Abstract
ミトコンドリア機能障害は老化のプロセスで、いくつかの遺伝性脊髄小脳失調症と小脳の進行性変性によってマークされ、他の運動障害などの神経変性疾患において重要な役割を果たしています。このプロトコルの目的は、脊髄小脳失調症1型(SCA1)におけるミトコンドリア機能障害を評価し、疾患の進行を遅らせるために、水溶性の化合物のコハク酸を介して代謝呼吸の薬理学的標的化の有効性を評価することです。このアプローチは、他の小脳疾患に適用可能であり、水溶性の治療のホストに適合させることができます。
ミトコンドリア呼吸のex vivo分析は、ミトコンドリア機能の疾患に関連する変化を検出し、定量化するために使用されます。遺伝的証拠(未発表データ)とSCA1マウスモデルにおけるミトコンドリア機能障害のプロテオミクス証拠により、我々は、水溶性代謝ブースターSを用いた治療の有効性を評価しますホームケージの飲料水に直接この化合物を溶解することによりuccinic酸。血液脳関門を通過する薬剤の能力は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて推定することができます。これらの化合物の有効性は、その後、加速ロータロッド、バランスビームテスト及びフットプリント分析を含む、複数の行動パラダイムを用いて試験することができます。小脳の細胞構築完全性は、プルキンエ細胞核とプルキンエ細胞の樹状突起と細胞体を検出する免疫アッセイを用いて評価することができます。これらの方法は、ミトコンドリア機能障害および小脳の神経変性疾患における水溶性化合物を用いた治療の有効性を決定するための強固な技術です。
Introduction
ミトコンドリア電子輸送鎖を使用して、酸化的リン酸化(OXPHOS)を経て製造ミトコンドリアのATPの大部分で、アデノシン三リン酸(ATP)、細胞エネルギーのために必須の補酵素の主要な生産者です。脳は、その高い代謝要求と神経活動に電力を供給するための酸化的リン酸化への依存を与え、ミトコンドリア機能障害の影響を非常に受けやすいです。その結果、ミトコンドリア機能障害は、老化プロセス中にトリガされます 1及び複数の神経変性疾患2、3、4の病因に関与しています。したがって、ミトコンドリアは、神経変性のための魅力的な治療標的であることになります。
このプロトコルでは、我々はミトコンドリアの研究のためのモデルの神経変性疾患などの脊髄小脳失調症1型(SCA1)の使用を採用していますリットル機能障害およびミトコンドリア標的療法の開発。 SCA1は、他の脳領域のプルキンエ小脳のニューロンとニューロンの進行性変性をトリガアタキシン1遺伝子産物におけるポリグルタミン(ポリQ)リピート伸長変異によって引き起こされます。プルキンエ細胞特異的プロモーターの制御下でポリQ突然変異体アタキシン1導入遺伝子を発現する(SCA1マウスと命名)は、ここで使用されるトランスジェニックマウス系統は、SCA1 5のプルキンエ細胞成分の標的分析を可能にします。 SCA1マウスは緩やかなプルキンエ細胞の変性を受け、失調性歩行6を開発します。
ミトコンドリア複合体の機能不全とミトコンドリア標的治療の有効性は、分子や行動アッセイの電池を用いて評価することができます。ミトコンドリア複合体機能障害は小脳組織内の変更された酸素消費量を検出する呼吸アッセイによりex vivoで測定され、電子伝達鎖基質および阻害剤7が存在します。呼吸アッセイは、以前に透過性の組織、ミトコンドリアの単離物、および全組織7、8、9で使用されてきました。これらは、透過型電子顕微鏡または免疫蛍光染色などの形態学的データの収集方法とは異なり、ミトコンドリア機能を直接評価することを可能にします。組織全体ではなく、単離ミトコンドリアの使用は、単離工程7の間に発生する可能性があり、健康なミトコンドリアのバイアスされた選択を防ぐことができます。示されるように、プロトコルに適合したときに、呼吸アッセイは、小脳の神経変性疾患状態においてミトコンドリア機能障害を検出するための有益な方法です。
代謝の非特異的活性化は、神経変性diseasのトランスジェニックマウスモデルにおいてミトコンドリア機能障害を推定するために使用することができeと新しい治療法の開発に役立ちます。ケルセチン、コエンザイムQ10およびクレアチンは、全ての患者において神経変性病10、11、12、13、14、15、16の動物モデルにおいて神経変性疾患の病状を改善することが示されています。ここでは、代謝を促進し、神経変性疾患でミトコンドリアの機能を高めるための新規な代謝賦活剤、コハク酸を、提示します。活性化剤は、血液脳関門を通過していることを確実にするために、HPLCを処置したマウス17の神経組織への送達を検出するために使用しました。
