Abstract
Mitokondriell dysfunksjon spiller en betydelig rolle i aldringsprosessen og i nevrodegenerative sykdommer, inkludert flere arvelige spinocerebellar ataksi og andre bevegelsesforstyrrelser preget av progressiv degenerasjon av lillehjernen. Målet med denne protokollen er å vurdere mitokondriell dysfunksjon spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) og vurdere effekten av farmakologiske målretting av metabolsk åndedrett via vannoppløselig forbindelse ravsyre å bremse sykdomsutviklingen. Denne fremgangsmåten er anvendelig for andre cerebellare sykdommer og kan tilpasses til en rekke vannoppløselige terapier.
Ex vivo-analyse av mitokondriell respirasjon blir brukt til å detektere og kvantifisere sykdomsrelaterte forandringer i mitokondriefunksjonen. Med genetisk bevis (upublisert data) og proteomikk bevis på mitokondriell dysfunksjon i SCA1 musemodell, vurderer vi effekten av behandling med vannløselige metabolske booster succinic syre ved oppløsning av denne forbindelsen direkte inn i hjemmeburet drikkevann. Evnen av medikamentet til å passere blod-hjernebarrieren kan utledes ved hjelp av høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Effektiviteten av disse forbindelser kan deretter bli testet ved hjelp av flere adferds paradigmer inkludert den akselererende rotarod, balanse bjelke test og fotavtrykk analyse. Cytoarchitectural integritet av lillehjernen kan vurderes ved hjelp immunfluorescens analyser som gjenkjenner Purkinje cellekjerner og Purkinje celle dendritter og soma. Disse metodene er robuste teknikker for bestemmelse av mitokondriell dysfunksjon og effekten av behandling med vannløselige forbindelser i lillehjernen nevrodegenerativ sykdom.
Introduction
Mitokondrier er de viktigste produsentene av adenosintrifosfat (ATP), en viktig koenzym for cellulær energi, med de fleste av mitokondriell ATP produseres gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) ved hjelp av elektrontransportkjeden. Hjernen, gitt den høye metabolske krav og sin avhengighet av oksidativ fosforylering for å drive nevrale aktiviteten, er svært utsatt for mitokondriell dysfunksjon. Som et resultat er mitokondriell dysfunksjon utløses under aldringsprosessen 1 og er implisert i patogenesen av flere neurodegenerative sykdommer 2, 3, 4. Derfor følger det at mitokondriene er attraktive terapeutiske mål for neurodegeneration.
I denne protokollen, har vi innført bruk av spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) som modell nevrodegenerativ sykdom for studiet av mitokondrienel dysfunksjon og utvikling av mitokondrie-målrettet terapi. SCA1 er forårsaket av en polyglutamine (polyQ) gjenta ekspansjon mutasjon i ataxin-1-genproduktet som utløser progressiv degenerasjon av Purkinje neuroner i lillehjernen og nerveceller i andre områder av hjernen. Den transgene mus linje som brukes her (betegnet som den SCA1 mus), som uttrykker et polyQ-mutant ataxin-en transgenet under kontroll av en Purkinje-cellespesifikk promotor, gjør det mulig for målrettet analyse av Purkinje-cellekomponent av SCA1 5. SCA1 mus gjennomgå gradvis Purkinje celle degenerasjon og utvikle ataxic gangart 6.
Mitokondriell kompleks dysfunksjon og mitokondrie-målrettet behandling effekt kan evalueres med et batteri av molekylære og atferdsmessige analyser. Mitokondriell kompleks dysfunksjon er målt ex vivo ved respirasjon analyser som gjenkjenner endrede oksygenforbruk innenfor lillehjernen vev inærvær av elektrontransportkjeden substrater og inhibitorer 7. Respirasjon assay har tidligere vært brukt med permeabilisert vev, mitokondrielle isolater, og hele vev 7, 8, 9. De tillater for direkte vurdering av mitokondriefunksjon i motsetning morfologiske datainnsamlingsmetoder som transmisjonselektronmikroskopi eller immunfluorescens farging. Bruken av hele vevet i stedet for isolerte mitokondrier hindrer forspent utvalg av sunne mitokondrier som kan oppstå under isoleringsprosessen 7. Når tilpasset til protokollen som er vist, er det åndedrett analyse en verdifull metode for påvisning av mitokondriell dysfunksjon i lillehjernen neurodegenerative sykdomstilstander.
Ikke-spesifikke aktivatorer av metabolisme kan brukes til å utlede mitokondriell dysfunksjon hos transgene mus modeller av neurodegenerative disease og bistand i utviklingen av nye behandlingsformer. Quercetin, koenzym Q10 og kreatin har alle vist seg å lindre nevrodegenerativ sykdom patologi hos pasienter og i dyremodeller av nevrodegenerativ sykdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Her presenterer vi en ny metabolsk aktivator, ravsyre, for å stimulere stoffskiftet og øke mitokondrienes funksjon i nevrodegenerativ sykdom. For å sikre at aktivatoren er krysset blod-hjerne barrieren, ble HPLC anvendt for å detektere levering til nervevev hos behandlede mus 17.
