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Medicine

Traiter Souris SCA1 avec hydrosolubles composés à non-Spécifiquement Boost Fonction mitochondriale

doi: 10.3791/53758 Published: January 22, 2017

Abstract

Le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle important dans le processus de vieillissement et dans les maladies neurodégénératives, y compris plusieurs ataxie spinocérébelleuse héréditaires et d'autres troubles du mouvement marqué par une dégénérescence progressive du cervelet. L'objectif de ce protocole est d'évaluer la dysfonction mitochondriale dans ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et évaluer l'efficacité du ciblage pharmacologique de la respiration métabolique via le composé acide succinique soluble dans l'eau pour ralentir la progression de la maladie. Cette méthode est applicable à d'autres maladies cérébelleux et peut être adaptée à un grand nombre de thérapies solubles dans l'eau.

Une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale est utilisée pour détecter et quantifier les changements liés à la maladie de la fonction mitochondriale. Avec des preuves génétiques (données non publiées) et des preuves protéomique de la dysfonction mitochondriale dans le modèle SCA1 de la souris, nous évaluons l'efficacité du traitement avec le rappel métabolique s soluble dans l'eaul'acide uccinic en dissolvant ce composé directement dans l'eau potable à la maison de la cage. La capacité du médicament à traverser la barrière sang-cerveau peut être déduit en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L'efficacité de ces composés peut ensuite être testé à l'aide de multiples paradigmes comportementaux, y compris le Rotarod accélération, test de poutre d'équilibre et de l'analyse de l'empreinte. l'intégrité cytoarchitecturales du cervelet peut être évaluée en utilisant des tests d'immunofluorescence qui détectent Purkinje noyaux cellulaires et les dendrites des cellules de Purkinje et soma. Ces méthodes sont des techniques fiables pour la détermination de la dysfonction mitochondriale et l'efficacité du traitement avec des composés solubles dans l'eau dans les maladies neurodégénératives cérébelleuse.

Introduction

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Les mitochondries sont les principaux producteurs de l'adénosine triphosphate (ATP), un coenzyme essentiel pour l'énergie cellulaire, avec la majorité de l'ATP mitochondrial produit par phosphorylation oxydative (OXPHOS) en utilisant la chaîne de transport d'électrons. Le cerveau, compte tenu de ses besoins métaboliques élevés et de sa dépendance à l'égard de la phosphorylation oxydative pour alimenter l'activité neuronale, est très sensible à un dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, un dysfonctionnement mitochondrial est déclenchée au cours du processus de vieillissement, 1 et est impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives , 2, 3, 4. Par conséquent, il en résulte que les mitochondries sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour la neurodégénérescence.

Dans ce protocole, nous avons adopté l'utilisation de ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) comme une maladie neurodégénérative modèle pour l'étude des mitochondriesl dysfonctionnement et le développement de thérapies ciblées mitochondriales. SCA1 est causée par une mutation polyglutamine (polyQ) d'extension de répétition dans le produit du gène ataxine-1 qui provoque une dégénérescence progressive des neurones de Purkinje du cervelet et les neurones d'autres régions du cerveau. La lignée de souris transgénique utilisé ici (désignée comme la souris SCA1), qui exprime un polyQ mutant ataxine-1 transgène sous le contrôle d'un promoteur spécifique de Purkinje cellules, permet l'analyse ciblée de l'élément de Purkinje cellules de SCA1 5. Les souris subissent SCA1 progressive dégénérescence des cellules de Purkinje et développent une démarche ataxique 6.

dysfonction mitochondriale et complexe mitochondrial ciblé l'efficacité du traitement peuvent être évalués avec une batterie de tests moléculaires et comportementales. Dysfonction mitochondriale complexe est mesurée ex vivo par des tests de respiration qui détectent la consommation altérée d'oxygène dans les tissus cérébelleusela présence de substrats et inhibiteurs 7 de la chaîne de transport d'électrons. Des dosages de respiration ont déjà été utilisés avec des tissus perméabilisées, les isolats mitochondriaux et les tissus ensemble 7, 8, 9. Ils permettent une évaluation directe de la fonction mitochondriale contrairement aux méthodes de collecte de données morphologiques telles que la microscopie électronique à transmission ou immunofluorescence. L'utilisation de tissu entier plutôt que des mitochondries isolées empêche une sélection biaisée des mitochondries saines qui peuvent survenir au cours du processus d'isolement 7. Lorsque adaptée au protocole comme indiqué, le dosage de la respiration est une méthode utile pour détecter un dysfonctionnement mitochondrial dans les états pathologiques neurodégénératifs cérébelleux.

Des activateurs non spécifiques du métabolisme peuvent être utilisées pour déduire la dysfonction mitochondriale dans les modèles de souris transgéniques de diseas neurodégénérativese et de l'aide à la mise au point de nouvelles thérapies. La quercétine, et de la créatine Coenzyme Q10 ont tous été montré pour améliorer la pathologie de la maladie neuro - dégénérative chez les patients et dans des modèles animaux de maladies neuro - dégénératives 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Nous présentons ici un activateur métabolique roman, l'acide succinique, pour stimuler le métabolisme et stimuler la fonction mitochondriale dans les maladies neurodégénératives. Faire en sorte que l'activateur est de traverser la barrière hémato - encéphalique, la HPLC a été utilisée pour détecter la délivrance d' un tissu neural chez les souris traitées 17.

