Abstract
La disfunzione mitocondriale svolge un ruolo significativo nel processo di invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative tra cui diversi atassie ereditarie spinocerebellari e di altri disturbi del movimento segnato da una progressiva degenerazione del cervelletto. L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la disfunzione mitocondriale in atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) e valutare l'efficacia del targeting farmacologica della respirazione metabolica attraverso l'acido succinico composto idrosolubile per rallentare la progressione della malattia. Questo approccio è applicabile ad altre malattie cerebellari e può essere adattato ad una serie di terapie idrosolubili.
Ex vivo l'analisi della respirazione mitocondriale viene utilizzata per rilevare e quantificare i cambiamenti correlati alla malattia in funzione mitocondriale. Con prove genetiche (dati non pubblicati) e la prova proteomica di disfunzione mitocondriale nel modello SCA1 del mouse, si valuta l'efficacia del trattamento con l'solubile in acqua metabolica richiamo sL'acido uccinic sciogliendo questo composto direttamente in acqua potabile gabbia casa. La capacità del farmaco di passare la barriera emato-encefalica può essere dedotta mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). L'efficacia di questi composti può quindi essere testato l'utilizzo di più paradigmi comportamentali tra cui il rotarod accelerazione, prova trave e analisi impronta. integrità Cytoarchitectural del cervelletto può essere valutata mediante saggi di immunofluorescenza che rilevano nuclei delle cellule di Purkinje e dendriti delle cellule di Purkinje e soma. Questi metodi sono tecniche robuste per determinare la disfunzione mitocondriale e l'efficacia del trattamento con composti solubili in acqua in malattia neurodegenerativa cerebellare.
Introduction
I mitocondri sono i principali produttori di adenosina trifosfato (ATP), un coenzima essenziale per energia cellulare, con la maggioranza di ATP mitocondriale prodotto mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS) utilizzando la catena di trasporto degli elettroni. Il cervello, dato le sue alte richieste metaboliche e la sua dipendenza da fosforilazione ossidativa per alimentare l'attività neurale, è altamente sensibile alla disfunzione mitocondriale. Come risultato, disfunzione mitocondriale viene attivato durante il processo di invecchiamento 1 ed è implicato nella patogenesi di molteplici patologie neurodegenerative 2, 3, 4. Pertanto, ne consegue che i mitocondri sono bersagli terapeutici interessanti per neurodegenerazione.
In questo protocollo, abbiamo adottato l'uso di atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) come una malattia neurodegenerativa modello per lo studio dei mitocondril erettile e lo sviluppo di terapie mitocondriali mirati. SCA1 è causata da una mutazione polyglutamine (polyQ) repeat espansione nel prodotto del gene atassina-1 che innesca progressiva degenerazione dei neuroni di Purkinje del cervelletto e neuroni di altre regioni del cervello. La linea di topo transgenico qui utilizzato (designato come il mouse SCA1), che esprime una polyQ-mutante ataxin-1 transgene sotto il controllo di un promotore specifico Purkinje cellule, permette l'analisi mirata della componente Purkinje cellule di SCA1 5. I topi sottoposti a SCA1 graduale degenerazione delle cellule di Purkinje e sviluppare andatura atassica 6.
La disfunzione mitocondriale complesso e l'efficacia del trattamento mitocondriale mirati possono essere valutati con una batteria di saggi molecolari e comportamentali. La disfunzione mitocondriale complesso è misurata ex vivo mediante saggi di respirazione che consentono di rilevare il consumo di ossigeno alterata all'interno del tessuto cerebellare inla presenza di substrati catena di trasporto degli elettroni e inibitori 7. Test di respirazione sono stati precedentemente usato con il tessuto permeabilizzate, isolati mitocondriali, e tutto il tessuto 7, 8, 9. Essi consentono per la valutazione diretta della funzione mitocondriale a differenza di metodi di raccolta dei dati morfologici, come la microscopia elettronica a trasmissione o immunofluorescenza. L'uso di tutto il tessuto piuttosto che mitocondri isolati impedisce selezione di parte dei mitocondri sani che si possono verificare durante il processo di isolamento 7. Adattate al protocollo, come illustrato, il saggio la respirazione è un metodo prezioso per rilevare la disfunzione mitocondriale in cerebellari stati di malattia neurodegenerative.
attivatori non specifici del metabolismo possono essere usati per dedurre disfunzione mitocondriale in modelli di topi transgenici di diseas neurodegenerativeee aiutare lo sviluppo di nuove terapie. Quercetina, coenzima Q10 e creatina sono stati tutti in grado di migliorare la patologia malattia neurodegenerativa in pazienti e in modelli animali di malattia neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Qui vi presentiamo un attivatore metabolico romanzo, acido succinico, per stimolare il metabolismo e aumentare la funzione mitocondriale nella malattia neurodegenerativa. Per assicurarsi che l'attivatore attraversa la barriera ematoencefalica, HPLC è stato impiegato per rilevare consegna al tessuto neurale nei topi trattati 17.
Per valutare gli effetti terapeutici dei composti idrosolubili metabolicamente mirata come acido succinico, una batteria di paradigmi comportamentali e studi immunopatologici può essere utilizzato. due per i deficit di coordinazione motoria trovati nelle malattie neurodegenerative cerebellare, il test della pista impronta, test del fascio e il dosaggio verga rotazione accelerando vengono utilizzati per rilevare salvataggio di patologia comportamentale 6, 18, 19. Queste misure sono integrate con la valutazione immunopatologico di citoarchitettura cerebellare valutando lo spessore molecolare strato (definito come Purkinje dendritica delle cellule lunghezza pergolato) e Purkinje conta soma celle all'interno di un lobulo definito di tessuto cerebellare 6, 20, 21. Qui vi presentiamo diversi metodi neuropatologici e comportamentali per il rilevamento e il trattamento della disfunzione mitocondriale con composti solubili in acqua metabolicamente mirato.