For å evaluere den terapeutiske effekten av metabolsk målrettet vannløselige forbindelser som ravsyre, kan et batteri av atferds paradigmer og immunpatologiske studier brukes. due til motor koordinering underskudd som finnes i lillehjernen nevrodegenerativ sykdom, fotavtrykk rullebanen analysen, bjelke analyse og akselererende roterende stang analysen brukes til å oppdage redning av atferds patologi 6, 18, 19. Disse tiltakene er supplert med immunpatologisk vurdering av lillehjernen cytoarchitecture ved å vurdere molekylær tykkelse (definert som Purkinje celle dendrittiske arbor lengde) og Purkinje celle soma tellinger innenfor et definert lobule av lillehjernen vev 6, 20, 21. Her presenterer vi flere nevropatologiske og atferds metoder for påvisning og behandling av mitokondriell dysfunksjon med metabolsk målrettet vannløselige forbindelser.
Vi bruker ex vivo analyse av mitokondriell respirasjon å analysere mitokondriell dysfunksjon i SCA1 transgenic mus. Videre viser vi at sykdomssymptomene og patologi er forbedret ved den vannoppløselige mitokondriell booster ravsyre, ytterligere impliserte mitokondriell dysfunksjon SCA1 sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger IACUC retningslinjer ved Skidmore College for å arbeide med mus.
1. Behandling med vannløselige forbindelser
- Oppløse ravsyre til en konsentrasjon på 0,75 mg / ml i buret drikkevann. Legg merke til at en hvilken som helst vannoppløselig forbindelse av interesse ved den ønskede konsentrasjon kan være substituert på dette stadiet. Rør løsningen for å sørge for at forbindelsen er helt oppløst.
- Etter mus nå ønsket alder for behandling, erstatte hjemmeburet drikkevann av behandlingen tilstanden gruppe med løsningen i trinn 1.1.
- Måle vekten av både behandlings- og kontroll gruppe vann flasker daglig for å sikre at både behandlede og kontrollmus drikker den samme mengde vann. Bruk disse målingene til å beregne total narkotika dose per bur. Fortsett behandlingen gjennom hele eksperimentet og monitor flaske vekt.
2. Footprint Analysis
- Plasser rullebanen på gulvet elleret bord i et trangt rom. Sett rullebanen på skrå mot hjemmet eske foret med sengetøy og belønning mat (f.eks sukkerholdig frokostblanding). Linje lengden på rullebanen med et hvitt papirark. La lagt akklimatisere seg i hjemmet boks for 5 min.
- Fjern emnet fra hjemmet boksen og male venstre og høyre bakbena, henholdsvis med blå og rød giftfri vannbasert maling. Malingen utskrifter vil bli brukt til å beregne multiple output atferdsmålinger.
- Plasser motivet i begynnelsen av rullebanen og at motivet for å gå til hjem-boksen. Når emnet har nådd hjem boksen, lukke lemmen, og at motivet ikke holde seg i hjemmet boksen i ett minutt før du går tilbake til de respektive hjemmeburet. Rengjør rullebanen og hjem boks med 30% etanol og erstatte sengetøy, belønne mat, og rullebane papir for neste emne.
- Kvantifisere antallet skritt, en bredde på port, vinkel trinn, og antall vindinger er tattved lagt i henhold til de analytiske metoder som er beskrevet tidligere 6. En vellykket fotavtrykk rettssaken er definert som minimum 5 sekvensielle fotavtrykk hvor motivet er vandre mot mål boksen uten å snu seg eller stoppe.
3. Beam Analysis
- Sett opp bjelke apparat i henhold til de tverrkryss spesifikasjonene som er beskrevet tidligere 6 med følgende 6 bjelkene: bjelken 1 = rektangulær, 28 mm bredde; bjelke 2 = runde, 28 mm diameter; bjelke 3 = rektangulær, 12 mm bredde; bjelke 4 = runde, 12 mm diameter; bjelken 5 = rektangulært, 6 mm bredde; bjelke 6 = runde, 6 mm diameter. I den ene enden av bjelken, sette opp et mørkt hjemme boks med mat belønning.
- For å trene fagene på strålen, montere apparatet med strålen 3. Forsiktig motivet på enden av bjelken motsatt av hjemme-boksen, og at motivet ikke gå over. Tillat hvert fag inntil tre 2-min forsøk for å oppnå et vellykket løp, Definert som krysser strålen og inn i hjemmet boks innen 2 min. I mellom studier, la temaet hvile i hjemmet boks for 2 min. I mellom fag, rengjør strålen og hjem boks med 30% etanol og erstatte belønning mat i forberedelsene til neste emne.
- Gjenta trinn 3.2 en gang per dag i de neste to dagene som resulterer i totalt 3 sekvensielle treningsdager. Testingen dag, dag 4, bør sekvensielt følge treningsdager.
- For å teste fagene på dag 4, første montere apparatet med bjelke 1 og sette opp hjemme boksen som beskrevet i trinn 3.1. Plassere et videokamera foran apparatet og kontrollere at hele stråleapparat klart kan fanges opp på video. Begynn opptak og sette den første faget på strålen motsatt av hjemme-boksen, slik at opptil 3 2-min forsøk på å fullføre en rettssak. I mellom studier, la lagt hvile i 2 minutter i hjemmet boksen.
