks, klippe kraniet fra basen på rygmarven gennem sagittale sutur til bregma. Skær sideværts gennem hver koronal sutur inden du trækker væk fra frontal, parietal og interparietal knogler ved hjælp stumpe pincet.
- Brug blunt pincet til at afbryde bone lateral til lillehjernen. Brug pincet til at adskille lillehjernen fra colliculi og hjernestammen og ekstrudere den fra resten af vævet. Adskil lillehjernen i venstre og højre hjernehalvdel med pincet.
- Anbring straks rette cerebelli i flydende nitrogen for at spare op til HPLC analysis og venstre cerebelli i nedkølede 4% paraformaldehyd (PFA) for vævs fiksering. Høst noget andet væv af interesse, før overskæring af aorta og kassere slagtekroppen efter institutionelle IACUC regler.
ADVARSEL: PFA er et meget giftigt, brandfarligt, og ætsende. - Fireogtyve timer efter ekstraktion, vask væv fikseret i PFA (4% i PBS) i phosphatbufret saltvand (PBS) (tre gange, 5 min / vask) før placering af vævet i 30% saccharose ved 4 ° C i op til 2 uger.
6. Immunopathology Assay
- Fastgør slangen af en slæde mikrotom til en vask vandhane og en temperatur kontrolboks. Brug temperaturen styreboks til afkøling af mikrotomen fase til -25 ° C. Indstil sektionering tykkelse drejeknappen til 50 um.
BEMÆRK: Hvis skiven på slæden mikrotom ikke når 50 um, sætte skiven til en tyndere indstilling og formere tykkelsen ved at flytte indstillingen i overensstemmelse hermed (f.eks indstille dundervægter le til 10 um og skift fem gange før sektionering for en total tykkelse på 50 um). - Dup en skilling størrelse del af optimale temperatur Skæring (OTC) løsning på scenen. Før OTC fryser, bruge pincet til at placere halvkugle, så midten af sagittale snit overflade vender nedad på OTC-laget. Arbejder hurtigt, blidt orientere vævet med en pincet, så at den laterale spids halvkugle peger mod klingen, overlegen i forhold til scenen. Tillad OTC til at fryse helt.
- Arbejde i lag, tilføje ekstra OTC omkring vævet tillader OTC til at fryse helt, før du tilføjer det næste lag. Tilføj et tyndt lag af OTC ovenpå vævet og fryse.
- § vævet, distribution lige kropsvægt på klingen, mens sektionering. Saml sektioner ved hjælp af en fin kunstner pensel og sted i en passende mærket godt plade indeholdende 1x PBS. Mellem sektioner, re-sæt opskæring tykkelse påslæde mikrotom urskive, hvis det er nødvendigt, til 50 um.
- Erstatte PBS i hver brønd af brønden-plade med urea-opløsning [0,01 M urinstof i PBS] og placere pladen på is. Når du er klar, fjernes pladen fra is og kog sektioner i urea løsning tre gange i 15 s hver gang at afsløre epitoper for immunolabeling. Dette trin kan let udføres ved at placere pladen på en varmeblok indstillet til kogetemperatur. Mellem hver kogende trin afkøles pladen indeholdende vævssnit på is.
BEMÆRK: Hvis der udføres urinstoffet, blokering, primært antistof, sekundære antistof og DAPI trin i en plade med 96 brønde, bruge 100 pi volumener overalt. Hvis der anvendes en anden størrelse godt, justere reagens mængder i overensstemmelse hermed. I stedet for en varmeblok, kan en mikrobølgeovn anvendes til at koge vævsprøver i urea. Mikroovn prøverne på en høj effekt indstilling i tre 15 s intervaller. - Indlæg kogning, vask sektioner tre gange, hver gang fjernelse foreliggende løsning, der erstatter opløsningenmed 1x PBS og omrøre i 10 min.
- Bloker sektioner med æsel serum-opløsning (3% normalt æsel serum, 0,3% triton X-100 i PBS) ved inkubation af væv i serum i en time under forsigtig omrøring ved stuetemperatur. Fjern æsel serum opløsning.