コハク酸のような代謝的に標的と水溶性化合物の治療効果を評価するために、行動パラダイム及び免疫病理学的研究の電池を使用することができます。デュ小脳の神経変性疾患、フットプリントの滑走路アッセイ、ビームアッセイ加速回転棒アッセイに見られる運動協調の障害に電子が行動病理6、18、19の救助を検出するために使用されます。これらの措置は、小脳組織6、20、21の定義された小葉内の分子(プルキンエ細胞の樹状突起樹の長さとして定義された)層の厚さとプルキンエ細胞体数を評価することによって小脳細胞構築の免疫病理学的評価を補っています。ここでは、代謝的に標的と水溶性化合物を用いたミトコンドリア機能障害の検出および治療のための複数の神経病理学的および行動の方法を提示します。
私たちは、SCA1のTRANにミトコンドリア機能障害を分析するために、ミトコンドリア呼吸のex vivo分析を使用しますsgenicマウス。さらに、我々は、疾患の症状および病状がさらにSCA1疾患の進行におけるミトコンドリア機能障害が関与し、水溶性のミトコンドリアブースタコハク酸によって改善されることを示しています。
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Protocol
このプロトコルは、マウスを操作するためのスキッドモア・カレッジでIACUCのガイドラインに従っています。
水溶性化合物1.トリートメント
- ケージの飲料水における0.75ミリグラム/ mLの濃度にコハク酸を溶解させます。所望の濃度の関心対象の任意の水溶性化合物は、この段階で置き換えることができることに留意されたいです。化合物が完全に溶解されていることを確認するために溶液を撹拌します。
- マウスは、所望の治療年齢に達すると、ステップ1.1の溶液で処理する条件群のホームケージの飲料水を交換してください。
- 両方の処置および対照マウスは、同量の水を飲んでいることを確実にするために毎日の治療とコントロールの両方のグループの水のボトルの重量を測定します。ケージ当たり総薬物投与量を計算するために、これらの測定値を使用します。実験を通して治療を継続し、ボトルの重量を監視します。
2.フットプリント分析
- 床の上に滑走路を置きますか閉じ込められた部屋のテーブル。寝具や報酬の食品( 例えば甘い穀物)が並んでホームボックスに向かってわずかに上向きの角度で滑走路を設定します。白い紙に滑走路の長さに並びます。被験者は5分間のホームボックスに順応することを可能にします。
- 青と赤の非毒性水性塗料で、それぞれ、ホームボックスから対象を外し、左右の後足を描きます。塗料プリントは複数の出力行動の測定値を計算するために使用されます。
- 滑走路の先頭に被写体を置き、被写体がホームボックスに歩くことができます。対象がホームボックスに達すると、トラップドアを閉じて、被験者はそれぞれのホームケージに戻す前に1分間のホームボックス内にとどまることができます。 30%エタノールで滑走路や自宅のボックスをきれいにし、次の主題のための寝具、報酬食品、および滑走路の紙を交換してください。
- ストライド数、ゲートの幅は、ステップ角、及び取ら巻き数を定量化します被験者による以前6記載の分析方法に従って。成功したフットプリント試験は、被験者が振り向くまたは停止することなく、目標ボックスに向かって歩いてされている5シーケンシャル足跡の最小値として定義されます。
3.ビーム解析
- 以下の6ビームで以前6記載のバークロス仕様に従ってビーム装置を設定します。ビーム1 =長方形の、28ミリメートル幅;ビーム2 =ラウンド、28ミリメートルの直径。ビーム3 =長方形の、12ミリメートル幅;ビーム4 =ラウンド、12ミリメートルの直径。ビーム5 =長方形の、6ミリメートル幅;ビーム6 =ラウンド、直径6mm。ビームの一端には、報酬食品と暗くホームボックスを設定します。
- ビーム上の被験者を訓練するために、ビーム3と装置を組み立てる静かホームボックスにビーム反対側の端に被写体を置き、被写体が歩いて渡ることができます。正常に実行を達成するために、3つの2分の試験に各被験者を許可します、ビームを横断し、2分以内に自宅のボックスに入るように定義。試験の間では、2分間のホームボックス内の被写体の残りをしましょう。被験者の間では、30%エタノールでビームとホームボックスをきれいにし、次の件名の準備のために報酬食べ物を交換してください。
- 3シーケンシャル訓練日間の合計でその結果、次の2日間、一日一回繰り返し手順3.2。試験日、4日目は、順次訓練日に従う必要があります。
- 4日目に被験者をテストするには、第一のビーム1と装置を組み立て、ステップ3.1で説明したように、ホームボックスを設定します。装置の前にビデオカメラを置き、全ビーム装置は明らかにビデオで捕獲することができることを確認します。正常に裁判を完了するために3 2分の試行まで可能、録画を開始し、自宅のボックスにビームとは反対側の第一の主題を置きます。試験の間では、ホームボックス内の2分間の休憩を受けることができます。
- 番号順に6ビームのそれぞれに被験者に進み、被験者は、次のビームを開始する前に、ホーム・ボックスに2分間休ませることができます。対象者との間で、30%エタノールで各ビームとホーム・ボックスをきれいにし、各被験者の準備のために報酬食べ物を交換してください。