Pour évaluer les effets thérapeutiques des composés solubles dans l'eau métaboliquement ciblés tels que l'acide succinique, une batterie de paradigmes comportementaux et des études immuno-pathologiques peuvent être utilisés. due aux déficits de la coordination motrice trouvées dans les maladies neuro - dégénératives cérébelleuse, le dosage de la piste de l' empreinte, un dosage de faisceau et l' accélération de dosage de tige de rotation sont utilisés pour détecter le comportement de secours de la pathologie 6, 18, 19. Ces mesures sont complétées par une évaluation de immunopathologique cytoarchitecture cérébelleuse , en évaluant l' épaisseur de la couche moléculaire (définie comme étant la cellule de Purkinje dendritique longueur de l' arbre) et les comptages de Purkinje soma des cellules dans un tissu de lobule défini cérébelleuse 6, 20, 21. Nous présentons ici des méthodes neuropathologiques et comportementales multiples pour la détection et le traitement de la dysfonction mitochondriale avec des composés solubles dans l'eau métaboliquement ciblée.

Nous utilisons une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale pour analyser un dysfonctionnement mitochondrial dans la tran SCA1souris sgenic. En outre, nous montrons que les symptômes de la maladie et de la pathologie sont améliorées par l'acide mitochondriale rappel succinique soluble dans l'eau, ce qui implique en outre la dysfonction mitochondriale dans progression de la maladie SCA1.

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Protocol

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Ce protocole suit les directives du IACUC au Skidmore College pour travailler avec des souris.

1. Traitement par des composés solubles dans l'eau

  1. Dissoudre l'acide succinique à une concentration de 0,75 mg / mL dans de l'eau potable cage. Notez que tout composé d'intérêt à la concentration souhaitée soluble dans l'eau pourrait être substitué à ce stade. Incorporer la solution pour vous assurer que le composé est complètement dissous.
  2. Après que les souris ont atteint l'âge désiré de traitement, à remplacer l'eau de boisson chez des cages du groupe de conditions de traitement avec la solution à l'étape 1.1.
  3. Mesurer le poids des deux bouteilles d'eau de groupe de traitement et de contrôle quotidien pour assurer que les deux traités et les souris témoins boivent la même quantité d'eau. Utilisez ces mesures pour calculer la dose totale de médicament par cage. Continuer le traitement tout au long du poids de la bouteille expérience et le moniteur.

2. analyse de l'empreinte

  1. Placez la piste sur le sol ouune table dans une salle confinée. Réglez la piste à un léger angle vers le haut vers la zone de la maison bordée de literie et récompense alimentaire (par exemple céréales sucrées). Aligner la longueur de la piste avec une feuille de papier blanc. Laisser le sujet à acclimater dans la zone de la maison pendant 5 min.
  2. Retirer le sujet de la zone de la maison et de la peinture pattes arrière gauche et droite, respectivement, avec de la peinture à base d'eau non-toxique bleu et rouge. Les impressions de peinture seront utilisés pour calculer les mesures comportementales de sortie multiple.
  3. Placez le sujet au début de la piste et permettre au sujet de marcher à la boîte de la maison. Une fois que le sujet a atteint la zone de la maison, fermer la trappe, et permettre au sujet de rester dans la zone de la maison pendant une minute avant de revenir à la cage respective. Nettoyer la zone de la piste et la maison avec 30% d'éthanol et remplacer la literie, récompenser la nourriture, et le papier de la piste pour le sujet suivant.
  4. Quantifier nombre de foulées, la largeur de la porte, l'angle de l'étape, et le nombre de tours prisespar sujet selon les méthodes analytiques décrites précédemment 6. Un essai de l'empreinte de succès est défini comme un minimum de 5 empreintes successives dans lesquelles le sujet est la marche vers la zone de but sans se retourner ou d'arrêter.

3. Analyse de faisceau

  1. Mettre en place un appareil de faisceau selon les spécifications barre transversales décrites précédemment 6 avec les 6 faisceaux suivants: poutre 1 = rectangulaire, largeur 28 mm; faisceau 2 = rond, diamètre 28 mm; poutre 3 = rectangulaire, largeur 12 mm; poutre 4 = rond, diamètre 12 mm; poutre 5 = rectangulaire, largeur 6 mm; poutre 6 = rond, 6 mm de diamètre. À une extrémité de la poutre, mettre en place une boîte à la maison sombre avec de la nourriture de récompense.
  2. Pour former des sujets sur la poutre, assembler l'appareil avec un faisceau 3. Placez délicatement le sujet sur l'extrémité de la poutre opposée à la boîte de la maison, et permettre au sujet de marcher à travers. Permettre à chaque sujet jusqu'à trois essais à 2 min pour obtenir une exécution réussie, Défini comme traversant la poutre et entrer dans la zone de la maison à moins de 2 min. Entre les essais, que le sujet reste dans la zone de la maison pendant 2 min. Entre sujets, nettoyer la zone du faisceau et la maison avec 30% d'éthanol et remplacer la nourriture de récompense en préparation pour le prochain sujet.
  3. Répétez l'étape 3.2 fois par jour pendant les deux prochains jours résultant en un total de 3 jours de formation séquentielles. Le jour de l'essai, le jour 4, devrait suivre successivement les jours de formation.
  4. Pour tester les sujets le jour 4, assembler d'abord l'appareil avec un faisceau 1 et mettre en place la boîte de la maison, comme décrit dans l'étape 3.1. Placez une caméra vidéo à l'avant de l'appareil et vérifier que l'appareil à faisceau complet peut être clairement capturé sur vidéo. Commencez l'enregistrement et placez le premier sujet sur la poutre opposée à la boîte de la maison, ce qui permet jusqu'à 3 tentatives de 2 min pour mener à bien un essai. Entre les essais, laisser l'objet reposer pendant 2 min dans la zone de la maison.
  5. Continuer à tester soumis sur chacun des six faisceaux en ordre numérique,permettant ainsi au sujet de se reposer pendant 2 minutes dans la boîte de la maison avant de commencer le faisceau suivant. Entre sujets, nettoyer chaque faisceau et la boîte à la maison avec 30% d'éthanol et remplacer la nourriture de récompense en préparation pour chaque sujet.
    1. Videotape chaque essai et d'enregistrer le nombre d'essais réussis par sujet par faisceau comme suit: «1» indique le sujet a été un succès sur le premier essai, «2» indique le sujet a été un succès sur le second procès, «3» indique le sujet était avec succès le troisième et dernier procès, et «4» indique le sujet n'a pas été retenue sur l'un des trois essais.
  6. Utilisez des enregistrements vidéo des essais mesure par faux mouvements correctrices et correcteurs qui sont aveuglés aux conditions expérimentales du sujet. Définir un footslip comme l'arrière-pied qui est en vue directe de l'immersion de l'appareil photo ci-dessous une ligne médiane théorique sur toute la longueur de la poutre. footslip Scores moyens à partir de plusieurs marqueurs.
  7. Pour analyser le nombre de sessais ÉUSSI et le nombre de données, calculer le faux mouvements moyenne et l'erreur standard au sein de chaque génotype et la condition expérimentale cohorte. Effectuer une analyse ANOVA à une voie et des comparaisons multiples post-hoc afin de déterminer s'il y a un effet du traitement et du génotype sur le nombre d'essais réussis et le nombre de faux mouvements.