- Fortsette å teste emnet på hver av de seks bjelker i numerisk rekkefølgeslik at motivet for å hvile i 2 minutter i hjemmet boksen før du starter neste bjelke. Mellom fag, rense hver bjelke og hjemmet boks med 30% etanol og erstatte belønning mat i forberedelse for hvert fag.
- Videobånd hvert forsøk og registrere antall vellykkede forsøk per gjenstand per bjelke som følger: "1" indikerer faget var vellykket på første forsøk, "2" indikerer faget var vellykket på den andre rettssaken, "3" indikerer faget var vellykket på den tredje og siste prøve, og "4" indikerer faget var ikke vellykket på noen av de tre forsøkene.
- Bruk videoopptak av studiene måler footslips av scorers som er blindet for de eksperimentelle betingelsene for faget. Definere en footslip som Poter som er i direkte riss av kameraet dyppe under en teoretisk midtlinje over lengden av bjelken. Gjennomsnittlig footslip score fra flere scorers.
- For å analysere antallet sVellykket forsøk og antall footslips data, beregne gjennomsnitt og standardfeil innenfor hver genotype og eksperimentell tilstand kohort. Gjennomføre enveis ANOVA og multiple sammenligninger post-hoc analyse for å fastslå om det er en effekt av behandlingen og genotype på antall vellykkede forsøk og antall footslips.
4. Akselerer Rotarod
- Akklimatisere fag til analyserommet 10 min før starten av rettssaken. I løpet av denne akklimatiseringsperiode, forberede rotarod apparatet, rengjøring hvert kjørefelt av apparatet med 30% etanol.
- Åpne rotarod programvare og satt starte innstillinger til 4 rpm og akselerasjon innstillinger til 5 min og endelig hastighetsinnstillinger 40 rpm. Disse innstillingene gir en konstant akselerasjon 4-40 rpm i en periode på 5 min. Mus kan forbli på rotarod ved 40 rpm i ytterligere 5 min utover akselerasjonsperioden for en maksimal løpelengde på 10 min.
- Post-akklimatisering, sted fag onfor det rotarod i deres respektive baner, mens stangen roterer med fire omdreininger pr. Når alle fag er i sine respektive baner, begynner den første rettssaken. Spill ventetid for å falle ved hjelp av instrumentet programvare; en sekundær tidsur kan benyttes som en backup.
- Etter rettssaken er ferdig, la hver gjenstand til hvile i sine respektive kjørefelt reservoarer i ti minutter før neste prøve å forhindre trøtthet.
- Gjenta trinn 4,3 og 4,4 for en total av fire forsøk.
- Gjenta trinn 04.03 til 04.05 for totalt fire påfølgende dager, fortsatt behandling gjennom hele prøveperioden. Ved ferdigstillelse, kvantifisere ventetid for å falle av roterende stang for hvert forsøk per gjenstand 6.
5. Cerebellar Utvinning og Fiksering
- Avlive mus via karbondioksid kvelning i henhold til institusjonelle IACUC retningslinjer. Plasser emne inn i karbondioksid kammeret, og frigjør karbondioksid inn i kammeret. Sedyret til enhver tid under euthanizing trinnet og ikke la dyret uten tilsyn.
- Når pusten opphører og fag viser ingen resterende smerte oppfatning av bakfot trykket ved å ta fag fra kammeret og gjøre en overlegen midtlinjen snitt gjennom epitelvev fra midten av skallen caudally til bunnen av skallen gjennom epitelvev.
- Ved hjelp av disseksjon saks, klippe skallen fra basen på ryggmargen gjennom sagittal sutur til bregma. Skjær sideveis gjennom hver koronale sutur før trekking av de frontale, parietal og interparietal bein med butte pinsett.
- Bruk butte pinsett til å bryte av bein lateral til lillehjernen. Bruk pinsett for å skille lillehjernen fra colliculi og hjernestammen og ekstrudere den fra resten av vevet. Separer lillehjernen til venstre og høyre hjernehalvdel med tang.
- Umiddelbart riktig cerebelli i flytende nitrogen til å spare til HPLC analyse og venstre cerebelli inn i pre-avkjølt 4% paraformaldehyde (PFA) for vev fiksering. Høste alle andre vev av interesse før kuttet aorta og forkaster den skrotten i henhold til institusjonelle IACUC regler.
FORSIKTIG: PFA er et svært giftig, brannfarlig, og etsende. - Tjuefire timer etter ekstraksjon, vask vev fiksert i PFA (4% i PBS) i fosfatbufret saltvann (PBS) (tre ganger, 5 min / vask) før plassering av vevet inn i 30% sukrose ved 4 ° C i opptil 2 uker.
6. immunpatologi analyse
- Fest slangen av en slede mikrotom til en kran, vask og en temperatur kontrollboksen. Bruk temperaturkontrollboksen for å kjøle mikrotomen scenen til -25 ° C. Sett snittetykkelsen hjulet til 50 mikrometer.
MERK: Hvis hjulet på sleden mikrotom ikke når 50 mikrometer, sett hjulet til en tynnere innstilling og multiplisere tykkelsen av skiftende innstillingen tilsvarende (for eksempel sette dIal til 10 um og skift fem ganger før seksjonering for en total tykkelse på 50 um). - DAB en krone-størrelse del av Optimal temperatur Cutting (OTC) løsning på scenen. Før OTC fryser Bruk pinsett til å plassere halvkule, slik at midten av sagittal snittflaten vender ned på OTC laget. Arbeid raskt, forsiktig orientere vev med tang slik at den laterale tuppen av halvkule peker mot bladet, overlegen til scenen. La OTC å fryse helt.