- Label sektioner med 0,2 ug / ml anti-calbindin og 1: 2.000 anti-ataxin-1-antistof (11NQ) 16 i donkey serum opløsning og inkuber ved 4 ° C i 72 timer under forsigtig omrøring.
- Vask sektioner med PBS som i trin 6.5, før inkubering sektioner i passende sekundært antistof (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-ged og 1: 500 Alexa Fluor-594-anti-kanin-antistoffer fortyndet i donkey serum opløsning) ved 4 ° C i 48 timer med forsigtig omrøring.
- Vask sektioner tre gange med PBS som i trin 6.5 før mærkning cellekerner med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) opløsning fortyndet til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml i PBS. DAPI inkubation bør ikke overstige ti minutter. Fjern opklaringn og vask med PBS som i trin 6.5.
- Mount væv på 2% gelatine-coatede objektglas med montering medium for at reducere fotoblegning. Dækglasset og forsegle med neglelak.
- Med et konfokalt lokalisere den primære revne af lillehjernen under brightfield lys. Med en 10X UIS2 mål, scanne og sekventielt excite DAPI, AlexaFluor-488 og AlexaFluor-594 kanaler under anvendelse af en 405 nm diode laser, en 488 nm argon gas laser og et 559 nm diode laser henholdsvis i forbindelse med en DM488 / 559 nm dikroisk strålesplitter. Separat og indsamle udsendte lys ved hjælp SDM490 og SDM560 stråledelere og et BA575-675 båndpasfilter hhv.
- For hver kanal, konstruere en z-stak i den primære revne med z = 20 um og trin = 0,1 um. Brug efterbehandling software følger med konfokal mikroskop for at tilføje i en størrelse markør til det endelige billede.
BEMÆRK: Alternative lasere, filtre og fluoroforer kan erstattes baseret på availability. Hvis AlexaFluor-488 eller AlexaFluor-594 detektion er svag, kan en galliumphosphid (Gaasp) højfølsom detektor anvendes til at forstærke signalet, hvis tilgængelige.
- For hver kanal, konstruere en z-stak i den primære revne med z = 20 um og trin = 0,1 um. Brug efterbehandling software følger med konfokal mikroskop for at tilføje i en størrelse markør til det endelige billede.
7. Kvantificering Molekylær lagtykkelse og purkinjecelle Numbers
- Ved hjælp af ImageJ, åbne en z-stak billede af farvet primære revne og opdele hvert billede i sine røde, blå og grønne kanaler ved at vælge 'Billede' i menulinjen, 'Farve' under fanen Billede og 'Split Kanaler' fra Color fane.
- Opret en max Z projektion af hver kanal, der blev delt. Når kanalen billedet af interesse er åbent, skal du vælge 'Billede' i menulinjen, »sektioner« fra fanen Billede og 'Z-projekt' fra fanen 'Sektioner ". Inden for "Z-projekt 'kommando skal du vælge' Max Z projektion 'og klik på' OK '. Gentag for hver kanal.
- Åbn Cell Counter plugin ved at vælge "Plugins" fra the menulinje, "Analyze 'under fanen plugins og" Cell Counter "fra fanen Analyser.
BEMÆRK: ImageJ og ImageJ Cell Counter plugin kan downloades på de hjemmesider, der er fastsat i tabellen af materialer og udstyr. - Kvantificere antallet af Purkinjeceller ved tælling ataxin-1-mærkede kerner, der ligger langs en forudbestemt 200 um strækning af forreste og bageste længder af den primære revne. Brug tærsklen kortet ved at vælge "Billede" fra menulinjen, "Adjust" fra fanen Billedkvalitet og 'Threshold "fra fanen Juster for at gøre en tærskel kort over kanalen af interesse (rød i tilfælde af ataxin-1 mærkede kerner ).
- Vælg en pixel område, der kan normaliseres hele kvantificering (31-225 pixels for eksempel). Kassér støj fra billeder ved at markere feltet "Mørk baggrund" i Threshold vinduet. Billede signal kan inverteres for at lette tælling.