4. Accélérer Rotarod

  1. Acclimate sujets à la salle d'essai de 10 min avant le début du procès. Au cours de cette période d'acclimatation, préparer l'appareil de Rotarod, nettoyage chaque couloir de l'appareil avec 30% d'éthanol.
  2. Ouvrez le logiciel Rotarod et définir les paramètres commencer à 4 tours par minute, les paramètres d'accélération à 5 réglages min et vitesse finale à 40 tours par minute. Ces paramètres donnent une accélération constante 4-40 tours par minute sur une période de 5 min. Les souris peuvent rester sur le Rotarod à 40 tours par minute pendant 5 minutes supplémentaires au-delà de la période d'accélération pour une longueur de course maximale de 10 min.
  3. Post-acclimation, place des sujets onto le Rotarod dans leurs couloirs respectifs tandis que la tige tourne à 4 tours par minute. Une fois que tous les sujets sont dans leurs voies respectives, commencer le premier procès. Notez la latence de tomber à l'aide du logiciel de l'instrument; une minuterie secondaire peut être utilisé en tant que sauvegarde.
  4. Après fin de l'essai, permettre à chaque sujet de se reposer dans leurs réservoirs de voies respectives pendant dix minutes avant le prochain essai pour éviter la fatigue.
  5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 pour un total de quatre essais.
  6. Répétez les étapes 4.3 à 4.5 pour un total de quatre jours consécutifs, le traitement tout au long de la période d'essai continue. À la fin, de quantifier la latence à tomber la tige tournante pour chaque essai par sujet 6.

5. cérébelleuse Extraction et fixation

  1. Euthanasier souris via le dioxyde de carbone asphyxie selon les directives institutionnelles IACUC. Placer l'objet dans la chambre de dioxyde de carbone, et de libérer du dioxyde de carbone dans la chambre. Regarderl'animal en tout temps lors de l'étape euthanasier et ne pas laisser l'animal sans surveillance.
  2. Une fois que la respiration a cessé et les sujets ne montrent aucune perception de la douleur reste par la pression de la patte arrière, retirer l'objet de la chambre et faire une incision médiane supérieure à travers le tissu épithélial à partir du milieu du crâne caudale à la base du crâne à travers le tissu épithélial.
  3. Avec des ciseaux de dissection, couper le crâne de la base à la moelle épinière par la suture sagittale au bregma. Couper latéralement à travers chaque suture coronale avant de tirer au large des frontal, pariétal et interpariétales os en utilisant des pinces émoussées.
  4. Utilisez une pince contondants rompre latérale osseuse au cervelet. Utiliser une pince pour séparer le cervelet et le tronc cérébral colliculi et extruder du reste du tissu. Séparer le cervelet en gauche et droite hémisphères avec une pince.
  5. Placer immédiatement cerebelli à droite dans l' azote liquide à épargner pour HPLC analyse et cervelet gauche en pré-réfrigérés paraformaldéhyde 4% (PFA) pour la fixation des tissus. Récolter tout autre tissu d'intérêt avant la rupture de l'aorte et à rejeter la carcasse selon les règles institutionnelles IACUC.
    ATTENTION: PFA est un très toxique, inflammable et corrosif.
  6. Vingt-quatre heures après l'extraction, laver les tissus fixés au PFA (4% dans du PBS) dans du tampon phosphate salin (PBS) (trois fois, 5 minutes / lavage) avant de placer le tissu dans 30% de sucrose à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines.