- Jobbe i lag, legge til ekstra OTC rundt vevet slik at OTC å fryse helt før du legger neste lag. Legg et tynt lag av OTC på toppen av vev og fryse.
- § vevet, distribusjon lik kroppsvekt på knivbladet mens seksjonering. Samle deler ved hjelp av en kunstner pensel og plass til en hensiktsmessig merket godt plate som inneholder 1x PBS. Mellom seksjonene, re-settes kutte tykkelse påslede mikrotom dial, om nødvendig, til 50 mikrometer.
- Erstatte PBS i hver brønn i brønn-plate med ureaoppløsning [0,01 M urea i PBS] og plassere platen på is. Når du er klar, fjerne platen fra isen og koke delene urea løsning tre ganger i 15 s hver gang for å avdekke epitoper for immunolabeling. Dette trinnet kan enkelt gjøres ved å plassere platen på en varmeblokk satt til koketemperatur. Mellom hver kokende trinn, kjøle plate som inneholder vevssnitt på is.
MERK: Hvis utfører urea, blokkering, primært antistoff, sekundært antistoff og DAPI trinn i en 96-brønners plate ved å bruke 100 ul volumer hele. Hvis en annen størrelse godt brukes, justere reagensvolumene tilsvarende. I stedet for en varmeblokk, kan en mikrobølgeovn brukes til å koke vevsprøver i urea. Mikrobølgeovn prøver på et høyt effekttrinn for tre 15 s intervaller. - Post koking, vaske seksjoner tre ganger, hver gang fjerne dagens løsning, erstatte løsningenmed 1 x PBS og omrøring i 10 min.
- Blokkseksjoner med esel serum-løsning (3% normalt esel serum, 0,3% triton X-100 i PBS) ved inkubering av vevet i serum i en time med forsiktig omrøring ved romtemperatur. Fjern esel serum løsning.
- Merk seksjoner med 0,2 ug / mL anti-calbindin og 1: 2000 anti-ataxin-1-antistoff (11NQ) 16 i esel serumløsning og inkuber ved 4 ° C i 72 timer med forsiktig omrøring.
- Vask seksjoner med PBS som i trinn 6.5 før inkubasjon seksjoner i passende sekundært antistoff (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-geit og 1: 500 Alexa Fluor-594-anti-kanin-antistoffer fortynnet i esel serum-løsning) ved 4 ° C i 48 timer med forsiktig omrøring.
- Vask seksjoner tre ganger med PBS som i trinn 6.5 før merking av cellekjerner med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) oppløsning fortynnet til en endelig konsentrasjon på 0,5 ug / mL, i PBS. DAPI inkubasjon bør ikke overstige ti minutter. Fjern løsning;n og vask med PBS som i trinn 6.5.
- Mount vev på 2% gelatin-belagt lysbilder med monteringsmedium for å redusere fotobleking. Dekkglass og forsegle med neglelakk.
- Med en skanning konfokalmikroskop finne den primære sprekken av lillehjernen i henhold lysfelt lys. Med en 10X UIS2 objektiv, skanne og sekvensielt opphisse DAPI, AlexaFluor-488 og AlexaFluor-594 kanaler som bruker en 405 nm diode laser, en 488 nm argon laser og en 559 nm diode laser, henholdsvis i forbindelse med en DM488 / 559 nm dichroic stråledeler. Separat og samle slippes ut lys ved hjelp SDM490 og SDM560 stråledelere og et BA575-675 båndpassfilter, henholdsvis.
- For hver kanal, konstruere en z-stack i primær sprekken med z = 20 mikrometer og trinn = 0,1 mikrometer. Bruk post-prosessering programvare som leveres med konfokal mikroskop for å legge i en størrelsesmarkør til det endelige bildet.
MERK: Alternative lasere, filtre og fluoroforer kan erstattes på grunnlag av availability. Hvis AlexaFluor-488 eller AlexaFluor-594 påvisning er svak, kan en gallium phosphide (Gaasp) med høy følsomhet detektor brukes til å forsterke signalet hvis tilgjengelig.
- For hver kanal, konstruere en z-stack i primær sprekken med z = 20 mikrometer og trinn = 0,1 mikrometer. Bruk post-prosessering programvare som leveres med konfokal mikroskop for å legge i en størrelsesmarkør til det endelige bildet.
7. Kvantifisering Molecular lagtykkelse og Purkinje Cell Numbers
- Bruke ImageJ, åpne en z-stack bilde av farget primær sprekken og dele hvert bilde i sine røde, blå og grønne kanaler ved å velge «image» fra menylinjen, "Color" fra kategorien Bilde og 'Split Channels' fra Color fanen.
- Lag en maks Z projeksjon av hver kanal som ble delt. Når kanalen bilde av interesse er åpen, velger du "Bilde" fra menylinjen, '§§' fra bildet fanen og "Z-prosjekt" fra "Profiler" -kategorien. Innenfor 'Z-prosjektet' kommandomenyen, velg "Max Z projeksjon" og klikk "OK". Gjenta for hver kanal.