- Kvantificere molekylær lag thickness i den grønne kanal ved hjælp af "Split Kanaler 'og' Threshold Kort 'værktøj som i trin 7.1 og 7.2. Brug af størrelse markør på hvert billede som en guide, måle tilfældigt tre molekylære lag længder inden for hver af to udpeget 200 um strækninger af hver primær revne billede. Foretag målinger fra den proximale ende af Purkinje dendritiske arbor ved foden af Purkinje soma til den distale ende af Purkinje dendritiske arbor.
- Record purkinjecelle tæller og molekylær lagtykkelse som middel plus eller minus standardafvigelsen. Udfør en-vejs ANOVA med flere sammenligninger post-hoc analyse at teste virkningen af betingelser eller genotype behandling af antallet af celler og længden af den dendritiske arbor.
8. HPLC analyse af cerebellare ravsyre Koncentrationer Post-behandling
- Forberedelse af analyseprøven
- Afvej hver høstet højre cerebellar hemisfære førbrug i HPLC-analyse. Hakke halvkugleformet halvdele én ad gangen i en præ-kølet dounce homogenisator og tilsæt 0,5 ml 75:25 (efter volumen) vand: methanol-opløsning til hver homogeniseret halvdel 17.
- Ved hjælp af en smal forkølet homogenisator, groft bryde op væv med 5 dounce slagtilfælde. Fortsæt til fint hakke hver vævsprøve med en bredere homogenisator, anvender 20 Dounce slagtilfælde.
- Overfør homogenater at pre-kølet mikrocentrifugerør. Efter hver prøve skylles homogenisatoren med 0,5 ml iskoldt vand: methanol-opløsning og tilføje skylningen til mikrocentrifugerør.
- Centrifugér homogenatet prøver ved 1.300 xg i 30 minutter ved 25 ° C, og den ovenstående væske opsamles i et rent mikrocentrifugerør.
- Filtrer flydelaget gennem en centrifugal filterenhed huse med en regenereret cellulose filter på 10 kilodalton (kDa) nominel molekylvægt grænse. Ved ikke straks kører HPLC-analyse, gemme filtrerede prøver ved -80 °C.
- HPLC Instrumentering og betingelser
- Vedhæfte en ion kromatografi søjle med en længde på mindst 30 cm og en partikelstørrelse på 7 um til en væskekromatograf med høj ydeevne.
- Forberede og afgasses en tilstrækkelig mængde på 1 mM acetatpuffer justeret til en pH på 5.
- Indstil HPLC med en mobil fase hastighed på 0,8 ml / min. Hvis du bruger en UV-vis detektor, vælge en detektor bølgelængde på 224 nm. Typiske elueringstider for ravsyre under disse betingelser er mellem 10 og 12 min.
- Løb og analysere Standarder og prøver
- Forbered et sæt standarder i acetatbuffer mobil fase med rav- syre koncentrationer på mellem 0 og 250 ppm.
- Kør hver standard og forberede en kalibreringskurve ved hjælp af topareal målt fra hver kørsel.
- Når en nøjagtig standardkurve fås, køre tidligere fremstillede prøver fortyndet i acetatpuffer.For større nøjagtighed af målingen, kan prøver tilsat kendte koncentrationer af ravsyre, der er blevet fortyndet i den mobile fase. Kør alle prøver i tre eksemplarer.
- Analyser HPLC-kromatogrammer for at bestemme den ravsyre koncentrationen af prøverne ved hjælp af kalibreringskurven og derefter gange med prøvevolumen og dividere med oprindelige prøve masse.
9. Ex vivo-analyse af cerebellare mitokondrie Funktionalitet Brug af en oxygenelektrode Control Unit
- Opret en Clark-typen elektrode anvendelse af et kommercielt tilgængeligt system ved først at påføre en dråbe af kaliumchlorid (50% KCl w / v) opløsning på platin katoden, skære en 1,5 cm2 stykke af kommerciel tobak rullende papir og forsigtigt placere papiret platin katoden.
