Abstract
disfunção mitocondrial desempenha um papel significativo no processo de envelhecimento e em várias doenças neurodegenerativas, incluindo as ataxias espinocerebelares hereditárias e outras perturbações do movimento marcadas pela degeneração progressiva do cerebelo. O objetivo deste protocolo é avaliar disfunção mitocondrial em ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) e avaliar a eficácia da segmentação farmacológico da respiração metabólica através do ácido succínico composto solúvel em água para retardar a progressão da doença. Esta abordagem é aplicável a outras doenças cerebelares e pode ser adaptado a uma série de terapias solúveis em água.
Análise ex vivo da respiração mitocondrial é utilizado para detectar e quantificar as alterações relacionadas com a doença em função mitocondrial. Com a evidência genética (dados não publicados) e as provas proteômica de disfunção mitocondrial no modelo do rato SCA1, podemos avaliar a eficácia do tratamento com o metabólica impulsionador s solúvel em águaácido uccinic por dissolução deste composto directamente na água de beber casa gaiola. A capacidade do fármaco para passar a barreira hemato-encefálica pode ser deduzida utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A eficácia destes compostos pode ser testada usando múltiplos paradigmas comportamentais, incluindo o rotarod aceleração, teste trave de equilíbrio e análise da pegada. integridade citoarquitectónica do cerebelo pode ser avaliada através de imunofluorescência que detectam os núcleos das células de Purkinje e dendritos das células de Purkinje e soma. Estes métodos são técnicas robustas para a determinação da disfunção mitocondrial e a eficácia do tratamento com compostos solúveis em água na doença neurodegenerativa cerebelar.
Introduction
As mitocôndrias são os principais produtores de trifosfato de adenosina (ATP), uma co-enzima essencial para a energia celular, com a maioria do ATP mitocondrial produzido através da fosforilação oxidativa (FOX) usando a cadeia de transporte de electrões. O cérebro, dadas as suas elevadas exigências metabólicas e sua dependência de fosforilação oxidativa para alimentar a atividade neural, é altamente suscetível a disfunção mitocondrial. Como resultado, disfunção mitocondrial é accionado durante o processo de envelhecimento 1 e está implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, 2, 3, 4. Portanto, segue-se que as mitocôndrias são alvos terapêuticos atractivos para a neurodegeneração.
Neste protocolo, adotamos o uso de ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) como uma doença neurodegenerativa modelo para o estudo das mitocôndriasl disfunção e ao desenvolvimento de terapias alvo-mitocondriais. SCA1 é causada por uma mutação de poliglutamina (poliQ) expansão repetida no produto do gene ataxin-1 que desencadeia a progressiva degeneração dos neurónios de Purkinje do cerebelo e neurónios de outras regiões do cérebro. A linha transgénica rato usado aqui (designado como o rato SCA1), que expressa uma ataxin-1 transgene poliQ-mutante sob o controlo de um promotor específico de células de Purkinje, permite a análise orientada de o componente das células de Purkinje de SCA1 5. Ratos SCA1 sofrer degeneração das células de Purkinje gradual e desenvolver marcha atáxica 6.
disfunção complexo mitocondrial e eficácia do tratamento alvejado-mitocondrial pode ser avaliada com uma bateria de ensaios moleculares e comportamentais. Disfunção complexo mitocondrial é medida ex vivo através de ensaios de respiração que detectam o consumo de oxigénio no tecido cerebelar alterada ema presença de substratos cadeia de transporte de elétrons e inibidores 7. Os ensaios de respiração foram previamente utilizadas com tecido permeabilizada, isolados mitocondriais, e tecido inteiro 7, 8, 9. Eles permitem a avaliação direta da função mitocondrial ao contrário dos métodos de recolha de dados morfológicos, como a microscopia eletrônica de transmissão ou imunofluorescência. O uso de tecido todo em vez de isolado mitocôndrias impede a seleção tendenciosa de mitocôndrias saudáveis que podem ocorrer durante o processo de isolamento 7. Quando adaptadas ao protocolo como mostrado, o ensaio a respiração é um valioso método para a detecção de disfunção mitocondrial em estados de doenças neurodegenerativas do cerebelo.
activadores não específica de metabolismo pode ser usada para inferir a disfunção mitocondrial em modelos de ratinhos transgénicos de diseas neurodegenerativasE e auxílio no desenvolvimento de novas terapias. A quercetina, coenzima Q10 e creatina têm sido mostrados para melhorar a patologia neurodegenerativa doença em doentes e em modelos animais de doença neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Aqui nós apresentamos um novo activador metabólico, ácido succínico, para estimular o metabolismo e aumentar a função mitocondrial na doença neurodegenerativa. Para assegurar que o activador é de atravessar a barreira hemato-encefálica, a HPLC foi utilizada para detectar a entrega ao tecido neural em ratinhos tratados 17.
Para avaliar os efeitos terapêuticos dos compostos solúveis em água metabolicamente alvo, tais como ácido succínico, uma bateria de paradigmas comportamentais e estudos imunopatológicos pode ser usado. due para os défices de coordenação motora encontradas na doença neurodegenerativa cerebelar, o ensaio de pista pegada, ensaio de feixe e ensaio da haste rotativa aceleração são usados para detectar salvamento de patologia comportamental 6, 18, 19. Estas medidas são completadas com a avaliação imunopatológico da citoarquitetura cerebelar, avaliando a espessura molecular camada (definido como o comprimento do mandril Purkinje dendrítica celular) e contagens de células de Purkinje soma dentro de um lóbulo definida de tecido cerebelar 6, 20, 21. Aqui apresentamos vários métodos neuropatológicas e comportamentais para a detecção e tratamento da disfunção mitocondrial com compostos solúveis em água metabolicamente alvo.