- Åpne celleteller plugin ved å velge 'Plugins' fra the menylinjen, "Analyser fra fanen Plugins og" celleteller "fra kategorien Analyser.
MERK: ImageJ og ImageJ Cell Counter plugin kan lastes ned på nettsidene gitt i tabell av materialer og utstyr. - Kvantifisere antallet av Purkinje-celler ved å telle ataxin-en-merkede kjerner som ligger langs en forhåndsbestemt 200 um strekning av fremre og bakre lengder av den primære fissur. Bruk kartet terskelen ved å velge "Bilde" fra menylinjen, 'Juster' fra Bilde-kategorien og "Threshold" fra Juster kategorien for å gjøre en terskel kart over kanal av interesse (rød i tilfelle av ataxin-en merket kjerner ).
- Velg en piksel område som kan normaliseres gjennom kvantifisering (31-225 piksler for eksempel). Kast støy fra bilder ved å sjekke "Mørk bakgrunn" boksen i Threshold vinduet. Bilde signal kan inverteres for å lette telling.
- Kvantifisere molekylære lag thickness i den grønne kanalen ved hjelp av 'Split Channels "og" Threshold kart "verktøy som i trinn 7.1 og 7.2. Bruke størrelse markør på hvert bilde som en guide, tilfeldig måle tre molekylære lag lengder innenfor hver av to utpekte 200 mikrometer strekninger av hver primær sprekken bilde. Foreta målinger fra den proksimale enden av Purkinje dendrittiske akselen ved bunnen av Purkinje soma til den distale ende av Purkinje dendrittiske Arbor.
- Record Purkinje celletall og molekylær tykkelse som middel pluss eller minus standard feil. Utføre en-veis ANOVA med multiple sammenligninger post-hoc-analyse for å teste effekten av behandlingsbetingelsene eller genotype av antall celler og lengden av dendrittiske Arbor.
8. HPLC Analyse av Cerebellar ravsyre Konsentrasjoner Post-behandling
- Fremstilling av prøve for analyse
- Vei hvert høstet rett lillehjernen halvkule førbruk i HPLC-analyse. Hakke halvkuleformede halvdeler én om gangen i en på forhånd avkjølt Dounce-homogenisator og tilsett 0,5 ml av 75:25 (volum) vann: metanol-oppløsning til hver homogenisert halvdel 17.
- Ved hjelp av en smal pre-kjølt homogenisator, grovt bryte opp vev med 5 Dounce slag. Fortsett til fint hakke hver vevsprøve med en bredere homogenisator, bruke 20 Dounce slag.
- Overfør homogenater til pre-avkjølt mikrosentrifugerør. Etter at hver prøve, skyll homogenisatoren med 0,5 ml iskaldt vann: metanol-oppløsning og tilsett skylle til mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger homogenatet prøvene ved 1300 xg i 30 min ved 25 ° C og samle supernatanten i en ren mikrosentrifugerør.
- Filter supernatanten gjennom en sentrifugal filterenhet plassert med en regenerert cellulose filter på 10 kDa (KDA) nominell molekylvektgrense. Hvis ikke umiddelbart kjører HPLC-analyse, lagre filtrerte prøvene ved -80 °C.
- HPLC Instrumentering og betingelser
- Fest et ione-kromatografi-kolonne med en lengde på minst 30 cm og en partikkelstørrelse på 7 um til en væskekromatografi.
- Fremstille og avgassing en tilstrekkelig mengde av 1 mM acetatbuffer justert til en pH-verdi på 5.
- Still HPLC med en mobilfasehastighet på 0,8 ml / min. Hvis du bruker et UV-vis detektor, velg en detektor bølgelengde på 224 nm. Typiske Elueringstidene for ravsyre under disse betingelser er mellom 10 og 12 min.
- Kjøre og analysere standarder og prøver
- Forbered et sett av standarder i acetat buffer mobilfase med ravsyreforbindelser konsentrasjoner mellom 0 og 250 ppm.
- Kjør hver standard og forberede en kalibreringskurve med toppareal målt fra hvert løp.
- Når en nøyaktig standardkurve blir oppnådd, drives tidligere fremstilte prøver fortynnet i acetatbuffer.For større nøyaktighet av målingen, kan prøvene bli tilsatt kjente konsentrasjoner av ravsyre som har blitt fortynnet i den mobile fasen. Kjør alle prøvene i tre eksemplarer.
- Analyser HPLC kromatogrammer for å bestemme ravsyre konsentrasjonen av prøvene ved hjelp av kalibreringskurven, og deretter multiplisere med prøvevolum og dividere med opprinnelige prøve masse.
9. Ex Vivo Analyse av Cerebellar Mitokondrie funksjonalitet ved hjelp av en oksygenelektrode kontrollenhet
- Skape en Clark-elektrode ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system ved først å påføre en dråpe av kaliumklorid (50% KCl w / v) løsning på platina katoden, kutte en 1,5 cm to stykke kommersiell tobakkssigarettpapir og forsiktig å plassere papiret platina katoden.
- Dekk til katoden og rundt anoden med en 2,5 cm 2 stykke polytetrafluoretylen (PTFE) papir og snuggly sikre både medlRanes med O-ringer, og pass på at det ikke er noen folder eller bobler i membranene. Drypp 50% KCl-oppløsning inn i det omliggende brønn.