6. immunopathologie Assay

  1. Fixez le tube d'un microtome en traîneau à un robinet d'évier et une boîte de contrôle de la température. Utilisez la boîte de contrôle de la température pour refroidir le stade microtome à -25 ° C. Réglez la molette épaisseur de coupe à 50 um.
    NOTE: Si le cadran sur le microtome de traîneau ne parvient pas à 50 um, réglez la molette sur un réglage plus fin et multiplier l'épaisseur en déplaçant le réglage en conséquence (par exemple régler la dial à 10 um et de passer cinq fois avant de sectionner pour une épaisseur totale de 50 pm).
  2. Tamponnez une partie dime-taille optimale Température de coupe (OTC) solution sur la scène. Avant gèle l'OTC, utilisez une pince pour positionner l'hémisphère de telle sorte que la surface de coupe sagittal médian est face vers le bas sur la couche de gré à gré. En travaillant rapidement, orienter doucement le tissu avec une pince de telle sorte que la pointe latérale de l'hémisphère est pointé vers la lame, supérieure à la scène. Laisser l'OTC de geler complètement.
    1. Travailler en couches, ajouter d'autres OTC autour du tissu permettant à l'OTC de geler complètement avant d'ajouter la couche suivante. Ajouter une couche mince de gré à gré sur le dessus du tissu et le gel.
  3. Section du tissu, la distribution de poids corporel égal sur la lame de coupe en coupe. Collecter sections à l'aide d'un pinceau d'artiste bien lieu et dans un puits de plaque marquée de manière appropriée contenant PBS 1x. Entre sections, re-définir l'épaisseur de coupe sur laluge cadran microtome, si nécessaire, à 50 um.
  4. Remplacer le PBS dans chaque puits du bien-plaque avec une solution d'urée [0,01 M d'urée dans du PBS] et placer la plaque sur la glace. Une fois prêt, retirer la plaque de sections de glace et faire bouillir dans une solution d'urée à trois reprises pendant 15 s à chaque fois pour démasquer des épitopes pour immunomarquage. Cette étape peut être facilement accompli en plaçant la plaque sur un bloc chauffant réglé à la température d'ébullition. Entre chaque étape d'ébullition, refroidir la plaque contenant les sections de tissu sur la glace.
    NOTE: Si vous effectuez l'urée, le blocage, l'anticorps primaire, un anticorps secondaire et les étapes de DAPI dans une plaque à 96 puits, utiliser 100 volumes uL tout au long. Si un puits de taille différente est utilisée, ajuster les volumes de réactifs en conséquence. Au lieu d'un bloc de chauffage, un four micro-ondes peut être utilisée pour faire bouillir les échantillons de tissu dans l'urée. des échantillons de micro-ondes sur un paramètre pour trois 15 intervalles de s haute puissance.
  5. Poster ébullition, laver sections à trois reprises, chaque fois que la suppression solution actuelle, en remplaçant la solutionavec PBS 1x et à agiter pendant 10 min.
  6. sections de bloc avec une solution de sérum d'âne (3% de sérum d'âne normal, 0,3% de triton X-100 dans du PBS) par un tissu en incubation dans du sérum pendant une heure avec agitation douce à température ambiante. Enlever la solution de sérum d'âne.
  7. Sections d'étiquetage avec 0,2 pg / ml anti-calbindin et 1: 2000 anti-ataxine-1 anticorps (11NQ) 16 dans une solution de sérum d'âne et incuber à 4 ° C pendant 72 h avec agitation douce.
  8. Laver les coupes avec du PBS comme à l'étape 6.5 avant l'incubation des sections dans un anticorps secondaire approprié (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-chèvre et 1: anticorps 500 Alexa Fluor-594 anti-lapin dilué dans une solution de sérum d'âne) à 4 ° C pendant 48 h avec agitation douce.
  9. Laver les articles à trois reprises avec du PBS comme à l'étape 6.5 avant que les noyaux de cellules de marquage avec du DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole), la solution diluée à une concentration finale de 0,5 pg / ml dans du PBS. DAPI incubation ne doit pas dépasser dix minutes. Retirer solution et laver avec du PBS comme dans l'étape 6.5.
  10. Monter les tissus sur des lames revêtues de gélatine 2% avec un milieu de montage pour réduire photoblanchiment. Coverslip et sceller avec du vernis à ongles.
  11. Avec un microscope confocal à balayage localiser la fissure principale du cervelet sous la lumière de fond clair. Avec un objectif 10X UIS2, numériser et exciter séquentiellement DAPI, AlexaFluor-488 et AlexaFluor-594 canaux à l'aide d'un laser de 405 nm de diode, un 488 nm laser à gaz d'argon et d'une diode laser 559 nm, respectivement, en conjonction avec un DM488 / 559 nm dichroïque diviseur de faisceau. Séparer et collecter la lumière émise en utilisant SDM490 et SDM560 séparateurs de faisceaux et un filtre passe-bande BA575-675, respectivement.
    1. Pour chaque canal, la construction d'un z-stack au sein de la fissure primaire avec z = 20 um et l'étape = 0,1 um. Utilisez le logiciel de post-traitement fourni avec le microscope confocal à ajouter dans un marqueur de taille à l'image finale.
      REMARQUE: les lasers alternatifs, les filtres et les fluorophores peuvent être substitués basés inspirty. Si AlexaFluor-488 ou AlexaFluor-594 détection est faible, un phosphure de gallium (GaAsP) détecteur haute sensibilité peut être utilisé pour amplifier le signal si disponible.

7. Couche Quantification moléculaire épaisseur et le nombre de cellules de Purkinje

  1. En utilisant ImageJ, ouvrez une image z-pile de fissure primaire teinté et divisé chaque image dans ses canaux rouge, bleu et vert en sélectionnant 'Image' de la barre de menu, "Couleur" de l'onglet Image et «Chaînes de Split 'de la couleur languette.
  2. Créer une projection de Z max de chaque canal qui a été divisé. Lorsque l'image de canal d'intérêt est ouvert, sélectionnez 'Image' de la barre de menus, «sections» de l'onglet Image et «Z-projet» de l'onglet «Sections». Dans le menu de commande 'Z-projet ", sélectionnez" Max Z projection' et cliquez sur 'OK'. Répétez l'opération pour chaque canal.
  3. Ouvrez le plug-in Cell Compteur en sélectionnant 'Plugins' de the barre de menu, "Analyser" de l'onglet Plugins et "Cell Counter" de l'onglet Analyser.
    NOTE: ImageJ et le compteur de cellules Plugin ImageJ peuvent être téléchargés sur les sites Web fournis dans la Table des matières et équipements.
  4. Quantifier le nombre de cellules de Purkinje en comptant les noyaux de Ataxin-1 marqué qui se trouvent le long d'un tronçon de 200 um prédéterminée de longueurs antérieure et postérieure de la fissure primaire. Utilisez la carte de seuil en sélectionnant 'Image' de la barre de menu, «Réglage» de l'onglet Image et «Seuil» de l'onglet Ajuster pour faire une carte de seuil du canal d'intérêt (rouge dans le cas des noyaux Ataxin-1 marqué ).
    1. Choisissez une gamme de pixels qui peut être normalisée à travers la quantification (31-225 pixels par exemple). Jeter le bruit des images en cochant la case "Arrière-plan foncé" dans la fenêtre de seuil. signal d'image peut être inversé pour la facilité de comptage.
  5. Quantifier couche moléculaire thiquekness dans le canal vert en utilisant les «canaux de Split 'et' Seuil Map 'outil comme dans les étapes 7.1 et 7.2. En utilisant le marqueur de taille sur chaque image comme un guide, mesurer au hasard trois longueurs de couches moléculaires dans chacun des deux désigné 200 um étendues de chaque image de fissure primaire. Effectuer des mesures à partir de l'extrémité proximale de l'arbre dendritique Purkinje à la base du soma Purkinje à l'extrémité distale de l'arbre dendritique Purkinje.
  6. Enregistrement Purkinje Les comptages de cellules et l'épaisseur de la couche moléculaire comme des moyens plus ou moins l'erreur standard. Effectuer une analyse de variance avec des comparaisons multiples analyse post-hoc pour tester l'effet des conditions de traitement ou de génotype sur le nombre de cellules et la longueur de l'arbre dendritique.