- Dæk katoden og omkringliggende anode med en 2,5 cm 2 stykke af polytetrafluorethylen (PTFE) papir og snuggly sikre både membRanes med O-ringe, hvilket gør at der ikke er folder eller bobler inden membranerne. Dryp 50% KCI-opløsning ind i den omgivende brønd.
- Fastgør premade elektrode ind i analysen kammer og fyldes med luft-mættet vand. Opvarm kammeret til 30 ° C, tilsættes en 0,8 cm omrører til opløsningen, og der omrøres ved 70 opm under anvendelse af instrumentet software. Kalibrer kammeret ved at etablere nul ilt. For at gøre dette, serielt tilføje nogle få krystaller af reduktionsmidlet natriumdithionit til opløsningen.
- Når kalibreringen er opnået, vaskes kammeret gang med 70% ethanol, og derefter vaske seks gange med deioniseret vand før de tillader kammeret at akklimatisere i 1,5 ml respiration buffer (5 mM MgCI2, 60 mM KCI, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCI [pH 7,4]) 7.
BEMÆRK: alle spor af natriumdithionit skal fjernes helt under vasketrinene før du forsøger at måleiltkoncentrationer i løbet af respiration forsøg.
- Når kalibreringen er opnået, vaskes kammeret gang med 70% ethanol, og derefter vaske seks gange med deioniseret vand før de tillader kammeret at akklimatisere i 1,5 ml respiration buffer (5 mM MgCI2, 60 mM KCI, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCI [pH 7,4]) 7.
- Forsigtigt homogeniseres de vejede cerebellare halvkugler i 0,5 ml homogenat puffer (0,25 M saccharose, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI [pH 7,4]). Overfør homogenat til en ren 1,5 ml mikrocentrifugerør og holde kølet indtil analysen påbegyndes.
- Føj homogenatet til kammeret, når et endeligt volumen på 2 ml. Permeabilisere cerebellar homogenat ved at tilsætte 40 pi digitonin eller saponin (5 mg / ml); tillade homogeniseret væv at inkubere i 10 min.
BEMÆRK: Digitonin og saponin er giftige, og inkubationstider bør holdes på et minimum. - At starte optagelsen iltforbrug, fastlægge mitokondrisk funktion gennem aktivering og inhibering af den oxidative phosphorylering kæde under anvendelse substrater og inhibitorer, henholdsvis (3 min optagelser pr substrat).
- Tilføj substrater ved hjælp af rene sprøjter som følger: 10 uL 2 M glutamat [endelig koncentration (fc) 0,01 M],5 pi 0,8 M malat [fc 2 mM], 20 pi 0,5 M adenosindiphosphat (ADP) [fc 5 mM], 1 pi 1 mM rotenon [fc 0,5 pM] 20 pi 1M ravsyre [10 mM], 1 pi 5 mM antimycin [fc 2,5 uM], 1 pi 0,8 M ascorbat [fc 0,4 mM], og 5 pi 0,2 M tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] Når du tilføjer substrater til kammeret passe på ikke at indføre luftbobler i systemet.
BEMÆRK: Detaljerede oplysninger om den funktionelle effekt induceret af hvert substrat og inhibitor er beskrevet i en tidligere offentliggjort protokol 7. Individuelle dosisresponskurver muligvis genereres for at bestemme optimale koncentrationer af substrater og inhibitorer i præparater / væv / arter, der ikke tidligere er undersøgt. Ligeledes kan protokollen optimeres for medfødte metaboliske tendenser vævet / arter blive undersøgt, såsom substrat præferencer.
- Tilføj substrater ved hjælp af rene sprøjter som følger: 10 uL 2 M glutamat [endelig koncentration (fc) 0,01 M],5 pi 0,8 M malat [fc 2 mM], 20 pi 0,5 M adenosindiphosphat (ADP) [fc 5 mM], 1 pi 1 mM rotenon [fc 0,5 pM] 20 pi 1M ravsyre [10 mM], 1 pi 5 mM antimycin [fc 2,5 uM], 1 pi 0,8 M ascorbat [fc 0,4 mM], og 5 pi 0,2 M tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] Når du tilføjer substrater til kammeret passe på ikke at indføre luftbobler i systemet.