- Fest forhåndslagde elektroden i analysen kammer og fylle med luftmettet vann. Varm opp kammeret til 30 ° C, tilsett en 0,8 cm rørestav til oppløsningen og omrørt ved 70 rpm ved bruk av instrumentet programvare. Kalibrer kammeret ved å etablere null oksygen. For å gjøre dette, serielt legge noen krystaller av reduksjonsmiddel natriumditionitt til løsningen.
- Én gang kalibrering er oppnådd, vaskes kammeret en gang med 70% etanol, og vaskes deretter seks ganger med deionisert vann før slik at kammeret for å akklimatisere seg i 1,5 ml av respirasjon buffer (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2PO 4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
MERK: alle spor av natriumditionitt må fjernes fullstendig under vasketrinnet før du prøver å målekonsentrasjoner oksygen under respirasjon eksperimenter.
- Én gang kalibrering er oppnådd, vaskes kammeret en gang med 70% etanol, og vaskes deretter seks ganger med deionisert vann før slik at kammeret for å akklimatisere seg i 1,5 ml av respirasjon buffer (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2PO 4, 0,5 mM Na2EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
- Forsiktig homogen suspenderte cerebellare halvkuler i 0,5 mL homogenat buffer (0,25 M sukrose, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Overfør homogenat til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør og hold kjølt inntil begynner med analysen.
- Legg homogenatet til kammeret, og nådde en sluttvolum på 2 ml. Permeabilize cerebellar homogenatet ved å tilsette 40 ul av digitonin eller saponin (5 mg / ml); tillate homogenisert vev for å inkubere i 10 min.
MERK: Digitonin og saponin er giftige, og inkubasjonstidene bør holdes på et minimum. - Til å begynne innspillingen oksygenforbruk, bestemme mitokondrienes funksjon gjennom aktivering og hemming av oksidativ fosforylering kjeden ved hjelp av substrater og hemmere, henholdsvis (3 min opptak per substrat).
- Legg substrater ved hjelp av rene sprøyter som følger: 10 ul 2 M glutamat [endelig konsentrasjon (fc) 0,01 M],5 ul 0,8 M malat [fc 2 mM], 20 ul 0,5 M adenosin-difosfat (ADP) [fc 5 mM], 1 pl 1 mM rotenon [fc 0,5 uM], 20 ul 1 M ravsyre [10 mM], 1 ul 5 mM antimycin A [fc 2,5 uM], 1 ul 0,8 M askorbat [fc 0,4 mM], og 5 ul 0,2 M tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] Når du legger underlag til kammeret være forsiktig med å innføre luftbobler inn i systemet.
MERK: Detaljert informasjon om den funksjonelle effekten indusert av hvert substrat og hemmer er beskrevet i en tidligere utgitt protokoll 7. Individuell dose-respons-kurver kan trenge å bli generert for å bestemme optimale konsentrasjoner av de substrater og inhibitorer i preparater / vev / arter som ikke tidligere er studert. Likeledes kan protokollen være optimalisert for medfødte metabolisme tendenser i vev / art blir studert, for eksempel substrat preferanser.
- Legg substrater ved hjelp av rene sprøyter som følger: 10 ul 2 M glutamat [endelig konsentrasjon (fc) 0,01 M],5 ul 0,8 M malat [fc 2 mM], 20 ul 0,5 M adenosin-difosfat (ADP) [fc 5 mM], 1 pl 1 mM rotenon [fc 0,5 uM], 20 ul 1 M ravsyre [10 mM], 1 ul 5 mM antimycin A [fc 2,5 uM], 1 ul 0,8 M askorbat [fc 0,4 mM], og 5 ul 0,2 M tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] Når du legger underlag til kammeret være forsiktig med å innføre luftbobler inn i systemet.
- Når datainnsamlingen er ferdig, forsiktig enspirate de cerebellare homogenatene og rense kammeret med etanol og avionisert vann. Når rent, men ytterligere cerebellare Homogenatprøvene kan kjøres uten ytterligere kalibrering så lenge den PTFE-membran forblir intakt. Etter ferdigstillelse, ren elektroden med deionisert vann og etanol og lagre med silikagel eller tørkemiddel.
MERK: Mellom samme dag løper, fylle kammeret med avionisert vann slik at membranen ikke tørker ut. - Bruke datablad laget av instrumentets programvare, eksportere 40 min av respirasjon data begynner to minutter etter underlaget tillegg til et regnearkprogram.
- Beregn frekvensen av åndedrett per substrat eller hemmer. Normal data ved å dele den totale åndedrett ved respirasjon under askorbat-TMPD underlaget tillegg.
MERK: respirasjonshastigheten kan være ytterligere normalisert til proteininnholdet i vevet, som kan være spesielt ønskelig i neurodegenerering eksperimenterder vev innholdet kan variere. For å gjøre dette, forbeholder 50 ul av prøven homogenat (fra trinn 9.3) til bruk i en standard proteinanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennom farmakologiske målretting av lillehjernen mitokondrier med ravsyre er vi i stand til å hindre mitokondriell dysfunksjon i en musemodell av lillehjernen nevrodegenerativ sykdom SCA1. Den kanoniske elektrondonor av succinatdehydrogenase, ravsyre, ble oppløst i hjemmeburet drikkevann av SCA1 mus for en måned, med atferdsvurdering begynnelsen under den andre uken av behandlingen og nevropatologiske vurdering etter behandling (figur 1A). Ravsyre behandling 22 forbedrer ytelsen av SCA1 mus målt ved fotavtrykk assay, bjelke-analyse og akselerer rotarod assay. Den atferdsmessige forbedringer oppdaget indikerer økt motorisk koordinasjon og motorisk læring (Figur 1B-D).