Nós usamos a análise ex vivo da respiração mitocondrial para analisar a disfunção mitocondrial na tran SCA1rato sgenic. Além disso, mostra-se que os sintomas da doença e patologia são melhoradas pelo impulsionador ácido succínico mitocondrial solúvel em água, implicando ainda a disfunção mitocondrial na progressão da doença SCA1.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes IACUC em Skidmore College para trabalhar com camundongos.
1. O tratamento com compostos solúveis em água
- Dissolve-se o ácido succínico a uma concentração de 0,75 mg / mL em água potável gaiola. Note-se que qualquer composto solúvel em água de interesse para a concentração desejada pode ser substituído na presente fase. Agita-se a solução de se certificar de que o composto está totalmente dissolvido.
- Depois de ratinhos atingem a idade de tratamento desejado, substituir a água potável casa gaiola do grupo de condições de tratamento com a solução no passo 1.1.
- Medir o peso de ambos os tratamento e controle garrafas de água grupo diárias para garantir que ambos tratados e os ratos de controle estão bebendo a mesma quantidade de água. Use essas medidas para calcular dosagem total da droga por gaiola. Continuar o tratamento durante todo o experimento e monitor de peso garrafa.
2. Análise da pegada
- Coloque a pista para o chão ouuma mesa em um quarto confinado. Definir a pista com uma ligeira inclinação para cima em direção a caixa de casa forrada com roupas de cama e recompensa alimentar (por exemplo, cereais açucarados). Forre o comprimento da pista com uma folha de papel branco. Permitir que o sujeito se aclimatar na caixa de casa por 5 min.
- Remover o assunto a partir da caixa da casa e pintar patas traseiras esquerda e direita, respectivamente, com tinta azul e vermelho à base de água não tóxico. As impressões de tinta serão utilizados para calcular as medidas comportamentais de saída múltipla.
- Coloque o assunto no início da pista e permitir que o sujeito a caminhar para a caixa de casa. Uma vez que o assunto atingiu a caixa de casa, fechar a porta do alçapão, e permitir que o sujeito para ficar dentro da caixa de casa durante um minuto antes de voltar para a respectiva gaiola. Limpe a caixa de pista e casa com 30% de etanol e substituir a roupa de cama, recompensa alimentar, e papel pista para o próximo assunto.
- Quantificar o número de passos, largura do portão, ângulo de passo, e número de voltas tomadaspelo objecto de acordo com os métodos de análise descritos anteriormente 6. Um ensaio pegada de sucesso é definido como um mínimo de 5 pegadas sequenciais em que o sujeito está andando em direção a caixa de meta sem se virar ou parar.
3. Análise de feixe
- Configurar o aparelho de feixe de acordo com as especificações barra transversal descritos anteriormente 6 com os 6 vigas seguintes: Feixe 1 = rectangular de largura, 28 mm; feixe 2 = redondo, 28 mm de diâmetro; feixe 3 = rectangular, a largura 12 milímetros; feixe 4 = redondo, 12 mm de diâmetro; 5 = viga rectangular, largura de 6 mm; feixe 6 = rodada, 6 mm de diâmetro. Em uma das extremidades da viga, configurar uma caixa de casa escurecida com alimentos recompensa.
- Para treinar indivíduos na trave, montar o aparelho com feixe 3. Com cuidado, coloque o assunto no final do oposto feixe para a caixa de casa, e permitir que o sujeito a atravessar. Permitir que cada sujeito até três 2-mínimo de ensaios para conseguir uma temporada de sucesso, Definida como cruzar o feixe e entrando caixa casa dentro de 2 min. Entre ensaios, deixe o resto assunto na caixa casa por 2 min. Em entre os sujeitos, limpar a caixa de viga e casa com 30% de etanol e substituir a comida recompensa em preparação para o próximo assunto.
- Repita o passo 3.2, uma vez por dia durante os próximos dois dias, resultando em um total de 3 dias de formação sequenciais. No dia de testes, dia 4, deve seguir sequencialmente os dias de treino.
- Para testar os sujeitos no dia 4, primeiro montar o aparelho com feixe 1 e configurar a caixa de casa, como descrito no passo 3.1. Coloque uma câmara de vídeo na frente do aparelho e verificar que o aparelho de feixe completa pode ser claramente capturado em vídeo. Começar a gravar e coloque o primeiro assunto na frente de feixe para a caixa de casa, permitindo até 3 2 min tentativas para concluir com êxito um ensaio. Entre ensaios, permitem assunto para descansar por 2 minutos na caixa de casa.
- Continuar a testar sujeitos em cada um dos seis vigas em ordem numérica,permitindo que o assunto para descansar por 2 minutos na caixa de casa antes de começar a próxima viga. Entre os sujeitos, limpar cada viga ea caixa de casa com 30% de etanol e substituir a comida recompensa em preparação para cada assunto.