- ビデオテープの各試験とは、次のようにビームあたりの主題ごとに成功した試行数を記録: '1'を主題は、最初の試験に成功したことを示し、「2」の対象は、二審に成功したことを示しは「3」、被写体があったことを示し第三と最後の裁判で成功し、「4」は、被験者が3回の試験のいずれにも成功しなかったことを示します。
- 被験者の実験条件に盲目にされているスコアラーによって試験対策footslipsのビデオ録画を使用してください。梁の長さにわたって理論的正中線下のカメラディッピングの直視である後足部としてfootslipを定義します。複数の得点の平均footslip得点。
- 秒数を分析するために、uccessful試験およびfootslipsデータの数は、各遺伝子型と実験条件コホート内の平均と標準誤差を計算します。成功した試験やfootslipsの数の数に治療と遺伝子型の効果があるかどうかを判断するために、一方向ANOVAおよび多重比較事後分析を行います。
4.ロータロッドを加速
- 試験の開始に先立って、アッセイの部屋10分に被験者を順応させます。この順応期間の間、30%エタノールを用いて装置の各レーンを洗浄、ロータロッド装置を準備します。
- ロータロッドソフトウェアを開き、40 rpmでの5分と最終速度の設定に4回転、加速設定に設定を開始に設定します。 5分間にわたって40 rpmで - これらの設定は、4から一定の加速度を提供します。マウスは、10分の最大ラン長の加速期間を超えてさらに5分間40rpmでロータロッド上に残ることができます。
- ポスト順化、場所科目OそれぞれのレーンでのロータロッドNTOロッドは4 rpmで回転している間。すべての被験者がそれぞれのレーンに入ると、最初のトライアルを開始します。機器のソフトウェアを使用して落下する待ち時間を記録。第二タイマーは、バックアップとして使用することができます。
- トライアル終了後、疲労を防ぐために次の試行の前に10分間、それぞれのレーン貯水池内の残りの各被験者を可能にします。
- 繰り返して、4試行の合計4.3と4.4を繰り返します。
- 試用期間を通じて治療を続け、4日連続の合計で4.5 - を繰り返して、4.3を繰り返します。完了すると、被検体6ごとに各試験のための回転棒から落下する待ち時間を定量化します。
5.小脳抽出と固定
- 制度的IACUCガイドラインに従って二酸化炭素窒息を介してマウスを安楽死させます。二酸化炭素チャンバ内に被写体を配置し、チャンバ内に二酸化炭素を放出します。時計無人動物を安楽死させ工程の間にすべての回で動物と放置しないでください。
- 呼吸が停止したと被験者がチャンバーから対象を削除し、尾側上皮組織を通じて頭蓋底に頭蓋骨の途中から上皮組織を通じて優れた正中切開を行い、後足の圧力により残存疼痛知覚を示さない。いったん
- 解剖ハサミを使用して、ブレグマの矢状縫合を介して脊髄で基地から頭蓋骨をカット。鈍ピンセットを用いて前頭葉、頭頂と壁間の骨を引っ張って前に、各冠状縫合を通って横方向にカットします。
- 小脳への横方向の骨を断つために鈍い鉗子を使用してください。丘や脳幹から小脳を分離し、組織の残りの部分から、それを押し出すために鉗子を使用してください。鉗子で左右の半球に小脳を区切ります。
- すぐに HPLC ANAのために保存するには、液体窒素中に右小脳を配置組織固定のための予め冷却4%パラホルムアルデヒド(PFA)中に溶解し、左小脳。大動脈を切断し、制度的IACUC規則に従って死体を廃棄する前に目的の任意の他の組織を採取します。
注意:PFAは非常に、毒性、可燃性、腐食性です。 - 24時間後に抽出まで4℃で30%スクロース中に組織を配置する前に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(3回、5分間/洗浄)にPFA(PBS中4%)で固定した組織を洗浄2週間。
6.免疫病理アッセイ
- シンクの蛇口や温度制御ボックスにスレッジミクロトームのチューブを取り付けます。 -25℃にミクロトームステージを冷却するための温度制御ボックスを使用します。 50μmの切片厚ダイヤルを設定します。
注:スレッジミクロトームのダイヤルが50μmに達しない場合は、より薄く設定にダイヤルを設定し、それに応じて設定をシフトすることによって厚さを掛ける(例えばDセット10μmのIALおよび50μm)との合計の厚さのために、切片の前に5回をシフトします。 - ステージに最適な温度カッティング(OTC)の溶液のダイムサイズの部分を軽くたたきます。 OTCがフリーズする前に、正中矢状切断面は、OTC層の上に下向きになるように半球を配置するために鉗子を使用しています。半球の左右先端がステージに優れたブレードに向かって指摘されるように、迅速に作業を、静かにピンセットで組織を方向付けます。 OTCが完全にフリーズすることができます。
- 層での作業、OTCは、次の層を追加する前に、完全に凍結することを可能にする組織の周りに追加のOTCを追加します。組織と凍結の上にOTCの薄い層を追加します。