Usiamo ex vivo l'analisi della respirazione mitocondriale per analizzare disfunzione mitocondriale nel tran SCA1il mouse sgenic. Inoltre, abbiamo dimostrato che i sintomi della malattia e la patologia sono migliorate l'acido succinico richiamo mitocondriale solubile in acqua, implicando ulteriori disfunzione mitocondriale nella progressione della malattia SCA1.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida IACUC a Skidmore College di per lavorare con i topi.
1. Il trattamento con composti idrosolubili
- Sciogliere acido succinico ad una concentrazione di 0,75 mg / ml in acqua cage potabile. Si noti che qualsiasi composto idrosolubile di interesse alla concentrazione desiderata potrebbe essere sostituito in questa fase. Mescolare soluzione per assicurarsi che il composto sia completamente dissolto.
- Dopo topi raggiungono l'età desiderata del trattamento, sostituire l'acqua potabile gabbia a casa della condizione gruppo di trattamento con la soluzione al passo 1.1.
- Misurare il peso di entrambe trattamento e di controllo borracce gruppo giornalieri per garantire che entrambi trattati e topi di controllo sono bere la stessa quantità di acqua. Utilizzare queste misurazioni per calcolare il dosaggio totale del farmaco per gabbia. Continuare il trattamento per tutto l'esperimento e il monitor del peso della bottiglia.
2. Analisi Impronta
- Posizionare la pista sul pavimento oun tavolo in una stanza confinato. Impostare la pista con una leggera angolazione verso l'alto verso la scatola a casa rivestita con il cibo e biancheria da letto di ricompensa (ad esempio cereali zuccherati). Linea la lunghezza della pista con un foglio di carta bianca. Lasciare che il soggetto si adatti nel box di casa per 5 min.
- Rimuovere il soggetto dalla scatola a casa e dipingere zampe posteriori destro e sinistro, rispettivamente, con vernice a base d'acqua non tossico blu e rosso. Le stampe vernice saranno utilizzati per calcolare le misure comportamentali di uscita multipla.
- Posizionare il soggetto all'inizio della pista e consentire al soggetto di camminare alla casella casa. Una volta che il soggetto ha raggiunto la scatola a casa, chiudere la botola, e permettere al soggetto di rimanere all'interno della scatola a casa per un minuto prima di tornare alla rispettiva gabbia casa. Pulire la scatola della pista e la casa con il 30% di etanolo e sostituire la biancheria da letto, premiare il cibo, e la carta della pista per il prossimo soggetto.
- Quantificare il numero di passi, la larghezza della porta, angolo di passo, e il numero di giri presiper argomento secondo i metodi di analisi precedentemente descritte 6. Una prova impronta di successo è definito come un minimo di 5 impronte sequenziali in cui il soggetto è in cammino verso la casella obiettivo senza voltarsi o l'arresto.
3. Analisi del fascio
- Impostare Apparecchiatura fascio secondo le specifiche traversa precedentemente descritte 6 con i seguenti 6 travi: trave 1 = rettangolare, larghezza 28 millimetri; fascio 2 = rotonda, 28 mm di diametro; fascio 3 = rettangolare, larghezza 12 mm; fascio 4 = tondo, diametro 12 mm; fascio 5 = rettangolare, larghezza 6 mm; fascio 6 = rotonda, 6 mm di diametro. Ad una estremità della trave, ha istituito una scatola a casa buia con il cibo ricompensa.
- Formare soggetti sulla trave, montare l'apparecchio con il fascio 3. inserire delicatamente il soggetto sulla fine della trave opposta alla scatola a casa, e consentire al soggetto di attraversare. Consentire ogni soggetto fino a tre 2-numero minimo di prove per ottenere una corsa di successo, Definito come attraversare il fascio e inserendo la casella casa entro 2 min. Tra le prove, lasciare che il resto oggetto nella casella casa per 2 min. Tra i soggetti, pulire la scatola del fascio e la casa con il 30% di etanolo e sostituire il cibo ricompensa in preparazione per il prossimo soggetto.
- Ripetere il punto 3.2 una volta al giorno per i due giorni successivi con conseguente un totale di 3 giornate di formazione sequenziali. La giornata di test, il giorno 4, dovrebbe sequenza seguire le giornate di formazione.
- Per testare i soggetti in giorno 4, prima montare l'apparecchiatura con il fascio 1 e impostare la casella casa come descritto al punto 3.1. Posizionare una telecamera di fronte dell'apparecchiatura e verificare che l'apparato fascio completo può essere chiaramente catturato in video. Iniziare la registrazione e posizionare il primo soggetto sulla trave opposta alla casella di casa, che permette fino a 3 2-numero minimo di tentativi per completare con successo un processo. Tra le prove, consentire soggetto a riposo per 2 minuti nel box di casa.
- Continuare a testare soggetto su ciascuno dei sei travi in ordine numerico,permettendo al soggetto di riposo per 2 minuti nella casella casa prima di iniziare il fascio successivo. Tra i soggetti, pulire ogni trave e la scatola a casa con il 30% di etanolo e sostituire il cibo ricompensa in preparazione per ogni soggetto.