- Videotape cada tentativa e registrar o número de tentativas bem sucedidas por indivíduo por feixe da seguinte forma: '1' indica o assunto foi bem-sucedido na primeira tentativa, '2' indica o assunto foi bem-sucedida no segundo julgamento, '3' indica o assunto foi sucesso no terceiro e último ensaio, e "4" indica o sujeito não foi bem sucedida em qualquer dos três ensaios.
- Use gravações de vídeo de footslips ensaios medida por marcadores que estão cegos para as condições experimentais do assunto. Definir um footslip como posterior do pé que está à vista directa da câmara de imersão abaixo de uma linha média teórica em todo o comprimento da viga. pontuações médias footslip de vários marcadores.
- Para analisar o número de sensaios de Uccessful e número de dados footslips, calcular a média e erro padrão dentro de cada genótipo e da condição coorte experimental. Realizar uma análise ANOVA de um factor e as comparações múltiplas post hoc para determinar se há um efeito do tratamento e do genótipo no número de ensaios bem sucedidos, o número de footslips.
4. Acelerar Rotarod
- Aclimatar sujeitos para a sala de ensaio 10 minutos antes do início do ensaio. Durante este período de aclimatação, preparar o aparelho rotarod, limpeza de cada pista do aparelho com 30% de etanol.
- Abra o software rotarod e definir configurações começar a 4 rpm, configurações de aceleração em 5 posições mínimo e velocidade final a 40 rpm. Estas configurações proporcionam uma aceleração constante de 4-40 rpm, durante um período de 5 min. Os ratos podem permanecer sobre a haste rotativa a 40 rpm durante 5 minutos adicionais para além do período de aceleração para um comprimento máximo de execução de 10 minutos.
- Pós-aclimatação, lugar temas onto da haste rotativa nas respectivas faixas, enquanto a haste está a rodar a 4 rpm. Uma vez que todos os assuntos estão em suas respectivas raias, começar o primeiro julgamento. Grave a latência para cair usando o software do instrumento; um temporizador secundário pode ser empregado como uma cópia de segurança.
- Após a conclusão julgamento, permitir que cada sujeito para descansar em seus respectivos reservatórios pista durante dez minutos antes do próximo julgamento para evitar a fadiga.
- Repita os passos 4.3 e 4.4, para um total de quatro ensaios.
- Repita os passos de 4,3-4,5 para um total de quatro dias consecutivos, o tratamento durante todo o período de ensaio contínuo. Após a conclusão, quantificar a latência para cair fora da haste rotativa para cada ensaio por sujeito 6.
5. Extraiu-se e cerebelar Fixação
- Euthanize camundongos através de asfixia com dióxido de carbono de acordo com as diretrizes IACUC institucionais. Local sujeito dentro da câmara de dióxido de carbono, e libertar dióxido de carbono para dentro da câmara. Assistiro animal em todos os momentos durante a etapa de eutanásia e não deixar o animal sem supervisão.
- Uma vez que a respiração cessou e sujeitos não apresentam qualquer percepção de dor por pressão remanescente da pata traseira, remover objecto da câmara e fazer uma incisão na linha média superior através do tecido epitelial da média do crânio caudalmente para a base do crânio através do tecido epitelial.
- Com uma tesoura de dissecação, cortados do crânio a partir da base na espinal medula por meio da sutura sagital ao bregma. Cortar lateralmente através de cada sutura coronal, antes de retirar os ossos frontal, parietal e interparietais usando uma pinça sem corte.
- Use uma pinça sem corte para romper lateral do osso para o cerebelo. Use uma pinça para separar a partir do cerebelo e tronco cerebral e colículos extrudir-lo do resto do tecido. Separar o cerebelo em hemisférios esquerdo e direito com fórceps.
- Imediatamente coloque cerebelo direito em nitrogênio líquido para guardar para HPLC analise e cerebelo esquerda em pré-refrigerada paraformaldeído a 4% (PFA) para a fixação do tecido. Colher qualquer outro tecido de interesse antes de cortar a aorta e descartando a carcaça de acordo com regras IACUC institucionais.
CUIDADO: PFA é altamente tóxico, inflamável e corrosivo. - Vinte e quatro horas pós-extracção, lavagem tecido fixado em PFA (4% em PBS) em tampão fosfato salino (PBS) (três vezes, 5 minutos / lavagem) antes de colocar o tecido em 30% de sacarose a 4 ° C durante até 2 semanas.
6. Imunopatologia Assay
- Conecte o tubo de um micrótomo trenó a uma uma caixa de controle de temperatura torneira da pia e. Use a caixa de controle de temperatura para arrefecer o estágio microtome a -25 ° C. Coloque o selector de espessura de corte de 50 mm.
NOTA: Se o disco no micrótomo trenó não atingir 50 mm, defina a marcação para um ajuste mais fino e multiplicar a espessura, deslocando a definição em conformidade (por exemplo, definir o dial de 10? M e deslocar cinco vezes antes do corte para uma espessura total de 50 um). - Dab uma porção dime-size da solução óptima temperatura de corte (OTC) para o palco. Antes da OTC congela, utilize uma pinça para posicionar o hemisfério de modo que a superfície de corte médio-sagital está virado para baixo sobre a camada de OTC. Trabalhando rapidamente, gentilmente orientar o tecido com uma pinça para que a ponta lateral do hemisfério é apontado para a lâmina, superior ao palco. Permitir que o OTC para congelar completamente.