- セクション組織切片ながら切削刃上に均等に体重を分配します。 1×PBSを含む適切に標識されたウェルプレートにファインアーティストの絵筆と場所を使用してセクションを収集します。セクション間に、上の切断厚さを再設定します50μmでスレッジミクロトームダイヤル、必要に応じて、。
- 尿素溶液[PBS中0.01 M尿素〕とウェルプレートの各ウェルにPBSを交換し、氷上にプレートを置きます。準備ができたら、15秒間尿素溶液中で免疫標識のためのエピトープをアンマスクするたびに3回氷と沸騰セクションからプレートを取り外します。このステップでは、容易に沸騰温度に設定した加熱ブロックにプレートを配置することによって達成することができます。各煮沸工程との間に、氷上で組織切片を含むプレートを冷却します。
注:96ウェルプレート中の尿素、ブロッキング、一次抗体、二次抗体およびDAPIの手順を実行する場合は、全体で100μLのボリュームを使用します。異なるサイズのウェルが使用されている場合は、それに応じて試薬のボリュームを調整します。加熱ブロックの代わりに、マイクロ波は、尿素の組織サンプルを沸騰させるために使用することができます。 3 15秒間隔のための高電力設定上のマイクロ波サンプル。 - ポスト沸騰、ソリューションを交換し、セクションを3回と、本液を除去するたびに洗います1×PBSで10分間攪拌。
- 室温で穏やかに撹拌しながら1時間血清中で組織をインキュベートすることにより、ロバ血清溶液(3%正常ロバ血清、PBS中0.3%トリトンX-100)を用いたブロックのセクション。ロバ血清溶液を除去。
- 0.2μgの/ mLの抗カルビンジンおよび1とラベルのセクション:2000抗アタキシン-1抗体(11NQ)16ロバ血清溶液中で、穏やかに撹拌しながら72時間4℃でインキュベートします。
- (:500アレクサフルオロ-488抗ヤギと1:ロバ血清溶液で希釈した500アレクサフルオロ-594抗ウサギ抗体1)4℃で、適切な二次抗体のセクションをインキュベートする前に、ステップ6.5のようにPBSでセクションを洗ってください穏やかに撹拌しながら48時間。
- DAPIで標識細胞核の前にステップ6.5(4 '、6-ジアミジノ-2- phenylindol)PBS中の0.5μg/ mLの最終濃度に希釈した溶液のようにセクションをPBSで3回洗浄します。 DAPIのインキュベーションは、10分を超えてはなりません。 solutioを削除しますnおよびステップ6.5のようにPBSで洗浄しました。
- 光退色を低減するための媒体を装着すると2%ゼラチンコートしたスライド上にマウント組織。マニキュアでカバーガラスとシール。
- 走査型共焦点顕微鏡で明視野光の下で小脳の主要な亀裂を見つけます。 10X UIS2対物レンズと、スキャン順次DM488 / 559 nmのと一緒にDAPI、のAlexaFluor-488をそれぞれ405nmのダイオードレーザー、488nmのアルゴンレーザーと559 nmのダイオードレーザーを使用してのAlexaFluor-594チャネルを励起ダイクロイックビームスプリッタ。独立したそれぞれ、放出されたSDM490とSDM560ビームスプリッタを用いた光とBA575-675バンドパスフィルタを集めます。
- チャネルごとに、Z = 20μmのステップ= 0.1μmの一次亀裂内のzスタックを構築します。最終的な画像にサイズマーカーに追加する共焦点顕微鏡を備えた後処理ソフトウェアを使用してください。
注:代替レーザー、フィルターおよびフルオロフォアがavailabiliに基づいて置換することができますTY。 AlexaFluor-488またはのAlexaFluor-594の検出が弱い場合には、ガリウムリン(GaAsP系)高感度の検出器が利用可能な場合、信号をブーストするために使用することができます。
- チャネルごとに、Z = 20μmのステップ= 0.1μmの一次亀裂内のzスタックを構築します。最終的な画像にサイズマーカーに追加する共焦点顕微鏡を備えた後処理ソフトウェアを使用してください。
7.定量化分子層の厚さとプルキンエ細胞数
- [画像]タブからImageJの、染色された一次亀裂のzスタック画像を開き、メニューバーから「イメージ」を選択することによって、その、赤、青、緑のチャンネルにそれぞれの画像を分割し、「カラー」を使用し、カラーから「分割チャネル」タブ。
- 分割された各チャネルの最大Z投影を作成します。関心のあるチャネルの画像が開いているときは、メニューバーから「イメージ」を選択し、「セクション」タブから[画像]タブと「Z-プロジェクト」から「セクション」。 「Z-プロジェクト」コマンドメニューの中で、「マックスZ投影」を選択し、「オーケー」をクリックします。チャンネルごとに繰り返します。
- 目から「プラグイン」を選択することにより、セルカウンターのプラグインを開きます。Eメニューバーには、プラグイン]タブと[分析]タブから「セルカウンター」から「分析します」。