8. HPLC Analyse des cérébelleuse succinique Concentrations acide post-traitement

  1. Préparation de l' échantillon pour l' analyse
    1. Peser chaque hémisphère cérébelleux droit récolté avantutiliser dans une analyse par HPLC. Émincer moitiés hémisphériques un à la fois dans un dounce homogénéisateur pré-refroidi et ajouter 0,5 ml de 75:25 (en volume) de l' eau: une solution de methanol à chaque moitié homogénéisé 17.
    2. L'utilisation d'un homogénéisateur pré-réfrigérée étroite, grossièrement briser le tissu avec 5 coups de Dounce. Continuer à hacher finement chaque échantillon de tissu avec un homogénéiseur plus large, en appliquant 20 coups de Dounce.
    3. Transférer les broyats de pré-réfrigérée microtube. Après chaque échantillon, rincer le homogénéisateur avec 0,5 mL d'eau glacée: solution de méthanol et ajouter le rinçage au tube de microcentrifugeuse.
    4. Centrifugeuse échantillons d'homogénat à 1300 xg pendant 30 min à 25 ° C et recueillir le surnageant dans un tube propre.
    5. Filtrer le surnageant à travers une unité de filtre centrifuge logé avec un filtre en cellulose régénérée de 10 kilodaltons (kDa) limite nominale du poids moléculaire. Si ne fonctionne pas immédiatement analyse HPLC, magasin filtré échantillons à -80 °C.
  2. HPLC Instrumentation et Conditions
    1. Fixer une colonne de chromatographie d'exclusion ionique avec une longueur d'au moins 30 cm et une dimension de particules de 7 pm à un chromatographe liquide à haute performance.
    2. Préparer et dégazer une quantité d'un tampon acétate 1 mM suffisamment ajustée à un pH de 5.
    3. Régler la HPLC avec une vitesse de phase mobile de 0,8 ml / min. Si l'on utilise un détecteur UV-vis, sélectionner une longueur d'onde de détection de 224 nm. temps d'élution typique de l'acide succinique dans ces conditions sont comprises entre 10 et 12 min.
  3. Exécution et analyse des normes et des échantillons
    1. Préparer un ensemble de normes en phase mobile de tampon d'acétate avec des concentrations d'acide succinique entre 0 et 250 ppm.
    2. Exécutez chaque norme et préparer une courbe d'étalonnage en utilisant la zone de pointe mesurée à partir de chaque essai.
    3. Une fois, on obtient une courbe standard précise, exécuter des échantillons préalablement préparés dilués dans un tampon d'acétate.Pour une plus grande précision de la mesure, les échantillons peuvent être dopés avec des concentrations connues de l'acide succinique qui ont été dilués dans la phase mobile. Exécutez tous les échantillons en triple exemplaire.
    4. Analyser les chromatogrammes HPLC pour déterminer la concentration d'acide succinique des échantillons en utilisant la courbe d'étalonnage et en multipliant ensuite par le volume de l'échantillon et en divisant par la masse de l'échantillon initial.

9. Ex Vivo Analyse des cérébelleuse mitochondrial Fonctionnalité L' utilisation d' une unité de contrôle des électrodes d'oxygène