- Trabalhando em camadas, adicione OTC adicional em torno do tecido, permitindo o OTC para congelar completamente antes de adicionar a camada seguinte. Adicionar uma camada fina de OTC na parte superior do tecido e congelamento.
- Seção do tecido, a distribuição igual de peso corporal para a lâmina de corte, enquanto o corte. Recolha seções usando um pincel artista plástico e coloque em uma bem-placa devidamente rotulados contendo 1x PBS. Entre secções, re-definir a espessura de corte natrenó com ligação micrótomo, se necessário, a 50 um.
- Substituir o PBS em cada poço da placa bem com uma solução de ureia [0,01 M de ureia em PBS] e colocar a placa em gelo. Quando estiver pronto, retire a placa de seções de gelo e deixe ferver em solução de ureia três vezes durante 15 s cada vez para desmascarar epítopos de imunomarcação. Este passo pode ser facilmente conseguido colocando a placa em um bloco de aquecimento definida como a temperatura de ebulição. Entre cada passo de ebulição, arrefece-se a placa que contém as secções de tecido em gelo.
NOTA: Se se realizarem a ureia, o bloqueio, o anticorpo primário, o anticorpo secundário e passos DAPI numa placa de 96 poços, usar volumes de 100 uL por toda parte. Se um poço de tamanho diferente é usado, ajustar os volumes de reagente em conformidade. Em vez de um bloco de aquecimento, um forno de microondas pode ser utilizada para ferver amostras de tecido na ureia. amostras de microondas em uma configuração de três intervalos de 15 s de alta potência. - Pós ebulição, lavar secções três vezes, cada vez removendo presente solução, substituindo a solução decom PBS 1x e agitando durante 10 min.
- secções de bloco com solução de soro de burro (3% de soro de burro normal, 0,3% de triton X-100 em PBS) por incubação dos tecidos no soro durante uma hora com agitação suave à temperatura ambiente. Remoção da solução de soro de burro.
- Secções etiqueta com 0,2 ug / ml de anti-calbindina e 1: 2000 de anti-anticorpo ataxin-1 (11NQ) 16 em solução de soro de burro e incubar a 4 ° C durante 72 h com agitação suave.
- Lavar as secções com PBS como no passo 6.5 antes da incubação secções em anticorpo secundário apropriado (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-cabra e 1: anticorpos 500 Alexa Fluor-594 anti-coelho diluídos em solução de soro de burro) a 4 ° C durante 48 h com agitação suave.
- Lave os cortes três vezes com PBS como no passo 6.5 antes de núcleos celulares rotulagem com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) solução diluída para uma concentração final de 0,5 ug / ml em PBS. DAPI incubação não deve ser superior a dez minutos. Remover solutioN e lavar com PBS como no passo 6.5.
- tecido Mount para 2% lâminas revestidas com gelatina com meio de montagem para reduzir a fotodegradação. Lamela e selar com unha polonês.
- Com um microscópio de varredura confocal localizar a fissura primária do cerebelo sob luz brightfield. Com uma objectiva 10X UIS2, digitalizar e sequencialmente excitar DAPI, AlexaFluor-488 e AlexaFluor-594 canais usando um laser de diodo 405 nm, um laser a gás de árgon de 488 nm e um laser de diodo 559 nm, respectivamente, em conjunto com um DM488 / 559 nm divisor de feixe dicróico. Separada e recolher a luz emitida usando SDM490 e divisores de feixe SDM560 e um filtro passa-banda BA575-675, respectivamente.
- Para cada canal, construir um z-pilha dentro da fissura primária com z = 20 ^ m e 0,1 um passo =. Usar o software de pós-processamento fornecido com o microscópio confocal para adicionar um marcador de tamanho para a imagem final.
NOTA: lasers alternativos, filtros e fluoróforos podem ser substituídas tendo como base availability. Se AlexaFluor-488 ou AlexaFluor-594 de detecção é fraco, um fosforeto de gálio (GaAsP) detector de alta sensibilidade podem ser empregues para aumentar o sinal, se disponível.
- Para cada canal, construir um z-pilha dentro da fissura primária com z = 20 ^ m e 0,1 um passo =. Usar o software de pós-processamento fornecido com o microscópio confocal para adicionar um marcador de tamanho para a imagem final.
7. Camada de Quantificação Molecular espessura e de Purkinje números de celular
- Usando ImageJ, abra uma imagem z-stack da fissura primária manchadas e dividir cada imagem em seus canais vermelho, azul e verde, selecionando "imagem" da barra de menu, 'Cor' na guia Imagem e 'Canal de Split' a partir da Cor aba.
- Criar uma projeção Z max de cada canal que foi dividido. Quando a imagem do canal de interesse é aberta, selecione 'Imagem' a partir da barra de menu, "seções" do guia Imagem e 'projeto-Z' no separador 'Seções'. Dentro do menu de comando 'projeto-Z', selecione 'Max Z projeção "e clique em" Ok ". Repita o procedimento para cada canal.
- Abra o plugin celular Contador, selecionando 'Plugins' do the Barra de Menus, "Analisar" a partir da aba Plug-ins e "célula Contador" a partir do separador Analisar.