- Når dataindsamlingen er afsluttet, forsigtigt enspirate de cerebellare homogenater og rengør kammeret med ethanol og demineraliseret vand. Når ren, yderligere cerebellare homogenatet kan køres uden yderligere kalibrering, så længe den PTFE-membran forbliver intakt. Efter færdiggørelsen, ren elektrode med deioniseret vand og ethanol og opbevares med silicagel eller tørremiddel.
BEMÆRK: Mellem samme dag kører, fylde kammeret med deioniseret vand sikrer, at membranen ikke tørrer ud. - Brug af databladet skabt af instrumentets software, eksport 40 min af åndedræt data indledes to minutter efter substrat tillæg til et regnearksprogram.
- Beregn hastigheden af åndedræt pr substrat eller inhibitor. Normalisere data ved at dividere den samlede respiration ved respirationsraten under ascorbat-TMPD substrat tilføjelse.
BEMÆRK: Respirationshastigheden kan yderligere normaliseres til indholdet af vævsprotein hvilket kan være særligt ønskeligt i neurodegeneration eksperimenterhvor indholdet væv kan variere. For at gøre dette, forbeholder 50 pi af prøven homogenatet (fra trin 9.3) til anvendelse i en standard proteinanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gennem farmakologisk målretning af cerebellare mitokondrier med ravsyre er vi i stand til at forhindre mitokondriel dysfunktion i en musemodel af cerebellum neurodegenerative sygdom SCA1. Den kanoniske elektrondonor af succinatdehydrogenase, ravsyre, blev opløst i bur drikkevand SCA1 mus i en måned, med adfærdsmæssige vurdering begyndelsen under den anden uge af behandlingen og neuropatologisk vurdering efter behandling (figur 1A). Ravsyre behandling 22 forbedrer ydeevnen af SCA1 mus som målt ved fodaftryk assay stråle assay og accelererende roterende stav assay. De adfærdsmæssige forbedringer fundne indikerer forbedret motorik og motor læring (Figur 1B-D).
Redning af adfærdsmæssig præstation blev fundet i koncert med en bevarelse af cerebellar væv (figur 2). Ravsyre behandling væsentligt bevaret purkinjecelle organer og øget molekylær lagtykkelse (vejledende af purkinjecelle dendritiske lysthus udvidelse) i cerebellare primære revne i behandlede SCA1 mus sammenlignet med ubehandlede SCA1 mus. Purkinjecelle dendritiske længde og purkinjecelle krop tæller giver stærke foranstaltninger af generel cerebellar cytoarchitecture 5.
HPLC blev udført på den cerebellare væv fra behandlede mus at kontrollere, at ravsyre opløses i buret drikkevandet passerede blodhjernebarrieren og trængt cerebellar væv. En dosisresponskurve variere længden af behandlingen yderligere understøtter ad libitum behandling af ravsyre som en levedygtig måde at nå cerebellar væv (figur 3A-B). Vores åndedræt eksperimenter er i gang, og vores resultater vil blive offentliggjort i en forskningmanuskript. Her viser vi, at vi med succes kan registrere hastigheden af respiration gennem cerebellare oxidative fosforylering komplekser ved tilsætning af varierende elektrontransportkæden substrater og inhibitorer (figur 3C). I sidste ende, vil vi bruge åndedræt analysen at vise oxidative fosforylering underskud i SCA1 mus lillehjernen og tilbageførsel af disse underskud ved ravsyre behandling.