- Videotape ogni prova e registrare il numero di prove di successo per soggetto per fascio come segue: '1' indica il soggetto ha avuto successo al primo processo, '2' indica che il soggetto ha avuto successo sulla seconda prova, '3' indica il soggetto era successo il terzo ed ultimo processo, e '4' indica il soggetto non ha avuto successo in qualsiasi delle tre prove.
- Utilizzare registrazioni video di footslips prove di misura da marcatori che sono accecati alle condizioni sperimentali del soggetto. Definire un footslip come retropiede che è in visione diretta della immersione fotocamera sotto di una linea mediana teorica tutta la lunghezza della trave. punteggi medi footslip da più marcatori.
- Per analizzare il numero di sprove Uccessful e numero di dati footslips, calcolare la media e l'errore standard all'interno di ogni genotipo e sperimentale condizione di coorte. Condurre una via ANOVA e confronti multipli analisi post-hoc per determinare se vi è un effetto del trattamento e del genotipo sul numero di prove di successo e il numero di footslips.
4. Accelerare rotarod
- Acclimatare soggetti alla camera dosaggio 10 min prima dell'inizio della prova. Durante questo periodo di acclimatazione, predisporre l'apparecchiatura rotarod, pulizia ogni corsia del dispositivo con il 30% di etanolo.
- Aprire il software rotarod e impostare avviare le impostazioni a 4 giri al minuto, le impostazioni di accelerazione a 5 impostazioni min ed una velocità finale di 40 giri al minuto. Queste impostazioni forniscono un'accelerazione costante da 4 - 40 rpm in un periodo di 5 min. I topi possono rimanere sul rotarod a 40 rpm per altri 5 minuti oltre il periodo di accelerazione per una lunghezza massima corsa di 10 min.
- Post-acclimatazione, luogo soggetti onto rotarod nelle rispettive corsie mentre l'asta ruota a 4 rpm. Una volta che tutti i soggetti sono nelle rispettive corsie, inizierà la prima prova. Registrare la latenza a cadere utilizzando il software dello strumento; un temporizzatore secondario può essere impiegato come backup.
- A seguito del completamento di prova, consentire ad ogni soggetto a riposo nei rispettivi serbatoi di corsia per dieci minuti prima della prova successiva per evitare l'affaticamento.
- Ripetere le fasi 4.3 e 4.4 per un totale di quattro prove.
- Ripetere i punti 4.3 - 4.5 per un totale di quattro giorni consecutivi, continuare il trattamento durante il periodo di prova. Al termine, quantificare la latenza a cadere l'asta girevole per ogni prova al soggetto 6.
5. cerebellare Estrazione e fissaggio
- Euthanize topi via anidride carbonica per asfissia secondo le linee guida istituzionali IACUC. Posizionare soggetto nella camera di anidride carbonica, e sviluppare anidride carbonica nella camera. Orologiol'animale in qualsiasi momento durante la fase di eutanasia e non lasciare l'animale incustodito.
- Una volta che la respirazione è cessata e soggetti non mostrano alcun residuo percezione del dolore da pressione piede posteriore, rimuovere soggetto dalla camera e fare una incisione mediana superiore attraverso il tessuto epiteliale dalla metà del cranio caudale alla base del cranio attraverso il tessuto epiteliale.
- Utilizzando forbici dissezione, tagliare il cranio dalla base al midollo spinale attraverso la sutura sagittale al bregma. Tagliare lateralmente attraverso ogni sutura coronale prima di tirare fuori i frontali, parietali e interparietale ossa con pinze smussato.
- Utilizzare pinze smussato a rompere laterale osso al cervelletto. Utilizzare pinze per separare il cervelletto dal colliculi e tronco cerebrale ed estrudere dal resto del tessuto. Separare il cervelletto in emisferi destro e sinistro con una pinza.
- Porre immediatamente cervelletto destra in azoto liquido per salvare per HPLC analisi e cervelletto sinistra in pre-raffreddata 4% paraformaldeide (PFA) per il fissaggio del tessuto. Raccolto qualsiasi altro tessuto di interesse prima di recidere l'aorta e scartando la carcassa in base alle regole istituzionali IACUC.
ATTENZIONE: PFA è altamente tossico, infiammabile, e corrosivo. - Ventiquattro ore dopo estrazione, lavaggio tessuto fissato in PFA (4% in PBS) in tampone fosfato isotonico (PBS) (tre volte, 5 min / lavaggio) prima di posizionare il tessuto in saccarosio al 30% a 4 ° C fino a 2 settimane.
6. Immunopatologia Assay
- Collegare il tubo di un microtomo slitta di un rubinetto del lavandino e una scatola di controllo della temperatura. Utilizzare la casella di controllo della temperatura per raffreddare la fase microtomo a -25 ° C. Impostare la ghiera di spessore sezionamento a 50 micron.
NOTA: Se il quadrante sul microtomo slitta non raggiunge 50 micron, impostare il selettore su una cornice più sottile e moltiplicare lo spessore spostando l'impostazione di conseguenza (per esempio impostare la dIAL a 10 micron e spostare cinque volte prima di sezionamento per uno spessore totale di 50 micron). - Tamponare una porzione centesimo a grandezza naturale di Soluzione ottimale temperatura di taglio (OTC) sul palco. Prima della OTC si blocca, usare il forcipe per posizionare l'emisfero in modo che la superficie di taglio sagittale è a faccia in giù sul livello OTC. Lavorando in fretta, orientare delicatamente il tessuto con una pinza in modo che la punta laterale dell'emisfero è puntato verso la lama, superiore al palco. Lasciare che la OTC per congelare completamente.