NOTA: ImageJ eo ImageJ celular Contador plugin pode ser baixado nos sites fornecidos na tabela de materiais e equipamentos. - Quantificar o número de células de Purkinje por contagem dos núcleos marcado Ataxina-1-que se encontram ao longo de uma pré-determinada de 200 um estiramento anterior e posterior comprimentos da fissura primária. Use o mapa limite, seleccionando 'Imagem' a partir da barra de menu, 'Ajuste' do separador Imagem e "Limiar", na guia Ajuste para fazer um mapa limiar do canal de interesse (vermelho no caso de núcleos ataxina-1 marcado ).
- Escolher um intervalo de pixels que podem ser normalizada em toda a quantificação (31-225 pixels, por exemplo). Descartar o ruído das imagens, marcando a caixa "Fundo Escuro" na janela do Threshold. sinal de imagem pode ser invertido para facilitar a contagem.
- Quantificar thic camada molecularkness no canal verde usando os 'Threshold Map' ferramenta 'Canal de Split "e que nos Passos 7.1 e 7.2. Usando o marcador de tamanho de cada imagem como uma guia, medir aleatoriamente três comprimentos de camadas moleculares em cada um dos dois troços designados 200 uM de cada imagem fissura primária. Fazer medições a partir da extremidade proximal do mandril dendrítica de Purkinje na base do soma de Purkinje à extremidade distai do mandril dendrítica de Purkinje.
- Grave Purkinje contagem de células e espessura da camada molecular como meio mais ou menos o erro padrão. Realizar uma ANOVA com comparações múltiplas análise post-hoc para testar o efeito de condições de tratamento ou genótipo do número de células e o comprimento do mandril dendrítica.
8. Análise por HPLC do cerebelo succínico concentrações de ácido Pós-tratamento
- Preparação da amostra para análise
- Pesar cada hemisfério cerebelar direito colhidas antes dausar na análise por HPLC. Picar metades hemisféricas um de cada vez num homogeneizador Dounce de pré-gelada e adicionar 0,5 mL de 75:25 (em volume) de água: solução de metanol de cada metade 17 homogeneizada.
- Usando um homogeneizador pré-refrigerados estreito, grosseiramente romper o tecido com 5 cursos Dounce. Continue a finamente mediu cada amostra de tecido com um homogeneizador mais amplo, aplicando 20 golpes Dounce.
- Transferir os homogenatos de pré-refrigerada tubo de microcentrífuga. Depois de cada amostra, lavar o homogeneizador com 0,5 ml de água gelada: solução de metanol e adicionar a lavagem para o tubo de microcentrífuga.
- As amostras de homogenato Centrifugar a 1.300 xg durante 30 min a 25 ° C e recolher o sobrenadante num tubo de microcentrífuga limpo.
- Filtra-se o sobrenadante através de uma unidade de filtração centrífuga alojados com um filtro de celulose regenerada de 10 quilodalton (kDa) limite de peso molecular nominal. Se não imediatamente correr análise HPLC, armazenar filtrada amostras a -80 °C.
- HPLC Instrumentação e Condições
- Anexar uma coluna de cromatografia de exclusão iónica, com um comprimento de pelo menos 30 cm e uma dimensão de partícula de 7 um a uma cromatografia líquida de alta eficiência.
- Preparar e desgaseificar uma quantidade suficiente de tampão de acetato de 1 mM ajustado a um pH de 5.
- Defina a HPLC com uma velocidade de fase móvel de 0,8 ml / min. Se estiver usando um detector UV-vis, selecione um comprimento de onda do detector de 224 nm. tempos de eluição típicos para o ácido succínico sob estas condições são entre 10 e 12 min.
- Correr e Análise de Padrões e Amostras
- Preparar um conjunto de normas em fase móvel de tampão de acetato com concentrações de ácido succínico entre 0 e 250 ppm.
- Execute cada padrão e preparar uma curva de calibração usando a área do pico medido a partir de cada execução.
- Uma vez que uma curva padrão é obtida precisas, executar as amostras previamente preparadas, diluídos em tampão de acetato.Para uma maior precisão da medição, as amostras podem ser inoculadas com concentrações conhecidas de ácido succínico que foram diluídas na fase móvel. Executar todas as amostras em triplicado.
- Analise cromatogramas de HPLC para determinar a concentração de ácido succínico das amostras usando a curva de calibração e multiplicando pelo volume da amostra e dividindo pela massa da amostra inicial.
9. Ex Análise Vivo de cerebelar mitocondrial funcionalidade usando uma Oxigênio Unidade de Controle Eletrodo
- Criar um eléctrodo do tipo Clark usando um sistema disponível comercialmente, em primeiro lugar a aplicação de uma gota de cloreto de potássio (50% de KCl w / v) de solução no cátodo de platina, o corte de um pedaço de tabaco comercial 1,5 cm 2 de rolamento de papel e suavemente colocar o papel sobre o cátodo de platina.
- Cubra o cátodo eo ânodo circundante com um pedaço de politetrafluoretileno (PTFE) de papel 2,5 cm2 e snuggly assegurar tanto membranes com anéis de vedação, certificando-se que não há dobras ou bolhas dentro das membranas. Gotejar 50% de solução de KCl em torno bem.