  1. Créer une électrode de type Clark en utilisant un système disponible dans le commerce en appliquant d' abord une goutte de chlorure de potassium (50% KCl / v) solution sur la cathode en platine, en coupant un morceau de tabac commercial 1,5 cm2 papier à rouler et à placer délicatement le papier la cathode de platine.
    1. Couvrir la cathode et l' anode entourant avec un morceau de polytétrafluoroéthylène (PTFE) du papier de 2,5 cm 2 et snuggly garantir à la fois membranes avec joints toriques, en vous assurant qu'il n'y a pas de plis ou de bulles dans les membranes. Goutte à goutte une solution de KCl 50% dans le puits environnants.
  2. Fixer l'électrode premade dans la chambre de dosage et remplir avec de l'eau saturée d'air. Chauffer la chambre à 30 ° C, ajouter une barre d'agitation de 0,8 cm à la solution et agiter à 70 tours par minute à l'aide du logiciel de l'instrument. Calibrer la chambre en établissant l'oxygène zéro. Pour ce faire, ajoutez en série quelques cristaux de dithionite agent de sodium réducteur à la solution.
    1. Une fois que l' étalonnage est obtenue, laver la chambre une fois avec 70% d' éthanol, puis lavez six fois avec de l' eau déminéralisée avant de permettre à la chambre de s'acclimater dans 1,5 ml de tampon de respiration (5 mM de MgCl2, 60 mM de KCl, mannitol 100 mM, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de Na2EDTA, 60 mM de Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
      REMARQUE: toutes les traces de dithionite de sodium doit être complètement enlevé pendant les étapes de lavage avant de tenter de mesurerla concentration en oxygène au cours des expériences de respiration.
  3. Homogénéiser doucement les hémisphères cérébelleux pesés dans 0,5 ml de tampon d'homogénat (0,25 M de saccharose, 0,5 mM d'EDTA, 50 mM de Tris-HCl [pH 7,4]). Transfert homogénat à un tube propre de 1,5 ml et garder réfrigéré jusqu'à commencer l'essai.
  4. Ajouter l'homogénat à la chambre, pour atteindre un volume final de 2 ml. Perméabiliser le broyat par addition d'cérébelleux 40 ul de la digitonine ou la saponine (5 mg / mL); laisser incuber le tissu homogénéisé pendant 10 min.
    NOTE: Digitonine et saponine sont toxiques, et des temps d'incubation doivent être réduites au minimum.
  5. Pour commencer à enregistrer la consommation d'oxygène, déterminer la fonction mitochondriale par l'activation et l'inhibition de la phosphorylation oxydative de la chaîne en utilisant des substrats et des inhibiteurs, respectivement (3 enregistrements min par substrat).
    1. Ajouter des substrats en utilisant des seringues propres comme suit: 10 pi 2 M glutamate [concentration finale (fc) 0,01 M],5 ul de 0,8 M malate [fc 2 mM], 20 ul de 0,5 M d'adénosine diphosphate (ADP) [fc 5 mM], 1 pi 1 mM roténone [fc 0,5 uM], 20 pi 1M acide succinique [10 mM], 1 pi 5 mM antimycine A [fc 2,5 uM], 1 pi de 0,8 M d'ascorbate [fc 0,4 mm] et 5 ul de 0,2 M de tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD). [Fc 0,5 mM] Lors de l'ajout de substrats à la chambre veiller à ne pas introduire de bulles d'air dans le système.
      NOTE: Des informations détaillées sur l'effet fonctionnel induite par chaque substrat et inhibiteur est décrit dans un protocole précédemment publié 7. peuvent avoir besoin d'être généré pour déterminer les concentrations optimales des substrats et inhibiteurs dans les préparations / tissus / espèces non étudiées précédemment courbes dose-réponse individuelle. De même, le protocole peut être optimisé pour les tendances innées du métabolisme du tissu / espèces étudiées, telles que les préférences de substrat.
  6. Une fois la collecte des données est terminée, doucement unspirate les homogénats cérébelleux et nettoyer la chambre avec de l'éthanol et de l'eau déminéralisée. Une fois les échantillons propres, supplémentaires cérébelleux homogénat peuvent être exécutés sans étalonnage supplémentaire pour aussi longtemps que la membrane PTFE reste intacte. Après achèvement, nettoyer l'électrode avec de l'eau déminéralisée et de l'éthanol et le magasin avec un gel ou d'un déshydratant silice.
    NOTE: Entre le jour même court, remplir la chambre avec de l'eau déminéralisée veillant à ce que la membrane ne se dessèche pas.
  7. Utilisation de la feuille de données créé par le logiciel de l'instrument, l'exportation 40 min des données de respiration commençant deux minutes après l'addition du substrat à un programme de feuille de calcul.
  8. Calculer le taux de respiration par substrat ou un inhibiteur. Normaliser les données en divisant la respiration totale par le taux de respiration pendant l'addition du substrat de l'ascorbate-TMPD.
    NOTE: Le taux de respiration peut encore être normalisées par rapport à la teneur en protéines du tissu qui peut être particulièrement souhaitable dans des expériences de neurodégénérescencedans laquelle la teneur en tissu peut varier. Pour ce faire, réserver 50 ul de l'échantillon homogénat (de l'étape 9.3) pour une utilisation dans un dosage de protéines standard.

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Representative Results

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Par le ciblage pharmacologique des mitochondries cérébelleux avec de l'acide succinique, nous sommes en mesure d'empêcher un dysfonctionnement mitochondrial dans un modèle de souris de la maladie neuro-dégénérative SCA1 de cérébelleuse. Le donneur d'électrons canonique de la succinate déshydrogénase, acide succinique, a été dissous dans de l' eau potable à la maison de la cage de souris SCA1 pendant un mois, l'évaluation comportementale début au cours de la deuxième semaine de traitement et d' évaluation neuropathologique après le traitement (figure 1A). Le traitement de l' acide succinique 22 améliore les performances des souris SCA1 telle que mesurée par l'essai d'empreinte, un dosage de faisceau et l' accélération de dosage Rotarod. Les améliorations comportementales détectées indique améliorées la coordination motrice et apprentissage moteur (figure 1B-D).

Sauvetage de la performance comportementale a été trouvée de concert avec une préservation de cerebellar tissu (figure 2). le traitement de l'acide succinique conservé de manière significative les corps cellulaires de Purkinje et a augmenté l'épaisseur de la couche moléculaire (indicative de l'extension de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje) dans la fissure primaire cérébelleuse chez les souris SCA1 traités par rapport à des souris non traitées SCA1. Cellule de Purkinje longueur dendritiques et Purkinje compte corps cellulaire fournissent de solides mesures de cytoarchitecture cérébelleuse globale 5.

HPLC a été réalisée sur le tissu cérébelleux de souris traitées pour vérifier que l'acide succinique dissous dans l'eau potable cage réussi à franchir la barrière hémato-encéphalique et du tissu pénétrée cérébelleuse. Une courbe dose - réponse de la variation de la durée du traitement supplémentaire prend en charge le traitement ad libitum de l' acide succinique comme un moyen viable d'atteindre le tissu du cervelet (figures 3A-B). Nos expériences de respiration sont en cours et nos résultats seront publiés dans une recherchemanuscrit. Ici , nous montrons que nous pouvons réussir à enregistrer le taux de respiration par des complexes de phosphorylation oxydative cérébelleux après addition de différents substrats et inhibiteurs (figure 3C) chaîne de transport d'électrons. En fin de compte, nous allons utiliser le test de respiration pour montrer les déficits phosphorylation oxydative dans SCA1 cervelet de la souris et le renversement de ces déficits par traitement de l'acide succinique.