注:ImageJのとImageJのセルカウンターのプラグインは、材料および装置の表で提供ウェブサイトでダウンロードすることができます。 - 一次亀裂の前方および後方の長さの予め決定さ200μmのストレッチに沿うアタキシン1標識核をカウントすることにより、プルキンエ細胞の数を定量化します。アタキシン1標識核の場合に関心のあるチャネル(赤のしきい値マップを作るために調整タブから[画像]タブおよび「しきい値」から「調整」、メニューバーから「イメージ」を選択することにより、しきい値マップを使用します)。
- 定量化(例えば、31から225ピクセル)全体で標準化することができる画素範囲を選択します。しきい値ウィンドウで「暗い背景」のボックスをチェックすることにより、画像からノイズを捨てます。画像信号は、カウントを容易にするために反転させることができます。
- 分子層を定量化THICステップ7.1および7.2のように「分割チャネル」と「しきい値マップ」ツールを使用して、グリーンチャンネルでネス。ガイドとして各画像にサイズマーカーを使用して、ランダムに各一次亀裂画像の2指定さ200μmのストレッチの各内の3つの分子層の長さを測定します。プルキンエ樹状アーバーの先端にプルキンエ細胞体のベースのプルキンエ樹状アーバーの近位端から測定を行います。
- レコードのプルキンエ細胞数や手段などの分子層の厚さをプラスまたはマイナス標準誤差。多重比較を用いて細胞の数と樹状突起樹の長さに処理条件や遺伝子型の効果をテストするための事後分析を一元配置分散分析を実行します。
小脳コハク酸濃度後処理の8 HPLC分析
- 分析のための試料の調製
- 前へ各収穫右小脳半球の重量を量りますHPLC分析に使用します。ミンチ半球半分あらかじめ冷却ダウンスホモジナイザーで一枚ずつと(体積)75:25の0.5 mLを加え、水:各均質化された半分の17のメタノール溶液。
- 狭い予備冷却ホモジナイザーを使用して、肉眼的に5ダウンスストロークで組織を壊します。 20ダウンスストロークを適用し、より広いホモジナイザーで各組織試料をミンチ細かくに進みます。
- 予め冷却マイクロチューブにホモジネートを転送します。各サンプルの後、氷のように冷たい水0.5 mLでホモジナイザーをすすぎ:メタノール溶液とマイクロ遠心チューブにリンスを追加します。
- 25℃で30分間、1300×gで遠心分離ホモジネート試料ときれいなマイクロチューブに上清を収集します。
- 10キロダルトン(kDaの)公称分子量限界の再生セルロースフィルタに収容された遠心式フィルターユニットを通して上清をフィルタリングします。すぐにHPLC分析を実行していない場合は、ストアは-80°でサンプルをフィルタリングC.
- HPLC計測および条件
- 少なくとも30cmの長さ及び高速液体クロマトグラフに7ミクロンの粒子サイズを有するイオン排除クロマトグラフィーカラムを取り付けます。
- 準備し5のpHに調整し、1mMの酢酸緩衝液の十分な量を脱気。
- 0.8mL /分の移動相速度でHPLCを設定します。 UV-VIS検出器を使用する場合は、224 nmでの検出器の波長を選択します。これらの条件下でのコハク酸のための典型的な溶出時間は10〜12分の間です。
- 標準とサンプルの実行と分析
- 0と250 ppmの間のコハク酸濃度の酢酸緩衝液を移動相に標準のセットを準備します。
- 各標準を実行し、各実験から測定したピーク面積を用いて検量線を作成。
- 正確な標準曲線が得られると、酢酸塩緩衝液で希釈し、以前に調製されたサンプルを実行します。測定のより高い精度のために、試料を移動相で希釈されているコハク酸の既知濃度でスパイクすることができます。三連ですべてのサンプルを実行します。
- 検量線を用いて、元のサンプルの質量の試料体積と分割を掛けることによりサンプルのコハク酸の濃度を決定するためのHPLCクロマトグラムを分析します。
酸素電極制御ユニットを使用した小脳ミトコンドリア機能の9 ex vivoでの解析
- コマーシャルタバコ圧延ペーパー1.5 cm 2の部分を切断し、穏やかにオーバー紙を配置し、第1の白金陰極の溶液(w / vで50%のKCl)塩化カリウムの低下を適用することにより、市販のシステムを使用して、クラーク型電極を作成します白金陰極。
- ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)紙2.5cmの2ピースと陰極と周囲の陽極を覆い、ぴったりの両方MEMBを確保膜内には折り目や気泡がないことを確認すること、Oリングとranes、。よく周囲に50%KCl溶液を滴下します。
- 分析室に既成の電極を固定し、空気飽和水で満たします。 30℃にチャンバを熱し、ソリューション0.8センチ攪拌棒を追加し、機器のソフトウェアを使用して70rpmで撹拌します。ゼロ酸素を確立することにより、チャンバを調整します。これを行うには、シリアル溶液に、還元剤の亜ジチオン酸ナトリウムの少量の結晶を追加します。
- 較正が達成されると、5mMのMgCl 2、60mMの塩化カリウム、100mMのマンニトール、10mMの(チャンバが呼吸緩衝液1.5 mL中に順応することを可能にする前に、脱イオン水で6回洗浄後、70%エタノールで一回チャンバを洗浄、及びKH 2 PO 4、0.5ミリモルのNa 2 EDTA、60mMのトリス-HCl [pH7.4の])7。