- Fixe o eletrodo premade para a câmara de ensaio e encha com água saturada de ar. Aquece-se a câmara a 30 ° C, adicionar uma barra de agitação 0,8 centímetros à solução e agita-se a 70 rpm utilizando o software do instrumento. Calibrar a câmara através do estabelecimento de oxigênio zero. Para fazer isso, adicionar em série alguns cristais de redução do ditionito de sódio, para a solução.
- Uma vez que a calibração é conseguido, lava-se a câmara uma vez com etanol a 70%, e, em seguida, lavar seis vezes com água desionizada antes de permitir que a câmara se aclimatar em 1,5 mL de tampão de respiração (MgCl2 5 mM, KCl 60 mM, manitol 100 mM, 10 mM KH 2 PO 4, 2 mM Na EDTA a 0,5, Tris-HCl 60 [pH 7,4]) 7.
NOTA: todos os traços de ditionito de sódio deve ser completamente removido durante os passos de lavagem antes de tentar medirconcentrações de oxigênio durante os experimentos de respiração.
- Uma vez que a calibração é conseguido, lava-se a câmara uma vez com etanol a 70%, e, em seguida, lavar seis vezes com água desionizada antes de permitir que a câmara se aclimatar em 1,5 mL de tampão de respiração (MgCl2 5 mM, KCl 60 mM, manitol 100 mM, 10 mM KH 2 PO 4, 2 mM Na EDTA a 0,5, Tris-HCl 60 [pH 7,4]) 7.
- Suavemente homogeneizar os hemisférios cerebelares pesavam em 0,5 mL de tampão de homogeneizado (0,25 M de sacarose, EDTA 0,5 mM, Tris-HCl 50 [pH 7,4]). Transferir homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo e manter refrigerado até iniciar o ensaio.
- Adicionar o homogeneizado à câmara, atingindo um volume final de 2 ml. Permeabilizar o homogeneizado cerebelo através da adição de 40 ul de digitonina ou saponina (5 mg / mL); permitir que o tecido homogeneizado a incubar durante 10 min.
NOTA: A digitonina e saponina são tóxicos, e os tempos de incubação deve ser mantido a um mínimo. - Para começar a gravar o consumo de oxigênio, determinar a função mitocondrial através da activação e inibição da cadeia de fosforilação oxidativa utilizando substratos e inibidores, respectivamente (3 mínimo de gravações por substrato).
- Adicionar substratos utilizando seringas limpas da seguinte forma: 10 L 2 M glutamato [concentração final (fc) 0,01 M],5 uL malato 0,8 M [FC 2 mM], 20 uL de 0,5 M de adenosina difosfato (ADP) [FC 5 mM], 1 ml 1 mM de rotenona [fc 0,5? M], 20 ácido succínico ul 1M [10 mM], 1 mL 5 mM antimicina A [FC 2,5? M], 1 mL de 0,8 M ascorbato [FC 0,4 mM], e 5 ul H tetrametil-p-fenilenodiamina 0,2 (TMPD). [Fc 0,5 mM] Ao adicionar substratos para a câmara tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no sistema.
NOTA: Informações detalhadas sobre o efeito funcional induzida por cada substrato e inibidor é descrito em um protocolo publicado anteriormente 7. curvas de dose-resposta individuais podem precisar de ser gerado para determinar as concentrações óptimas dos substratos e inibidores nas Preparações / tecidos / espécies não previamente estudados. Da mesma forma, o protocolo pode ser optimizado para as tendências inatos do metabolismo do tecido / espécie a ser estudado, tais como os substratos preferenciais.
- Adicionar substratos utilizando seringas limpas da seguinte forma: 10 L 2 M glutamato [concentração final (fc) 0,01 M],5 uL malato 0,8 M [FC 2 mM], 20 uL de 0,5 M de adenosina difosfato (ADP) [FC 5 mM], 1 ml 1 mM de rotenona [fc 0,5? M], 20 ácido succínico ul 1M [10 mM], 1 mL 5 mM antimicina A [FC 2,5? M], 1 mL de 0,8 M ascorbato [FC 0,4 mM], e 5 ul H tetrametil-p-fenilenodiamina 0,2 (TMPD). [Fc 0,5 mM] Ao adicionar substratos para a câmara tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no sistema.
- Uma vez concluída a recolha de dados está, suavemente umaspirate os homogenatos cerebelares e limpar a câmara com etanol e água desionizada. , homogenatos cerebelares adicionais Uma vez limpo pode ser executado sem calibração adicional durante o tempo que a membrana de PTFE permanece intacta. Após conclusão final, eléctrodo limpos com água desionizada e etanol e armazenar com gel de sílica ou dessecante.
NOTA: Entre no mesmo dia corre, encher a câmara com água desionizada assegurar que a membrana não seque. - Usando a folha de dados criado pelo software do instrumento, a exportação de 40 min de dados de respiração começando dois minutos após a adição do substrato para um programa de planilha.
- Calcula-se a taxa de respiração por substrato ou inibidor. Normalizar os dados dividindo a respiração total, a taxa de respiração durante a adição do substrato de ascorbato-TMPD.
NOTA: A taxa de respiração pode ser adicionalmente normalizada em relação ao teor de proteína do tecido que pode ser particularmente desejável em experiências de neurodegeneraçãoem que o teor em tecido pode variar. Para o fazer, a reserva de 50 ul do homogenato da amostra (a partir do passo 9.3) para uso num ensaio de proteína padrão.