- Lavorando in strati, aggiungere ulteriori OTC intorno al tessuto consentendo OTC di congelare completamente prima di aggiungere lo strato successivo. Aggiungere un sottile strato di OTC sopra del tessuto e congelare.
- Sezione tessuto, distribuendo parità di peso corporeo sulla lama di taglio mentre sezionamento. Raccogliere sezioni utilizzando un artista pennello e posto in un pozzo-plate adeguatamente etichettati contenente PBS 1x. Tra sezioni, re-impostare lo spessore di taglio sullaslitta quadrante microtomo, se necessario, a 50 micron.
- Sostituire il PBS in ciascun pozzetto della piastra a pozzetti con soluzione di urea [0,01 M urea in PBS] e posizionare la piastra su ghiaccio. Quando si è pronti, rimuovere la piastra da sezioni di ghiaccio e far bollire in una soluzione di urea tre volte per 15 s ogni volta per smascherare epitopi per immunomarcatura. Questo passaggio può essere facilmente realizzato collocando la piastra su un blocco di riscaldamento impostata all'ebollizione. Tra ogni passo bollente, raffreddare il piatto contenente le sezioni di tessuto su ghiaccio.
NOTA: Se si esegue l'urea, il blocco, l'anticorpo primario, anticorpo secondario e passaggi DAPI in una piastra a 96 pozzetti, utilizzare 100 volumi microlitri tutto. Se si utilizza un pozzo di dimensioni diverse, regolare i volumi di reagente di conseguenza. Al posto di un blocco di riscaldamento, un forno a microonde può essere usato per bollire campioni tissutali di urea. campioni a microonde su una regolazione per tre intervalli di 15 s ad alta potenza. - Messaggio di ebollizione, lavare sezioni tre volte, ogni volta rimozione presente soluzione, sostituendo la soluzionecon 1x PBS e agitare per 10 min.
- sezioni di blocco con soluzione asino siero (3% di siero normale asino, 0,3% triton X-100 in PBS) incubando tessuto siero per un'ora con agitazione a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di siero asino.
- Sezioni Label con 0,2 mg / ml di anti-calbindina e 1: 2.000 anti-atassina-1 anticorpi (11NQ) 16 in soluzione di siero asino e incubare a 4 ° C per 72 h con agitazione.
- Lavare sezioni con PBS come al punto 6.5 prima incubare sezioni anticorpo secondario appropriato (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-capra e 1: anticorpi 500 Alexa Fluor-594-anti-coniglio diluito in soluzione asino siero) a 4 ° C per 48 ore con agitazione.
- Lavare sezioni tre volte con PBS, come nel passaggio 6,5 prima nuclei cellulari etichettatura con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) soluzione diluita ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml in PBS. DAPI incubazione non deve superare i dieci minuti. rimuovere solution e lavare con PBS come al punto 6.5.
- tessuto monte sul 2% diapositive gelatina rivestite con mezzo di montaggio per ridurre photobleaching. Coprioggetto e sigillare con smalto.
- Con un microscopio confocale a scansione individuare la fessura primario del cervelletto sotto luce campo chiaro. Con un obiettivo 10X UIS2, scansione e sequenzialmente eccitare DAPI, AlexaFluor-488 e AlexaFluor-594 canali usando un laser a 405 nm diodo, un laser a gas argon 488 nm e un diodo laser 559 nm, rispettivamente, in combinazione con un DM488 / 559 nm beam splitter dicroico. Separata e raccogliere emessa luce utilizzando SDM490 e divisori di fascio SDM560 e un filtro passa-banda BA575-675, rispettivamente.
- Per ogni canale, la costruzione di un z-stack all'interno della fessura primaria con z = 20 micron e passo = 0,1 micron. Utilizzare il software di post-elaborazione fornito con il microscopio confocale di aggiungere un marcatore dimensioni per l'immagine finale.
NOTA: laser alternativi, filtri e fluorofori possono essere sostituiti in base alla disty. Se AlexaFluor-488 o AlexaFluor-594 di rilevazione è debole, un fosfuro di gallio (GaAsP) detector ad alta sensibilità può essere impiegato per amplificare il segnale, se disponibile.
- Per ogni canale, la costruzione di un z-stack all'interno della fessura primaria con z = 20 micron e passo = 0,1 micron. Utilizzare il software di post-elaborazione fornito con il microscopio confocale di aggiungere un marcatore dimensioni per l'immagine finale.
7. strato Quantificare molecolare spessore e di Purkinje numero di cellule
- Utilizzando ImageJ, aprire un'immagine z-pila di fessura primaria colorato e diviso ogni immagine nei suoi canali rosso, blu e verde selezionando 'Immagine' dalla barra dei menu, 'Colore' nella scheda Immagine e 'canali split' dal colore scheda.
- Creare una proiezione Z massima di ciascun canale che è stato diviso. Quando l'immagine del canale di interesse è aperta, selezionare 'Immagine' dalla barra dei menu, "Sezioni" dalla scheda Immagine e 'Z-progetto' dalla scheda 'sezioni'. All'interno del menu dei comandi 'Z-progetto', selezionare 'proiezione Max Z' e cliccare su 'OK'. Ripetere l'operazione per ogni canale.
- Aprire il plugin cellulare contatore selezionando 'Plugin' dal esimoe Barra dei menu, 'Analisi' dalla scheda Plug-in e "Cell Counter" dalla scheda Analizza.