注:亜ジチオン酸ナトリウムのすべての痕跡を完全に測定しようとする前に、洗浄工程の間に除去されなければなりません呼吸実験中の酸素濃度。
- 較正が達成されると、5mMのMgCl 2、60mMの塩化カリウム、100mMのマンニトール、10mMの(チャンバが呼吸緩衝液1.5 mL中に順応することを可能にする前に、脱イオン水で6回洗浄後、70%エタノールで一回チャンバを洗浄、及びKH 2 PO 4、0.5ミリモルのNa 2 EDTA、60mMのトリス-HCl [pH7.4の])7。
- 穏やかホモジネート緩衝液0.5 mL中に秤量した小脳半球を均質化(0.25 Mスクロース、0.5mMのEDTA、50mMのトリス-HCl [pH7.4の])。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにホモジネートを移し、アッセイ開始まで冷やしておきます。
- 2 mLの最終容量に達し、チャンバーにホモジネートを追加します。ジギトニンまたはサポニン(5ミリグラム/ mL)を40μLを追加することにより、小脳ホモジネートを透過性。ホモジナイズした組織を10分間インキュベートすることを可能にします。
注:ジギトニンとサポニンは有毒であり、およびインキュベーション時間は最小限に抑える必要があります。 - 酸素消費量の記録を開始するには、それぞれの基質および阻害剤、(基板1枚あたり3分の録音)を使用して、酸化的リン酸化の連鎖の活性化および阻害を介してミトコンドリアの機能を決定します。
- 次のようにきれいな注射器を使用して基板を追加します:10μLの2 Mグルタミン酸[最終濃度(FC)0.01 M]、5μLの0.8 Mリンゴ酸[FC 2 mm]で、20μLの0.5 Mアデノシン二リン酸(ADP)[FC 5 mm]で、1μL1 mMのロテノン[FC 0.5μM]、20μLの1Mコハク酸[10 mm]で、1μL5 mMのアンチマイシンA [FC 2.5μM]、1μLの0.8 Mアスコルビン酸[FC 0.4 mMの]、および5μLの0.2 Mテトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)。 【FC 0.5 mm]のチャンバーに基板を追加する場合、システムに気泡を導入しないように注意してください。
注:各基質と阻害剤によって誘導される機能的効果の詳細は以前に公開されたプロトコル7に記載されています。個々の用量反応曲線は、以前に研究されなかっ準備/組織/種における基質及び阻害剤の最適な濃度を決定するために生成する必要があるかもしれません。同様に、このプロトコルは、基板の好みとして検討されている組織/種の先天性代謝傾向のために最適化することができます。
- 次のようにきれいな注射器を使用して基板を追加します:10μLの2 Mグルタミン酸[最終濃度(FC)0.01 M]、5μLの0.8 Mリンゴ酸[FC 2 mm]で、20μLの0.5 Mアデノシン二リン酸(ADP)[FC 5 mm]で、1μL1 mMのロテノン[FC 0.5μM]、20μLの1Mコハク酸[10 mm]で、1μL5 mMのアンチマイシンA [FC 2.5μM]、1μLの0.8 Mアスコルビン酸[FC 0.4 mMの]、および5μLの0.2 Mテトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)。 【FC 0.5 mm]のチャンバーに基板を追加する場合、システムに気泡を導入しないように注意してください。
- データ収集が完了すると、緩やか小脳ホモジネートをspirateエタノールおよび脱イオン水でチャンバを洗浄。クリーンたら、追加の小脳ホモジネート試料は限りPTFE膜が無傷のままであるようにするための追加のキャリブレーションなしで実行することができます。シリカゲル又は乾燥剤と脱イオン水とエタノールとストアと最後の完了、きれいな電極ました。
注:同じ日の実行の間に、膜が乾燥しないことを確実に脱イオン水でチャンバーを埋めます。 - 呼吸データのエクスポート40分で2分をスプレッドシートプログラムに後基質添加を開始して、機器のソフトウェアで作成されたデータシートを使用します。
- 基質または阻害剤あたりの呼吸の速度を計算します。アスコルビン酸TMPD基質添加の間、呼吸速度、総呼吸を分割して、データを正規化します。
注:呼吸速度は、神経変性の実験において特に望ましい組織のタンパク質含有量をさらに正規化することができますここで組織内容が異なる場合があります。これを行うには、標準的なタンパク質アッセイで使用するために(ステップ9.3から)のサンプルホモジネートの50μLを留保します。
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Representative Results