Redningen av atferds ytelse ble funnet på konsert med en bevaring av cerebellar vev (figur 2). Suksinsyre behandling betydelig bevart Purkinje celle organer og økt molekylær tykkelse (tegn på Purkinje celle dendrittiske arbor forlengelse) i lillehjernen primære sprekken i behandlede SCA1 mus sammenlignet med ubehandlede SCA1 mus. Purkinje celle dendrittiske lengde og Purkinje celle kroppen teller gi sterke tiltak av generell lille cytoarchitecture 5.
HPLC ble utført på cerebellar vev fra behandlede mus til å bekrefte at ravsyre oppløst i buret drikkevannet vellykket krysset blod-hjernebarrieren og som gjennomtrenges lillehjernen vev. En doseresponskurve variere lengden av behandlingen lenger støtter ad libitum behandling av ravsyre som en levedyktig måte å nå lillehjernen vev (figur 3A-B). Våre respirasjon eksperimenter pågående og våre resultater vil bli publisert i en forskningsmanuskript. Her viser vi at vi lykkes kan ta opp frekvensen av åndedrett gjennom lillehjernen oksidativ fosforylering komplekser ved tilsetning av varierende elektrontransportkjeden substrater og hemmere (Figur 3C). Til syvende og sist, vil vi bruke åndedrett analysen vise oksidativ fosforylering underskudd i SCA1 mus lillehjernen og tilbakeføring av disse underskudd av ravsyre behandling.
Figur 1: Behandling Scheme og representative data fra Footprint analysen, Beam-analysen og Akselerer Rotarod. (A) Ravsyre ble oppløst i hjemmeburet drikkevann av SCA1 mus i fire uker, begynnende ved 17 ukers alder. SCA1 musene begynner å vise ataksi fenotypen ved 5 ukers alder. Ikke vist i den skjematiske er tre kontrollkullene: ravsyreforbindelser-behandlede villtype-mus, vekjøretøyet behandlet SCA1 mus og kjøretøy-behandlede villtype mus. Atferdsvurderingene ble gjennomført i løpet av behandlingsperioden som følger: fotavtrykk analysen i uke 17, bjelke analyse i løpet av uke 18 og akselerer rotarod i uke 19. Ved 20 ukers alder, ble musene avlivet og lillehjernen vev ble høstet for immunpatologi analyser, HPLC-analyser og respirasjon analyser. (B) Representative data fra fotavtrykk analysen viser et kjøretøy behandlede hvete gangart (øverst), kjøretøy behandlet SCA1 gangart (i midten) og en ravsyre behandlet SCA1 gangart (nederst). (C) Beam analysedata som viser forbedring i bjelke ytelse (målt som antall forsøk for en vellykket kjøring) av SCA1 mus med ravsyre behandling. (* P <0,05). (D) Suksinsyre behandling forbedrer betydelig akselerer rotarod ytelsen SCA1 22 mus som vist ved økt ventetid for å falle (* p <0,05). Feilfelt i CD respeile standard feil av gjennomsnittet. Betydning ble bestemt ved enveis ANOVA og multiple sammenligninger post-hoc analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative data fra Purkinje celletall og molekylær lagtykkelse immunpatologi analyser. (A) Representative resultater fra Purkinje celler analysen viser et kjøretøy-behandlet kontroll transgen lillehjernen primære sprekken (øverst), kjøretøy behandlet SCA1 lillehjernen primære sprekken (i midten) og en ravsyre behandlet SCA1 lillehjernen primære sprekken (nederst) farget for ATXN1-positive kjerner (rød) og kontra med DAPI (blå). Hvite linjer skildre de 200 mikrometer regioner av vevutpekt for celletall. For denne analysen, en kontroll transgen mus over-uttrykker et ikke-patogent ATXN1 genet under kontroll av en Purkinje celle-spesifikk promoter ble anvendt i stedet for en villtype mus fordi de transgene kontrollfunksjoner lett påvisbare nivåer av atom Purkinje ATXN1 og villtype-mus gjør ikke. Kontrollen transgen mus ikke viser noe ataxic fenotype eller lillehjernen nevrodegenerasjon. (B) Representative resultater fra den molekylære tykkelse analysen viser et kjøretøy behandlet hvete lillehjernen primære sprekken (øverst), kjøretøy behandlet SCA1 lillehjernen primære sprekken (i midten) og en ravsyre behandlet SCA1 lillehjernen primære sprekken (nederst) farget for calbindin en markør for Purkinje-celler (hvit). To av de tre lillehjernen cellelagene kan visualiseres med calbindin. Den midterste Purkinje celle lag (bestående av Purkinje celle organer) er synlig sammen med den ytterste molekylære lag (bestående av Purkinje cell dendritter). Den molekylære lag vises i midten av det primære rennen på grunn av den naturlige folder av vevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative Resultater fra HPLC og respirasjon analyser. (A) standardkurve for kjente konsentrasjoner opp til 250 ppm ravsyre fortynnet i acetatbuffer og plottet mot området under den målte HPLC-topp. Ligningen for linjen ble anvendt for å beregne ukjente