NOTA: ImageJ e il plugin cellulare contatore ImageJ possono essere scaricati sui siti web forniti nella tabella di materiali ed attrezzature. - Quantificare il numero di cellule di Purkinje contando nuclei ataxin-1-marcato che si trovano lungo un 200 micron tratto predeterminato di lunghezze anteriore e posteriore del solco primario. Utilizza la mappa soglia selezionando 'Immagine' dalla barra dei menu, 'regolare' dalla scheda Immagine e 'Threshold' dalla scheda Adjust per fare una mappa della soglia del canale di interesse (rosso nel caso di nuclei ataxin-1 etichettata ).
- Scegli un intervallo di pixel che può essere normalizzata in tutta la quantificazione (31-225 pixel per esempio). Eliminare il rumore dalle immagini selezionando la casella "Dark" nella finestra di Threshold. segnale di immagine può essere invertito per facilità di conteggio.
- Quantificare molecolare thic stratokness nel canale verde utilizzando i «canali Split 'e strumento di' soglia Map 'come nei passaggi 7.1 e 7.2. Utilizzando il marcatore di formato su ogni immagine come guida, misurare casuali tre lunghezze strato molecolare all'interno di ciascuno dei due designati 200 micron tratti di ciascuna immagine fessura primario. Effettuare misurazioni dall'estremità prossimale del mozzo dendritiche Purkinje alla base del soma Purkinje all'estremità distale del mozzo dendritiche Purkinje.
- Record di Purkinje conta delle cellule e spessore dello strato molecolare come mezzi più o meno l'errore standard. Eseguire ANOVA con confronti multipli analisi post-hoc per testare l'effetto delle condizioni di trattamento o genotipo del numero di cellule e la lunghezza del mozzo dendritiche.
8. Analisi HPLC di cerebellare acido succinico concentrazioni post-trattamento
- Preparazione del campione per l'analisi
- Pesare ogni raccolto emisfero destro cerebellare primautilizzare in analisi HPLC. Macinare metà emisferiche uno alla volta in un omogeneizzatore Dounce pre-raffreddata e aggiungere 0,5 ml di 75:25 (in volume) di acqua: soluzione metanolica di ciascuna metà omogeneizzato 17.
- Utilizzando una stretta omogeneizzatore pre-raffreddata, grossolanamente rompere il tessuto con 5 colpi Dounce. Continuare a tritare finemente ciascun campione di tessuto con un omogeneizzatore più ampio, l'applicazione di 20 colpi Dounce.
- Trasferire i omogenati di pre-raffreddata provetta. Dopo ogni campione, lavare l'omogeneizzatore con 0,5 ml di acqua ghiacciata: soluzione di metanolo e aggiungere il risciacquo alla provetta.
- campioni di omogenato centrifugare a 1.300 xg per 30 min a 25 ° C e raccogliere il surnatante in una provetta pulita.
- Filtrare il surnatante con una unità di filtro centrifugo alloggiata con un filtro di cellulosa rigenerata di 10 kilodalton (kDa) limite nominale peso molecolare. Se non immediatamente esecuzione dell'analisi HPLC, magazzini campioni filtrato a -80 °C.
- HPLC Strumentazione e condizioni
- Attaccare una colonna cromatografica esclusione ionica con una lunghezza di almeno 30 cm e una dimensione delle particelle di 7 micron a una cromatografia liquida ad alta prestazione.
- Preparare e degassare una sufficiente quantità di 1 mM tampone acetato regolata ad un pH di 5.
- Impostare la HPLC con una velocità di fase mobile 0,8 ml / min. Se si utilizza un rivelatore UV-vis, selezionare una lunghezza d'onda di 224 nm rivelatore. tempi di eluizione tipici dell'acido succinico in queste condizioni sono tra 10 e 12 min.
- L'esecuzione e analisi standard e dei campioni
- Preparare una serie di norme in acetato fase mobile tampone con concentrazioni di acido succinico tra 0 e 250 ppm.
- Eseguire ogni standard e preparare una curva di calibrazione utilizzando l'area del picco misurata da ogni esecuzione.
- Una volta che una curva standard accurata si ottiene, eseguire i campioni precedentemente preparati diluiti in tampone acetato.Per una maggiore precisione della misurazione, i campioni possono essere diluiti con concentrazioni note di acido succinico che sono stati diluiti nella fase mobile. Eseguire tutti i campioni in triplice copia.
- Analizzare cromatogrammi HPLC per determinare la concentrazione di acido succinico dei campioni utilizzando la curva di calibrazione e moltiplicando in volume del campione e dividendo per massa del campione originale.
9. Ex Analisi Vivo di cerebellare mitocondriale Funzionalità L'utilizzo di un ossigeno gruppo elettrodi di controllo
- Creare un elettrodo di Clark usando un sistema disponibile in commercio applicando prima una goccia di cloruro di potassio (50% KCl w / v) soluzione sul catodo di platino, tagliando un pezzo di tabacco commerciale 1,5 centimetri 2 carta di rotolamento e mettendo delicatamente il foglio il catodo di platino.
- Coprire il catodo e l'anodo circostante con un pezzo di politetrafluoroetilene (PTFE) carta 2,5 centimetri 2 e snuggly garantire sia membranes con anelli O, assicurandosi che non vi siano pieghe o bolle all'interno delle membrane. Drip 50% soluzione KCl nell'ambiente circostante bene.