コハク酸と小脳ミトコンドリアの薬理学的標的化を通して、私たちは、小脳の神経変性疾患のSCA1のマウスモデルにおけるミトコンドリア機能障害を防止することができます。コハク酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸、の正規の電子供与体は、治療( 図 1A)は、次の治療および神経病理学的評価の第2週の間、行動評価の始まりと、1ヶ月間SCA1マウスのホームケージの飲料水に溶解しました。コハク酸処理22フットプリントアッセイ、ビームアッセイ加速ロータロッドアッセイによって測定されるようにSCA1マウスの性能を改善します。行動の改善が強化された運動協調と( 図1B-D)の運動学習を示す検出しました。
行動性能のレスキューは、ろう膜の保全と協調して発見されましたbellar組織( 図2)。コハク酸処理が大幅にプルキンエ細胞体を保存し、未処理のSCA1マウスと比較して、処理されたSCA1マウスの小脳の主要な亀裂に(プルキンエ細胞の樹状突起樹の延長を示す)分子層の厚さを増加させました。プルキンエ細胞の樹状突起の長さとプルキンエ細胞体数は全体の小脳細胞構築5の強力な対策を提供します。
HPLCは、正常血液脳関門及び貫通小脳組織を横断ケージの飲料水に溶解し、そのコハク酸を確認するために処置されたマウスからの小脳組織で行いました。さらに、治療の長さを変化させる、用量応答曲線は、小脳組織( 図3A-B)に到達する実行可能な方法として、コハク酸の適宜の処理をサポートします。私たちの呼吸実験は、継続していると我々の結果は、研究に掲載されます原稿。ここでは、我々は成功し、様々な電子伝達鎖の基質および阻害剤( 図3C)を添加した際に小脳酸化的リン酸化複合体を介して呼吸の速度を記録することができることを示しています。最終的には、酸化的リン酸化のSCA1マウス小脳における赤字とコハク酸処理によるそれらの赤字の反転を示すために、呼吸アッセイを使用します。
図1: 治療スキーム及び代表的なデータフットプリントアッセイから、ビームアッセイおよび加速ロータロッド。 (A)コハク酸は、生後17週で開始し4週間SCA1マウスのホームケージ飲料水に溶解しました。 SCA1マウスは生後5週目に運動失調の表現型を表示し始めます。概略的に示されていない3つの制御コホートある:コハク酸処理した野生型マウスVEのSCA1マウスおよびビヒクル処置野生型マウスをhicle処理しました。行動評価、次のように治療期間中に行われた:フットプリントアッセイを17週の間、週18の間に、ビームアッセイを、年齢の20週で週19時のロータロッドを加速し、マウスを屠殺し、小脳組織が免疫病理アッセイのために採取した、HPLCアッセイおよび呼吸アッセイ。 (B)ビヒクル処置野生型歩行(上)、ビヒクル処置SCA1歩行(中央)とコハク酸処理SCA1歩行(下)を示すフットプリントアッセイの代表的なデータ。 (C)ビーム分析データは、コハク酸処理とSCA1マウスの(正常に実行するための試行回数として測定)ビーム性能の向上を示します。 (* P <0.05)。落下する待ち時間の増加によって示されるように(D)コハク酸処理大幅に(* P <0.05)SCA1 22匹のマウスのロータロッド性能を加速向上します。 CD再におけるエラーバー平均の標準誤差をflect。有意性は、一元配置分散分析および多重比較事後解析により決定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:プルキンエ細胞数および分子層厚免疫病理アッセイからの代表的なデータ。 (A)について染色媒体処理対照トランスジェニック小脳の一次亀裂(上)、ビヒクル処置SCA1小脳の一次亀裂(中央)とコハク酸処理SCA1小脳の一次亀裂(下)を示すプルキンエ細胞数アッセイの代表的な結果ATXN1陽性の核(赤)およびDAPI(青)で対比。白い線が組織の200μmの領域を描きます細胞数に指定されました。トランスジェニック対照が核プルキンエATXN1と野生型マウスの容易に検出可能なレベルを提供していますので、この特定の分析のために、過剰発現プルキンエ細胞特異的プロモーターの制御下で、非病原性ATXN1遺伝子を制御するトランスジェニックマウスではなく、野生型マウスを使用しましたではない。制御トランスジェニックマウスは、運動失調表現型または小脳の神経変性は表示されません。 (B)ビヒクル処理した野生型小脳の一次亀裂(上)、ビヒクル処置SCA1小脳の一次亀裂(中央)とコハク酸処理SCA1小脳の一次亀裂(下)を示す分子層の厚アッセイの代表的な結果は、カルビンジンのために染色、プルキンエ細胞のマーカー(白)。 3小脳細胞層の二つは、カルビンジンで可視化することができます。 (プルキンエ細胞体からなる)中間プルキンエ細胞層(プルキンエCEからなる最も外側分子層と一緒に表示されていますLL樹状突起)。分子層は、組織の自然なひだに起因する一次亀裂の中央に表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3:HPLC および呼吸アッセイからの代表的な結果。最大250ppmのコハク酸酢酸緩衝液中に希釈し、測定されたHPLCピーク下の面積に対してプロットする既知の濃度の(A)の標準曲線。