Figur 1: Behandling Scheme og repræsentative data fra Footprint Assay, Bredde Assay og Hurtigere roterende stav. (A) Ravsyre blev opløst i bur drikkevand SCA1 mus i fire uger begyndende ved 17 ugers alderen. SCA1 mus begynder at vise ataksi fænotype ved 5 ugers alderen. Ikke afbildet i skematisk er tre kontrol kohorter: ravsyre syrebehandlede vildtypemus, vetøjets behandlede SCA1 mus og vehikelbehandlede vildtype mus. Adfærdsmæssige vurderinger blev udført i behandlingsperioden som følger: footprint assay i uge 17, beam assay i uge 18 og accelererende roterende stav i uge 19. Under 20 ugers alder blev mus aflivet, og cerebellar væv blev høstet til immunpatologi assays, HPLC assays og respiration assays. (B) Repræsentative data fra fodaftryk assayet viser et bærerbehandlede vildtype gangart (øverst), vehikel-behandlede SCA1 gangart (midten) og en ravsyre-behandlede SCA1 gangart (nederst). (C) Beam analysedata viser forbedring i stråle ydeevne (målt som antal forsøg for en vellykket køre) af SCA1 mus med ravsyre behandling. (* P <0,05). (D) Ravsyre behandling forbedrer accelererende roterende stav ydeevne SCA1 22 mus som vist ved forøget latens til at falde (* p <0,05). Fejl barer i CD respejler standardfejlen af middelværdien. Signifikans blev bestemt ved envejs ANOVA og multiple sammenligninger post-hoc analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentant data fra purkinjecelle Tæller og Molekylær lagtykkelse immunopatologi Analyser. (A) Repræsentative resultater fra Purkinje celletal assay viser et vehikelbehandlede kontrolgruppe transgene cerebellar primære revne (øverst), vehikel-behandlede SCA1 cerebellar primære revne (midten) og en ravsyre-behandlede SCA1 cerebellar primære revne (nederst) farvet for ATXN1-positive kerner (rød) og modfarvet med DAPI (blå). Hvide linjer skildrer de 200 um regioner vævudpeget til celletal. For denne særlige analyse, en kontrol transgen mus overudtrykker en ikke-patogen ATXN1 genet under kontrol af en purkinjecelle promotor blev anvendt i stedet for en vildtype mus, fordi de transgene styringsegenskaber let påviselige niveauer af nukleare Purkinje ATXN1 og vildtype mus gør ikke. Kontrollen transgene mus viser ikke en ataxiske fænotype eller cerebellar neurodegeneration. (B) Repræsentative resultater fra den molekylære lagtykkelse assay viser et bærerbehandlede vildtype cerebellar primære revne (øverst), vehikel-behandlede SCA1 cerebellar primære revne (midten) og en ravsyre-behandlede SCA1 cerebellar primære revne (nederst) farvet for calbindin , en markør for Purkinjeceller (hvid). To af de tre cerebellare cellelag kan visualiseres med calbindin. Det midterste purkinjecelle lag (bestående af purkinjecelle organer) er synlig sammen med det yderste molekylære lag (bestående af Purkinje cell dendritter). Den molekylære lag vises i midten af den primære revne på grund af de naturlige folder i vævet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater fra HPLC og Respiration Assays. (A) standardkurve for kendte koncentrationer op til 250 ppm ravsyre fortyndet i acetatpuffer og afbildet mod området under den målte HPLC top. Ligningen af linjen blev anvendt til beregning ukendte ravsyre syrekoncentrationer fra behandlede vævsprøver. (B) Repræsentative dosis-respons-ravsyrederivater toppe fra muse cerebellar væv efter forskellige tidspunkter af behandling (enten 0, 1 eller 5, uger). Under de betingelser,beskrevet, ravsyre typisk elueres mellem 10 og 12 minutter. (C) Repræsentant respiration løbe fra bærerbehandlede vildtype mus cerebellare væv. Den blå linje viser ændringen i oxygenkoncentrationen, den stiplede røde linje viser ændringen i respirationsfrekvensen og den faste røde linje viser en udglattet version af den stiplede linie. D = tilsætning af digitonin, G / M = tilsætning af glutamat / malat, A = tilsætning af ADP, R = tilsætning af rotenon, S = tilsætning af ravsyre, AA = tilsætning af antimycin A og A / T = tilsætning af Asc / TMPD. Alle substrater blev tilsat ved tiden afbildet i figuren og i de koncentrationer, der er beskrevet i protokollen (trin 9.5). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hvis der anvendes disse metoder som beskrevet, de er i stand til at detektere og afhjælpe oxidativ phosphorylering-medieret mitokondriel dysfunktion i cerebellare neurodegenerative sygdom musemodeller. De kombinerede biokemiske og adfærdsmæssige analyser er mangesidede metoder til bestemmelse af omfanget af mitokondrie bidrag til cerebellare neurodegenerativ sygdom patologi. Ved at behandle mus med ravsyre at stimulere stofskiftet og øge mitokondriefunktionen, er vi i stand til at vise en redning af cerebellare adfærdsmæssige underskud og cerebellar degeneration.