- Fissare l'elettrodo premade nella camera di dosaggio e riempire con acqua satura d'aria. Riscaldare la camera a 30 ° C, aggiungere 0,8 centimetri ancoretta alla soluzione e agitare a 70 rpm utilizzando il software dello strumento. Calibrare la camera attraverso la definizione di ossigeno pari a zero. Per fare ciò, serialmente aggiungere qualche cristallo di ditionito di sodio agente riducendo alla soluzione.
- Una volta che la calibrazione è raggiunto, lavare la camera di una volta con etanolo al 70%, e poi lavare sei volte con acqua deionizzata prima di consentire la camera si adatti in 1,5 ml di tampone respirazione (5 mm MgCl 2, 60 mm KCl 100 mm mannitolo, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na 2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
NOTA: tutte le tracce di ditionito di sodio deve essere completamente rimosso durante le fasi di lavaggio prima di tentare di misurareconcentrazioni di ossigeno durante gli esperimenti respirazione.
- Una volta che la calibrazione è raggiunto, lavare la camera di una volta con etanolo al 70%, e poi lavare sei volte con acqua deionizzata prima di consentire la camera si adatti in 1,5 ml di tampone respirazione (5 mm MgCl 2, 60 mm KCl 100 mm mannitolo, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na 2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
- omogeneizzare delicatamente gli emisferi cerebellari pesati in 0,5 mL di tampone omogenato (0,25 M di saccarosio, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Trasferimento omogeneizzato a un 1,5 ml provetta pulita e mantenere refrigerata fino a quando iniziare il saggio.
- Aggiungere l'omogeneizzato alla camera, raggiungendo un volume finale di 2 ml. Permeabilize l'omogeneizzato cerebellare con l'aggiunta di 40 ml di digitonina o saponina (5 mg / ml); consentire il tessuto omogeneizzato per incubare per 10 min.
NOTA: Digitonina e saponina sono tossici, e tempi di incubazione devono essere ridotte al minimo. - Per iniziare a registrare il consumo di ossigeno, determinare la funzione mitocondriale attraverso l'attivazione e l'inibizione della catena di fosforilazione ossidativa utilizzando rispettivamente substrati e inibitori, (3 min registrazioni per substrato).
- Aggiungere substrati che utilizzano siringhe pulite come segue: 10 ml 2 M glutammato [concentrazione finale (fc) 0,01 M],5 ml 0,8 M malato [fc 2 mm] 20 l 0,5 M adenosina difosfato (ADP) [fc 5 MM], 1 ml 1 mM rotenone [fc 0,5 micron], 20 l 1M acido succinico [10 mm], 1 ml 5 mM antimicina A [fc 2,5 micron], 1 ml 0.8 M ascorbato [fc 0,4 mm], e 5 ml di 0,2 M tetrametil-p-fenilendiammina (TMPD). [Fc 0.5 mm] Quando si aggiunge substrati alla camera di fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nel sistema.
NOTA: Informazioni dettagliate sul effetto funzionale indotta da ciascun substrato e inibitore è descritto un protocollo precedentemente pubblicato 7. I singoli curve dose-risposta possono avere bisogno di essere generato per determinare le concentrazioni ottimali di substrati e inibitori nei preparati / tessuti / specie non precedentemente studiati. Allo stesso modo, il protocollo può essere ottimizzato per le tendenze innate metaboliche del tessuto / specie in fase di studio, come ad esempio le preferenze del substrato.
- Aggiungere substrati che utilizzano siringhe pulite come segue: 10 ml 2 M glutammato [concentrazione finale (fc) 0,01 M],5 ml 0,8 M malato [fc 2 mm] 20 l 0,5 M adenosina difosfato (ADP) [fc 5 MM], 1 ml 1 mM rotenone [fc 0,5 micron], 20 l 1M acido succinico [10 mm], 1 ml 5 mM antimicina A [fc 2,5 micron], 1 ml 0.8 M ascorbato [fc 0,4 mm], e 5 ml di 0,2 M tetrametil-p-fenilendiammina (TMPD). [Fc 0.5 mm] Quando si aggiunge substrati alla camera di fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nel sistema.
- Dopo la raccolta dei dati è completata, delicatamente unspirare gli omogenati cerebellari e pulire la camera con etanolo e acqua deionizzata. Una volta puliti, ulteriori campioni di omogenato cerebellari possono essere eseguiti senza ulteriori calibrazioni finché la membrana PTFE rimane intatto. Dopo completamento finale, pulizia elettrodo con acqua deionizzata ed etanolo e conservare con gel di silice o essiccante.
NOTA: Tra il giorno stesso viene eseguito, riempire la camera con acqua deionizzata in modo che la membrana non si asciughi. - Utilizzando la scheda tecnica creata dalla software dello strumento, l'esportazione 40 min di dati respirazione inizio due minuti dopo substrato oltre ad un foglio di calcolo.
- Calcolare il tasso di respirazione per substrato o inibitore. Normalizzare i dati dividendo il totale per la respirazione il tasso di respirazione durante l'aggiunta del substrato ascorbato-TMPD.
NOTA: Il tasso di respirazione può essere ulteriormente normalizzati per il contenuto proteico del tessuto che può essere particolarmente auspicabile in esperimenti neurodegenerazionein cui il tenore di tessuto può variare. Per fare ciò, riserva di 50 ml di omogenato campione (dal punto 9.3) per l'uso in un saggio di proteine standard.