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Representative Results
Através de segmentação farmacológico da mitocôndria cerebelar com ácido succínico somos capazes de prevenir a disfunção mitocondrial em um modelo do rato do cerebelar SCA1 doença neurodegenerativa. O doador de electrões canónica de succinato desidrogenase, ácido succínico, foi dissolvido em água potável casa gaiola de ratos SCA1 durante um mês, com início avaliação comportamental durante a segunda semana de tratamento e a avaliação neuropatológico após o tratamento (Figura 1A). Tratamento ácido succínico 22 melhora o desempenho de ratinhos SCA1 como medido pelo ensaio de pegada, ensaio de feixe e acelerando ensaio de rotarod. As melhorias comportamentais detectados indica reforço da coordenação motora e aprendizagem motora (Figura 1B-D).
Resgate de desempenho comportamental foi encontrada em conjunto com a preservação da cereBellar tecido (Figura 2). tratamento ácido succínico preservada significativamente corpos celulares de Purkinje e aumento da espessura da camada molecular (indicativo da extensão do mandril dendrítica de células de Purkinje) na fissura primária do cerebelo em ratos tratados SCA1 comparação com ratinhos não tratados SCA1. Comprimento dendríticas de células de Purkinje e contagem de corpos de células de Purkinje fornecem fortes medidas de citoarquitetura cerebelar global 5.
A HPLC foi realizada no tecido do cerebelo de ratinhos tratados para verificar que o ácido succínico dissolvido na água de beber gaiola cruzado com sucesso a barreira hematoencefálica e do tecido cerebelar penetrado. Uma curva de resposta à dose variando o tempo de tratamento mais suporta ad libitum tratamento de ácido succínico como uma forma viável de atingir o tecido cerebelar (Figuras 3A-B). Nossas experiências de respiração estão em curso e os nossos resultados serão publicados em uma pesquisamanuscrito. Aqui nós mostramos que podemos com sucesso gravar a taxa de respiração através de complexos de fosforilação oxidativa cerebelar após a adição de diferentes substratos da cadeia de transporte de elétrons e inibidores (Figura 3C). Em última análise, vamos usar o ensaio de respiração para mostrar déficits fosforilação oxidativa em SCA1 cerebelo do rato ea reversão desses déficits por tratamento ácido succínico.
Figura 1: Esquema de Tratamento e dados representativos da Pegada Ensaio, Feixe de Ensaio e acelerando rotarod. (A) Ácido succínico foi dissolvido em água potável casa gaiola de ratos SCA1 durante quatro semanas começando às 17 semanas de idade. SCA1 ratinhos começam a exibir o fenótipo ataxia às 5 semanas de idade. Não é descrito no esquema são três grupos de controlo: os ratinhos de tipo selvagem tratados com ácido succínico, veculo-SCA1 ratinhos tratados de tipo selvagem e ratinhos tratados com veículo. avaliações comportamentais foram realizadas durante o período de tratamento como se segue: Ensaio de pegada durante a semana 17, o ensaio de feixe durante a semana de 18 e acelerando rotarod durante a semana de 19. Aos 20 semanas de idade, os ratos foram sacrificados e tecido cerebelar foi colhido para ensaios de imunopatologia, ensaios de HPLC e Os ensaios de respiração. (B) Os dados representativos do ensaio de pegada que mostram uma marcha tratado com veículo de tipo selvagem (em cima), tratado com veículo SCA1 marcha (meio) e um andar SCA1 tratados com ácido succínico (parte inferior). Análise de dados (C) Feixe mostrando melhoria no desempenho feixe (medida em número de ensaios para uma temporada de sucesso) de ratos SCA1 com tratamento de ácido succínico. (* P <0,05). (D) tratamento ácido succínico melhora significativamente o desempenho de rotarod a acelerar SCA1 de 22 ratinhos como mostrado pelo aumento da latência para descer (* p <0,05). As barras de erro em CD reflectir de modo o erro padrão da média. A significância foi determinada pelo one-way ANOVA e comparações múltiplas análise post-hoc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os dados representativos das contagens de células de Purkinje e camada molecular Espessura Imunopatologia Ensaios. (A) Os resultados representativos do ensaio contagens de células de Purkinje mostrando um controlo tratado com veículo transgénico cerebelar fissura primária (topo), tratado com veículo SCA1 cerebelar fissura primária (meio) e um SCA1 cerebelar fissura primária tratadas com ácido succínico (inferior) coradas para núcleos ATXN1-positivos (vermelho) e contrastadas com DAPI (azul). As linhas brancas representam as regiões 200 uM de tecidodesignado para contagens de células. Para esta análise, nomeadamente, um rato transgénico de controlo sobre-expressar um gene ATXN1 não patogénico sob o controlo de um promotor específico de células de Purkinje foi usado em vez de um ratinho de tipo selvagem porque as características de controlo transgénicos facilmente níveis detectáveis de nuclear Purkinje ATXN1 e o rato de tipo selvagem não. O mouse controle transgênica não exibe um fenótipo ataxic ou neurodegeneração cerebelar. (B) Os resultados representativos do ensaio de espessura da camada molecular mostrando um tipo selvagem fissura tratado com veículo cerebelar principal (topo), tratado com veículo SCA1 cerebelar fissura primária (meio) e um SCA1 fissura cerebelar tratadas com ácido succínico primário (inferior) coradas para calbindina , um marcador de células de Purkinje (branco). Duas das três camadas de células cerebelares pode ser visualizado com calbindina. A camada do meio