Figure 1
Figure 1: Schéma de traitement et des données représentatives de l'empreinte Assay, Poutre Assay et accélération Rotarod. (A) l' acide succinique a été dissous dans l' eau potable à la maison de la cage de souris SCA1 pendant quatre semaines à partir de 17 semaines d'âge. Des souris SCA1 commencent à afficher le phénotype ataxie à 5 semaines d'âge. Non représentés dans le schéma sont trois cohortes de contrôle: souris de type sauvage traités à l'acide succinique, vecule-souris traitées de SCA1 et les souris de type sauvage traitées par le véhicule. évaluations comportementales ont été menées au cours de la période de traitement comme suit: dosage empreinte au cours de la semaine 17, le dosage du faisceau pendant la semaine 18 et l'accélération de Rotarod pendant la semaine 19. À 20 semaines d'âge, les souris ont été sacrifiées et les tissus cérébelleux ont été récoltés pour des essais de immunopathologie, des analyses de CLHP et des tests de respiration. (B) de données représentatives de l'analyse de l' empreinte montrant une démarche de type sauvage traité avec le véhicule (en haut), traité avec le véhicule SCA1 marche ( au milieu) et un SCA1 démarche traité à l'acide succinique ( en bas). Données d'analyse (C) Poutre montrant une amélioration de la performance du faisceau (mesurée en nombre d'essais pour une exécution réussie) de souris SCA1 avec le traitement de l' acide succinique. (* P <0,05). (D) un traitement acide succinique améliore de manière significative les performances d' accélération Rotarod de SCA1 22 souris comme indiqué par une augmentation de la latence à tomber (* p <0,05). Les barres d'erreur en re CDFlect l'erreur standard de la moyenne. La signification a été déterminée par une analyse de la variance et des comparaisons multiples analyse post-hoc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Représentant des données des comtes de cellules de Purkinje et couche moléculaire Epaisseur Immunopathologie Assays. (A) Les résultats représentatifs de la numération des cellules test Purkinje montrant un contrôle traité par le véhicule transgénique fissure primaire cérébelleuse ( en haut), traité avec le véhicule SCA1 cérébelleuse fissure primaire (milieu) et un SCA1 cérébelleuse fissure primaire traitée à l' acide succinique ( en bas) teinté pour noyaux ATXN1-positifs (rouge) et DAPI (bleu). Les lignes blanches représentent les 200 um régions de tissudésigné pour le nombre de cellules. Pour cette analyse en particulier, une souris transgénique témoin surexprimant un gène de ATXN1 non pathogène sous le contrôle d'un promoteur Purkinje spécifique des cellules a été utilisé à la place d'une souris de type sauvage, car les caractéristiques de contrôle transgéniques facilement des niveaux détectables de nucléaire Purkinje ATXN1 et la souris de type sauvage ne fait pas. La souris contrôle transgénique ne présente pas un phénotype ataxique ou neurodégénérescence cérébelleuse. (B) Les résultats représentatifs de l'analyse de l' épaisseur de la couche moléculaire montrant un type sauvage fissure traité avec le véhicule cérébelleuse primaire (en haut), traité avec le véhicule SCA1 cérébelleuse fissure primaire (milieu) et un SCA1 fissure succinique traitée à l' acide cérébelleuse primaire ( en bas) colorées pour calbindin , un marqueur de cellules de Purkinje (blanc). Deux des trois couches de cellules cérébelleuses peut être visualisée à l'aide calbindine. La couche de cellules de Purkinje du milieu (constitué de corps cellulaires de Purkinje) est visible le long de la couche moléculaire externe (constitué de Purkinje CEdendrites ll). La couche moléculaire apparaît au milieu de la fente primaire due aux plis naturels du tissu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Les résultats représentatifs de la HPLC et Respiration Assays. (A) Courbe standard de concentrations connues jusqu'à l' acide succinique 250 ppm diluée dans un tampon acétate et comploté contre la zone sous le pic de CLHP mesurée. L'équation de la ligne a été utilisée pour calculer les concentrations inconnues de l'acide succinique à partir d'échantillons de tissus traités. (B) représentatifs réponse à la dose d'acide succinique pics provenant d'un tissu cérébelleux de souris après différents temps de traitement (0, 1 ou 5 semaines). Dans les conditionsdécrit, l'acide succinique typiquement éluée entre 10 et 12 min. (C) représentant la respiration terme du tissu cérébelleux de souris de type sauvage traité avec le véhicule. La ligne bleue représente la variation de la concentration en oxygène, la ligne rouge en pointillés représente la variation de la fréquence respiratoire et la ligne rouge solide représente une version lissée de la ligne en pointillés. D = addition de la digitonine, G / M = addition de glutamate / malate, A = addition d'ADP, R = addition de la roténone, S = addition de l'acide succinique, AA = addition de l'antimycine A et A / T = addition de Asc / TMPD. Tous les substrats ont été ajoutés aux temps représentés sur la figure et aux concentrations décrites dans le protocole (étape 9.5). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Si ces méthodes sont utilisées, comme décrit, ils sont capables de détecter et d'atténuer l'oxydation dysfonctionnement mitochondrial à médiation par la phosphorylation dans des modèles murins de maladies neuro-dégénératives du cervelet. Les tests biochimiques et comportementaux combinés sont des méthodes multiples pour déterminer l'étendue de la contribution mitochondrial à cérébelleux pathologie de la maladie neurodégénérative. En traitant des souris avec de l'acide succinique pour stimuler le métabolisme et stimuler la fonction mitochondriale, nous sommes en mesure de montrer un sauvetage des déficits comportementaux cérébelleux et la dégénérescence cérébelleuse.