Den metode præsenteres her kan anvendes til at teste en lang række vandopløselige metabolisk målrettede forbindelser til potentiel behandling af cerebellar neurodegenerativ sygdom. Ravsyre er letopløseligt i vand ved 0,75 mg / ml, som muliggør en enkel levering via bur drikkevand og ikke kræve indførelse af suppleret foderpiller. Andre vandopløseligeforbindelser kan let substitueres i protokollen. Hvis der anvendes metabolisk målrettede forbindelser, som er ikke vandopløselige, kan vores metode kan let tilpasses til behandling med suppleret foderpiller 11, 12. Når et nyt stof, er det vigtigt at kontrollere cerebellar penetration af lægemidlet før behandling påbegyndes via HPLC-analyse eller en anden egnet påvisningsmetode.
Batteriet af patologiske vurderinger blev valgt på grund af deres rapporterede effektivitet ved påvisning cerebellare neurodegenerative patologier. De fodaftryk assay stråle assay og roterende stav assay udbredte vurderinger af cerebellare neurodegenerativ sygdom, herunder forskellige SCA'er, og Friedreichs ataksi 6, 23, 24. Disse særlige adfærdsmæssige vurderinger kraftigt korrelere med cerebellar degeneration. Men andre behavioral paradigmer kan være substitueret eller tilføjet efter behov.
Mærkningen af Purkinjeceller i SCA1 mus med ataxin-1 og calbindin er almindeligt anvendt til at detektere cerebellar degeneration i SCA1 modeller 5, 20, 21. Andre neuronal-selektive antistoffer og vævsområder kan anvendes til at visualisere afbødning af neurodegeneration efter behov.
Respiration analyse er et kraftfuldt værktøj til specifik påvisning af dysfunktion eller reparation inden for de enkelte mitokondrie komplekser fra cerebellare væv. Der bør drages omsorg for at minimere tiden mellem høst af væv og kører assayet for at opnå reproducerbare resultater. Det er også vigtigt at bemærke, homogeniteten af vævet, der analyseres. Specifikt cerebellar væv består overvejende af granulneuroner neuroner, som ikke udtrykker SCA1 transgen i vores model. Derfor er en kritisk trin af denneprotokollen er at bestemme, om hele cerebellar respiration er en levedygtig fremgangsmåde til påvisning af oxidativ kompleks funktion. Åndedræt ændringer i den transgene SCA1 musen lillehjernen kan være hårfin og kan kræve øget antallet af fag for at opnå statistisk signifikante resultater.
Kombinationen af adfærdsmæssige og neuropatologiske metoderne i denne protokol giver særskilte kvantificering af SCA1 sygdom og kan håndfast opdage forbedring efter behandling med vandopløselige forbindelser. Betydningen af denne protokol er i sin store tilpasningsevne til forskellige behandlinger og en bred vifte af musemodeller. Desuden har mange af de teknikker, der anvendes i denne protokol ikke kræver dyrt udstyr eller komplicerede teknikker og er derfor velegnet til en bachelor forskning indstilling. Fremtidige anvendelser af denne protokol vil blive anvendt til at vurdere graden af behandlingseffekt ved aldersbetinget levering af forbindelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