行の式は、処理された組織サンプルから、未知のコハク酸の濃度を計算するために使用しました。 (B)処理の異なる時間後のマウス小脳組織からの代表的な用量反応コハク酸ピーク(いずれかの0,1または5週間)。条件の下で説明、コハク酸は、典型的には、10と12分の間に溶出しました。 (C)ビヒクル処置野生型マウス小脳組織からの代表的な呼吸ラン。青い線は赤い点線は、呼吸速度の変化と赤の実線が破線の平滑化バージョンを示して描いている、酸素濃度の変化を示しています。グルタミン酸/リンゴ酸のDジギトニン=また、G / M =また、ロテノンのADP、R =添加のA =加え、コハク酸、アンチマイシンAのAA =加算と昇順のA / T =添加のS =追加/ TMPD。全ての基質は、図に示されている時点で、プロトコル(ステップ9.5)に記載の濃度で添加しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
説明したように、これらの方法を使用する場合、それらは、小脳の神経変性疾患のマウスモデルにおける酸化的リン酸化によって媒介されるミトコンドリア機能不全を検出し、緩和することが可能です。組み合わせた生化学的および行動アッセイは、小脳の神経変性疾患の病態にミトコンドリアの寄与の程度を決定するための多面的な方法です。代謝を促進し、ミトコンドリア機能を高めるためにコハク酸でマウスを処理することによって、我々は小脳行動障害と小脳変性症の救出を表示することができます。
ここに提示された方法は、小脳の神経変性疾患の潜在的な治療のための水溶性の代謝標的化合物の多種多様を試験するために使用することができます。コハク酸は、ケージの飲料水を介して単純な送達を可能にし、補足した食物ペレットの作成を必要としない0.75ミリグラム/ mLで水に容易に溶解します。他の水溶性化合物は、容易にプロトコルに置換することができます。水溶性ではない代謝標的化合物を使用する場合、我々の方法は、容易に補充した食物ペレット11、12での処理に適合させることができます。新しい化合物を試験する場合、HPLC分析または他の適当な検出方法を経由して治療を開始する前に、薬物の小脳浸透性を検証することが重要です。
病理学的評価のバッテリーは小脳の神経変性病理を検出することにより、それらの報告の有効性に選ばれました。小脳の神経変性疾患を含む様々なのSCA、およびフリードライヒ失調症6、23、24のフットプリントアッセイ、ビームアッセイおよびロータロッドアッセイが広く使用されている評価。これらの特定の行動評価は強く小脳変性症と相関します。しかし、他のbehavioraLパラダイムは、置換または必要に応じて添加することができます。
アタキシン1およびカルビンジンとSCA1マウスのプルキンエ細胞の標識化は、広くSCA1モデル5、20、21に小脳変性症を検出するために使用されます。他のニューロンの選択的な抗体と組織領域は、必要に応じて、神経変性の軽減を視覚化するために使用することができます。
呼吸分析は、小脳組織から個々のミトコンドリア複合体内の機能不全または修理を特異的に検出するための強力なツールです。注意は、組織を採取し、再現性のある結果を達成するためのアッセイを実行するまでの時間を最小にするように注意すべきです。また、分析される組織の均質性に留意することが重要です。具体的には、小脳組織は、我々のモデルでSCA1導入遺伝子を発現していない顆粒ニューロンの圧倒的構成されています。したがって、このの重要なステッププロトコル全体小脳呼吸が酸化複雑な関数を検出するための実行可能な方法があるかどうかを決定することです。トランスジェニックSCA1マウス小脳における呼吸変化が微妙であってもよいし、統計学的に有意な結果を達成するために被験者の数の増加を必要とし得ます。
このプロトコールで詳述行動及び神経病理学的方法の組み合わせは、SCA1疾患の明確な定量化を提供し、確実に、水溶性化合物で処理して改善を検出することができます。このプロトコルの重要性は、様々なトリートメントやマウスモデルの多様なアレイに対する広い適応性です。さらに、このプロトコルで使用される技術の多くは、高価な設備や複雑な技術を必要とせず、したがって、学部研究の設定に適しています。このプロトコルの将来の応用は、化合物の年齢依存性の送達時に治療効果の程度を評価するために使用されます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
Antibodies | |||
11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
Animals | |||
Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
Equipment | |||
ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
Software | |||
ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).