de células de Purkinje (consistindo de corpos celulares de Purkinje) é visível junto com a camada molecular externa (consistindo de Purkinje cedendrites ll). A camada molecular aparece no meio da fissura primária devido às dobras naturais do tecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos da HPLC e ensaios respiração. (A) Curva padrão de concentrações conhecidas de até 250 ppm de ácido succínico diluído em tampão de acetato e representada graficamente contra a área sob o pico de HPLC medido. A equação da linha foi usada para calcular as concentrações de ácido succínico desconhecidos a partir de amostras de tecido tratadas. (B) picos de resposta à dose de ácido succínico representativos a partir de tecido do cerebelo do rato seguintes diferentes tempos de tratamento (quer 0, 1 ou 5 semanas). Sob as condiçõesdescrito, ácido succínico tipicamente eluiu entre 10 e 12 min. (C) run respiração Representante do tecido cerebelar tratado com veículo tipo selvagem mouse. A linha azul mostra a mudança na concentração de oxigênio, a linha vermelha tracejada representa a mudança na taxa de respiração ea linha vermelha sólida representa uma versão suavizada da linha tracejada. D = adição de digitonina, L / H = adição de glutamato / malato, A = adição de ADP, R = adição de rotenona, S = adição de ácido succínico, AA = adição de antimicina A e A / T = adição de Asc / TMPD. Todos os substratos foram adicionados aos tempos representados na figura e nas concentrações descritas no protocolo (passo 9.5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Se estes métodos são usados, conforme descrito, eles são capazes de detectar e aliviar a disfunção mitocondrial mediada por fosforilação oxidativa em modelos de ratos doenças neurodegenerativas cerebelares. Os ensaios bioquímicos e comportamentais combinados são métodos multifacetadas para determinar a extensão da contribuição mitocondrial para cerebelar patologia doença neurodegenerativa. Ao tratar ratos com ácido succínico para estimular o metabolismo e aumentar a função mitocondrial, somos capazes de mostrar um resgate de déficits comportamentais cerebelar e degeneração cerebelar.
A metodologia aqui apresentada pode ser usada para testar uma grande variedade de compostos metabolicamente segmentados solúveis em água para o tratamento potencial de doenças neurodegenerativas cerebelar. O ácido succínico é facilmente solúvel em água a 0,75 mg / mL, que permite a entrega simples através da água de beber gaiola e não exige a criação de peletes alimentares suplementadas. Outros solúvel em águaOs compostos podem ser facilmente substituídos para o protocolo. Se utilizar compostos metabolicamente segmentados que não são solúveis em água, a metodologia pode ser facilmente adaptada para o tratamento com peletes alimentares suplementadas 11, 12. Ao testar um novo composto, que é crítica para verificar a penetração do cerebelo do fármaco antes de se iniciar o tratamento por meio de análise por HPLC ou outro método de detecção adequado.
A bateria de avaliações patológicas foi escolhida devido à sua eficácia relatado na detecção de patologias neurodegenerativas cerebelo. As avaliações de ensaio pegada, ensaio de feixe e ensaio rotarod são amplamente utilizados da doença cerebelar neurodegenerativa incluindo vários SCAs e Friedreich de ataxia 6, 23, 24. Estas avaliações comportamentais particulares correlaciona fortemente com degeneração cerebelar. No entanto, outro BEHAVIORAl paradigmas pode ser substituído ou adicionado conforme necessário.
A marcação das células de Purkinje em ratos SCA1 com ataxina-1 e calbindina é amplamente utilizado para detectar a degeneração cerebelar em modelos SCA1 5, 20, 21. Outros anticorpos neuronais selectivos e regiões de tecido pode ser usado para visualizar a mitigação da neurodegeneração, conforme necessário.
análise da respiração é uma ferramenta poderosa para a detecção específica de disfunção ou reparação dentro de complexos mitocondriais individuais de tecido cerebelar. Deve ser tomado cuidado para minimizar o tempo entre a colheita do tecido e executar o ensaio para conseguir resultados reprodutíveis. Além disso, é importante notar a homogeneidade do tecido a ser analisado. Especificamente, o tecido cerebelar consiste predominantemente em neurónios granulares que não expressam o transgene SCA1 no nosso modelo. Portanto, um passo crítico da presenteprotocolo é para determinar se toda a respiração cerebelar é um método viável para a detecção da função do complexo oxidativo. alterações respiratórias no cerebelo do rato SCA1 transgénico pode ser sutil e pode exigir um aumento do número de indivíduos para obter resultados estatisticamente significativos.
A combinação de métodos comportamentais e neuropatológicas detalhadas neste protocolo fornecer quantificação de doença distinta SCA1 e pode detectar de forma robusta melhoria após tratamento com compostos solúveis em água. A importância deste protocolo é em sua grande capacidade de adaptação a vários tratamentos e um diversificado leque de modelos de ratos. Além disso, muitas das técnicas utilizadas neste protocolo não requer equipamento caro ou técnicas complicadas e são, portanto, adequados para um ambiente de pesquisa de graduação. As aplicações futuras deste protocolo irá ser utilizado para avaliar o grau de eficácia do tratamento no momento da entrega dependente da idade do composto.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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