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Representative Results
Attraverso il targeting farmacologico dei mitocondri cerebellare con acido succinico siamo in grado di prevenire la disfunzione mitocondriale in un modello murino della cerebellare SCA1 malattia neurodegenerativa. Il donatore di elettroni canonica di succinato deidrogenasi, acido succinico, è stato sciolto in acqua potabile gabbia casa di topi SCA1 per un mese, con inizio comportamentale valutazione durante la seconda settimana di trattamento e di valutazione neuropatologico dopo il trattamento (Figura 1A). Trattamento con acido succinico 22 migliora le prestazioni dei topi SCA1 come misurate con il test impronta, saggio del fascio e accelerazione test rotarod. I miglioramenti comportamentali rilevati indica un maggiore coordinamento del motore e motore di apprendimento (Figura 1B-D).
Salvataggio di prestazioni comportamentali è stato trovato in concerto con un mantenimento di ceretessuto bellar (Figura 2). trattamento con acido succinico significativamente conservata corpi cellulari di Purkinje e l'aumento dello spessore dello strato molecolare (indicativo di Purkinje dendritiche cellule estensione pergolato) nella fessura primaria cerebellare nei topi SCA1 trattati rispetto ai topi non trattati SCA1. Cellula di Purkinje lunghezza dendritiche e di Purkinje conta delle cellule del corpo forniscono forti misure di citoarchitettura cerebellare complessiva 5.
HPLC è stata eseguita sul tessuto cerebellare da topi trattati per verificare che l'acido succinico disciolto nell'acqua potabile gabbia attraversato la barriera ematoencefalica e tessuto cerebellare penetrato. Una curva variando la lunghezza del trattamento supporta ulteriormente annuncio trattamento libitum di acido succinico come un valido modo di raggiungere il tessuto cerebellare (Figure 3A-B). I nostri esperimenti respirazione sono in corso ed i nostri risultati saranno pubblicati in una ricercamanoscritto. Qui dimostriamo che siamo in grado di registrare con successo il tasso di respirazione attraverso cerebellari complessi della fosforilazione ossidativa dopo l'aggiunta di diversi substrati a catena di trasporto degli elettroni e inibitori (Figura 3C). In ultima analisi, useremo il test di respirazione per mostrare i deficit della fosforilazione ossidativa in SCA1 cervelletto del mouse e l'inversione di quei deficit mediante trattamento acido succinico.
Figura 1: Schema di trattamento e Rappresentante dei dati dal Footprint Assay, Larghezza Assay e accelerando rotarod. (A) acido succinico è stato sciolto in acqua potabile gabbia casa di topi SCA1 per quattro settimane con inizio alle 17 settimane di età. topi SCA1 iniziano a visualizzare il fenotipo atassia a 5 settimane di età. Non raffigurati nello schema sono tre coorti di controllo: tipo selvatico topo acido succinico trattati, vevei- trattati topi SCA1 e topi di tipo selvatico veicoli trattati. le valutazioni del comportamento sono state condotte durante il periodo di trattamento come segue: saggio di impronta durante la settimana 17, saggio fascio durante la settimana 18 e accelerando rotarod durante la settimana di 19. A 20 settimane di età, i topi sono stati sacrificati e tessuto cerebellare è stato prodotto per saggi immunopatologia, saggi HPLC e test di respirazione. (B) i dati rappresentativi del saggio impronta che mostrano un'andatura veicolo trattati di tipo selvatico (in alto), veicoli trattati SCA1 andatura (al centro) e un trattato con acido succinico SCA1 andatura (in basso). Dati di analisi (C) del fascio che mostra un miglioramento in termini di prestazioni del fascio (misurata come numero di prove per una corsa di successo) di topi SCA1 con trattamento acido succinico. (* P <0,05). (D) trattamento con acido succinico migliora in modo significativo le prestazioni di accelerazione rotarod di SCA1 22 topi, come indicato da un aumento della latenza di cadere (* p <0,05). Le barre di errore in re CDflect l'errore standard della media. La significatività è stata determinata da una via ANOVA e confronti multipli analisi post-hoc. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentante dati da Conti cellule di Purkinje e strato molecolare Spessore Immunopatologia Assays. (A) I risultati rappresentativi del saggio conta delle cellule di Purkinje che mostrano un controllo del veicolo trattati transgenico cerebellare fessura primaria (in alto), veicoli trattati SCA1 cerebellare fessura primaria (al centro) e un succinico trattata con acido SCA1 cerebellare fessura primaria (in basso) macchiato per nuclei ATXN1-positivo (rosso) e di contrasto con DAPI (blu). Linee bianche rappresentano i 200 micron regioni di tessutodesignato per la conta delle cellule. Per questa particolare analisi, un topo transgenico di controllo sovra-esprimono un gene ATXN1 non patogeno sotto il controllo di un promotore Purkinje cell-specifico è stato utilizzato al posto di un mouse di tipo selvatico, perché le funzioni di controllo transgenici facilmente livelli rilevabili di nucleare Purkinje ATXN1 e il mouse di tipo selvatico non. Il mouse di controllo transgenico non visualizza un fenotipo atassia cerebellare o neurodegenerazione. (B) I risultati rappresentativi del saggio spessore dello strato molecolare che mostrano una fessura veicolo trattati tipo selvatico cerebellare primaria (in alto), veicoli trattati SCA1 cerebellare fessura primaria (al centro) e un SCA1 fessura succinico trattata con acido cerebellare primaria (in basso) colorate per calbindin , un marker di cellule di Purkinje (bianco). Due dei tre strati di cellule cerebellari possono essere visualizzati con calbindin. Lo strato di cellule