La méthodologie présentée ici peut être utilisé pour tester une large variété de composés ciblés métaboliquement solubles dans l'eau pour le traitement potentiel des maladies neurodégénératives cérébelleuse. L'acide succinique est facilement soluble dans l'eau à 0,75 mg / mL, ce qui permet une simple livraison par l'intermédiaire de l'eau potable de la cage et ne nécessite pas la création de granulés alimentaires supplémentés. Autre soluble dans l'eaules composés peuvent être facilement substitués dans le protocole. Si l'on utilise des composés métaboliquement cibles qui ne sont pas solubles dans l'eau, la méthodologie peut facilement être adaptée pour un traitement avec des granulés alimentaires supplémentés 11, 12. Lors de l'essai d'un nouveau composé, il est essentiel de contrôler la pénétration du médicament cérébelleuse avant de commencer le traitement par une analyse HPLC ou autre méthode de détection appropriée.

La batterie des évaluations pathologiques a été choisie en raison de leur efficacité rapportée à la détection de pathologies neurodégénératives cérébelleux. Les évaluations de test de l' empreinte, un dosage de faisceau et le dosage de la tige tournante sont largement utilisés de maladies neuro - dégénératives , y compris cérébelleuse divers SCA et Friedreich ataxie 6, 23, 24. Ces évaluations comportementales particulières sont fortement corrélés avec la dégénérescence cérébelleuse. Cependant, d'autres behavioral paradigmes peuvent être substitués ou ajoutés selon les besoins.

Le marquage des cellules de Purkinje chez des souris avec SCA1 ataxine-1 et calbindine est largement utilisé pour détecter la dégénérescence cérébelleuse dans des modèles SCA1 5, 20, 21. D'autres anticorps sélectifs neuronale et des régions tissulaires peut être utilisé pour visualiser l'atténuation de la neurodégénération, au besoin.

analyse de Respiration est un outil puissant pour la détection spécifique de dysfonctionnement ou de réparation au sein de complexes mitochondriaux individuels du tissu cérébelleux. Des précautions doivent être prises pour minimiser le temps entre le prélèvement du tissu et l'exécution de l'essai pour obtenir des résultats reproductibles. En outre, il est important de noter que l'homogénéité du tissu en cours d'analyse. Plus précisément, le tissu est constitué majoritairement cérébelleuse de neurones granulaires qui n'expriment le transgène SCA1 dans notre modèle. Par conséquent, une étape critique de ceprotocole consiste à déterminer si l'ensemble de la respiration cérébelleuse est une méthode viable pour la détection de la fonction complexe oxydatif. les changements de respiration dans le cervelet de souris transgéniques SCA1 peuvent être subtils et peuvent nécessiter un plus grand nombre de sujets pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

La combinaison des méthodes comportementales et neuropathologiques détaillées dans ce protocole prévoit la quantification distincte de la maladie de SCA1 et peut robuste détecter une amélioration lors du traitement avec des composés solubles dans l'eau. L'importance de ce protocole est dans sa grande capacité d'adaptation à divers traitements et un large éventail de modèles de souris. En outre, un grand nombre des techniques utilisées dans ce protocole ne nécessitent pas de matériel coûteux ou des techniques complexes et sont donc adapté à un cadre de recherche de premier cycle. Les applications futures de ce protocole seront utilisés pour évaluer le degré d'efficacité du traitement lors de la livraison du composé dépendant de l'âge.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine diphosphate Sigma Aldrich A2754 ADP
Ascorbate Sigma Aldrich A7631
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153 BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D9542 DAPI
Digitonin Sigma Aldrich D141
Dithiothreitol Sigma Aldrich D0632 DTT
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Glutamate Sigma Aldrich 1446600
Malate Sigma Aldrich 6994
Mannitol Sigma Aldrich M4125
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Potassium-lactobionate Bio-Sugars 69313-67-3
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saponin Sigma Aldrich 47036
Succinic Acid Sigma Aldrich S3674
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma Aldrich T7394 TMPD
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284
Urea Sigma Aldrich U0631
Vectashield mounting medium Vector Labs H-1000
Antibodies
11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody Life Technologies A-11015
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody Life Technologies A-11012
Calbindin antibody (goat) Santa Cruz C-20
Animals
Control transgenic mice Harry Orr, Ph.D. A02 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 mice Harry Orr, Ph.D. B05 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype mice The Jackson Laboratory 001800
Equipment
ESM-100L microtome ERMA Sledge microtome
Fluoview FV1200 Confocal Microscope Olympus
Glycerol-gelatin slides FD Neuro Technologies PO101
Hamilton syringe Sigma Aldrich VCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit Hansatech Instruments
P.T.F.E. paper Cole-Parmer UX-08277-15
Rotallion Rotarod PPP&G contact corresponding author for information
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Software
ImageJ National Institute of Health http://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (for ImageJ) National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) PPP&G contact corresponding author for information
Phidget21.dll (required for rotarod software) DLL-Files.com https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

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References

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  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8, (3), 225-235 (2015).
Traiter Souris SCA1 avec hydrosolubles composés à non-Spécifiquement Boost Fonction mitochondriale
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Ferro, A., Carbone, E., Marzouk, E., Siegel, A., Nguyen, D., Polley, K., Hartman, J., Frederick, K., Ives, S., Lagalwar, S. Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function. J. Vis. Exp. (119), e53758, doi:10.3791/53758 (2017).More

Ferro, A., Carbone, E., Marzouk, E., Siegel, A., Nguyen, D., Polley, K., Hartman, J., Frederick, K., Ives, S., Lagalwar, S. Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function. J. Vis. Exp. (119), e53758, doi:10.3791/53758 (2017).

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