ravsyreforbindelser konsentrasjoner fra behandlede vevsprøver. (B) Representative doserespons ravsyreforbindelser topper fra mus cerebellar vev etter forskjellige tider av behandling (enten 0, 1 eller 5 uker). Under de betingelserbeskrevet, ravsyre typisk eluerte mellom 10 og 12 min. (C) Representant åndedrett løp fra bilen behandlet villtype mus lillehjernen vev. Den blå linje viser endringen i oksygenkonsentrasjonen, den stiplede røde linjen viser endringen i respirasjonshastigheten og det faste røde linje viser en glattet versjon av den stiplede linjen. D = tilsetning av digitonin, G / M = tilsetning av glutamat / malat, A = tilsetning av ADP, R = tilsetning av rotenon, S = tilsetning av ravsyre, AA = tilsetning av antimycin A og A / T = tilsetning av Asc / TMPD. Alle substratene ble tilsatt på de tidspunkter som er vist i figuren og i de konsentrasjoner som er beskrevet i protokollen (trinn 9.5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hvis disse metodene brukes som beskrevet, er de i stand til å detektere og å lindre oksidativ fosforylering-mediert mitokondriell dysfunksjon i lillehjernen neurodegenerative sykdom muse-modeller. De kombinerte biokjemiske og atferdsmessige analyser er mangfoldige fremgangsmåter for å bestemme omfanget av mitokondriell bidrag til cerebellar nevrodegenerativ sykdom patologi. Ved å behandle mus med ravsyre å stimulere stoffskiftet og øke mitokondriefunksjon, er vi i stand til å vise en redning av lillehjernen atferds underskudd og lillehjernen degenerasjon.
Metodikken presentert her kan brukes til å teste et bredt spekter av vannoppløselige metabolisk målrettet forbindelser for potensiell behandling av lillehjernen nevrodegenerativ sykdom. Ravsyre er lett oppløselig i vann ved 0,75 mg / ml, som gir mulighet for enkel levering via buret drikkevann og som ikke nødvendiggjør oppretting av supplert mat pellets. Andre vannløseligForbindelsene kan lett erstattes i protokollen. Ved bruk av metabolsk målrettet forbindelser som ikke er vannløselige, kan om fremgangsmåten lett tilpasses for behandling med supplert pellets 11, 12. Ved testing av en ny forbindelse, er det viktig å kontrollere cerebellar penetrering av medikamentet før oppstart av behandlingen via HPLC-analyse eller annen passende påvisningsmetoden.
Batteriet av patologisk vurdering ble valgt på grunn av deres rapporterte virkning ved å påvise cerebellare nevrodegenerative patologier. De fotavtrykk analysen, blir strålen analysen og rotarod assay mye brukt vurdering av cerebellar nevrodegenerativ sykdom inkludert ulike SCAS, og Friedreichs ataksi 6, 23, 24. Disse spesielle atferdsvurderingene sterkt korrelert med lillehjernen degenerasjon. Men andre behavioral paradigmer kan erstattes eller legges til etter behov.
Merkingen av Purkinje-celler i SCA1 mus med ataxin-1 og calbindin er mye brukt for å detektere cerebellar degenerasjon i SCA1 modeller 5, 20, 21. Annen neuronal-selektive antistoffer og vev regioner kan anvendes for å visualisere reduksjon av nevrodegenerasjon etter behov.
Respirasjon analyse er et kraftig verktøy for spesifikk påvisning av dysfunksjon eller reparasjon innenfor den enkelte mitokondrielle komplekser fra lillehjernen vev. Forsiktighet bør utvises for å minimalisere tiden mellom høsting av vev og kjører analysen for å oppnå reproduserbare resultater. Dessuten er det viktig å være oppmerksom på homogeniteten av vevet som blir analysert. Spesielt lillehjernen vev består overveiende av granule nevroner som ikke uttrykker den SCA1 transgenet i vår modell. Derfor er et kritisk trinn i denneProtokollen er å bestemme om hele cerebellar åndedrett er en levedyktig metode for påvisning av oksydativ kompleks funksjon. Respirasjon endringer i den transgene SCA1 musehjernen kan være subtile og kan kreve økt antall pasienter for å oppnå statistisk signifikante resultater.
Kombinasjonen av atferdsmessige og nevropatologiske metoder som er beskrevet i denne protokollen gir distinkte kvantifisering av SCA1 sykdom og kan robust detektere forbedring etter behandling med vannløselige forbindelser. Betydningen av denne protokollen er i sin tilpasningsdyktighet til ulike behandlinger og et variert utvalg av musemodeller. Dessuten trenger mange av teknikkene som brukes i denne protokollen ikke krever dyrt utstyr eller kompliserte teknikker og er derfor egnet for en lavere forskning setting. Fremtidige anvendelser av denne protokollen blir brukt for å vurdere graden av behandlingseffekten ved aldersavhengig levering av forbindelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