di Purkinje centrale (composto da corpi cellulari Purkinje) è visibile lungo con lo strato più esterno molecolare (costituito da Purkinje cedendriti ll). Lo strato molecolare appare al centro della fessura primario a causa delle pieghe naturali del tessuto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati Rappresentante della HPLC e la respirazione saggi. (A) Curva standard di concentrazioni note fino a 250 ppm di acido succinico diluito in tampone acetato e tramato contro l'area sotto il picco HPLC misurata. L'equazione della linea è stata utilizzata per calcolare le concentrazioni di acido succinico sconosciuti da campioni di tessuto trattati. (B) Rappresentante dose-risposta picchi acido succinico da tessuto cerebellare del mouse seguenti diversi tempi di trattamento (0, 1 o 5 settimane). Nelle condizionidescritto, acido succinico tipicamente eluito tra 10 e 12 min. (C) rappresentante la respirazione fuga da tessuto cerebellare di tipo selvatico del mouse veicolo-trattata. La linea blu rappresenta la variazione della concentrazione di ossigeno, la linea rossa tratteggiata rappresenta la variazione del tasso di respirazione e la linea rossa fissa raffigura una versione livellata della linea tratteggiata. D = aggiunta di digitonina, G / M = aggiunta di glutammato / malato, A = aggiunta di ADP, R = aggiunta di rotenone, S = aggiunta di acido succinico, AA = aggiunta di antimicina A e A / T = aggiunta di Asc / TMPD. Tutti i substrati sono stati aggiunti ai tempi rappresentati in figura e alle concentrazioni descritte nel protocollo (passo 9.5). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Se si utilizzano questi metodi come descritto, sono in grado di rilevare e alleviare ossidativa disfunzione mitocondriale fosforilazione mediata in modelli murini malattie neurodegenerative cerebellari. I saggi biochimici e comportamentali combinate sono metodi poliedrici per determinare l'entità del contributo mitocondriale per cerebellare patologia malattia neurodegenerativa. Trattando i topi con l'acido succinico per stimolare il metabolismo e aumentare la funzione mitocondriale, siamo in grado di mostrare un salvataggio di deficit comportamentali cerebellari e la degenerazione cerebellare.
La metodologia qui presentata può essere utilizzato per testare un'ampia varietà di composti metabolicamente mirati idrosolubili per potenziale trattamento di malattie neurodegenerative cerebellare. L'acido succinico è facilmente solubile in acqua a 0,75 mg / ml, che consente per la consegna facile con acqua potabile gabbia e non richiede la creazione di pellet cibo integrati. Altri solubile in acquacomposti possono essere facilmente sostituiti nel protocollo. Se utilizzando composti metabolicamente mirati che non sono solubili in acqua, la nostra metodologia può essere facilmente adattato per trattamento con pellet cibo integrati 11, 12. Durante il test di un nuovo composto, è fondamentale per verificare la penetrazione cerebellare del farmaco prima di iniziare il trattamento tramite analisi HPLC o altro metodo di rilevazione adeguato.
La batteria di valutazioni patologiche è stato scelto a causa della loro efficacia riportato a rilevare le patologie neurodegenerative del cervelletto. Le valutazioni saggio impronta, test del fascio e il dosaggio rotarod sono ampiamente usati di malattie cerebellari neurodegenerative tra cui vari SCA, e Friedreich atassia di 6, 23, 24. Questi particolari valutazioni comportamentali correlati fortemente con degenerazione cerebellare. Tuttavia, altri behavioraL paradigmi possono essere sostituiti o aggiunti in base alle esigenze.
L'etichettatura delle cellule di Purkinje nei topi SCA1 con atassina-1 e calbindina è ampiamente utilizzato per rilevare la degenerazione cerebellare nei modelli SCA1 5, 20, 21. Altri anticorpi neuronale selettivi e regioni di tessuto può essere utilizzato per visualizzare la mitigazione del neurodegenerazione, se necessario.
Analisi La respirazione è un potente strumento per la rilevazione specifica di disfunzione o riparazione all'interno dei singoli complessi mitocondriali dal tessuto cerebellare. Si deve prestare attenzione per minimizzare il tempo tra la raccolta del tessuto e si effettua il test per ottenere risultati riproducibili. Inoltre, è importante notare l'omogeneità del tessuto analizzato. In particolare, il tessuto cerebellare costituito prevalentemente di neuroni granulari che non esprimono il transgene SCA1 nel nostro modello. Pertanto, un passaggio fondamentale di questoprotocollo è quello di determinare se tutta la respirazione cerebellare è un metodo praticabile per il rilevamento di funzione complessa ossidativo. cambiamenti nella respirazione transgenico SCA1 cervelletto del mouse possono essere sottili e possono richiedere un aumento del numero di soggetti per ottenere risultati statisticamente significativi.
La combinazione di metodi comportamentali e neuropatologici descritti in questo protocollo fornisce quantificazione distinta di malattie SCA1 e può robusta rilevare miglioramento in seguito a trattamento con composti idrosolubili. Il significato di questo protocollo è nella sua ampia adattabilità a vari trattamenti e una gamma diversificata di modelli murini. Inoltre, molte delle tecniche utilizzate in questo protocollo non richiedono costose attrezzature o tecniche complicate e sono quindi adatti per un ambiente di ricerca universitario. Le future applicazioni di questo protocollo saranno utilizzati per valutare il grado di efficacia del trattamento al momento della consegna età-dipendente del composto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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