Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توجه طريقة تطور في Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

التطور الموجه في خميرة الخباز يقدم العديد من المزايا الجذابة عند تصميم الانزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية، وهي عملية تنطوي على البناء، والاستنساخ والتعبير المكتبات متحولة، بالإضافة إلى ارتفاع وتيرة مثلي إعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء والمكتبات شاشة متحولة في الخميرة على أساس مثال على فطرية أريل الكحول أوكسيديز (AAO) لتعزيز نشاطها الكامل. تعرض جزأين البروتين لتطور ركزت توجيهها بواسطة الطفرات العشوائية وإعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. سمحت يتدلى من ~ 50 نقطة المرافقة كل قطعة إعادة التجميع الصحيح من الجين AAO الانصهار في ناقلات خطي مما أدى إلى كامل البلازميد تكرار مستقل. تم فحص المكتبات متحولة المخصب مع المتغيرات AAO الوظيفية في س. supernatants الخباز مع حساسية فحص عالية الإنتاجية بناء على رد فعل فنتون. عملية العامة للبناء المكتبة في س. وصف الخباز هنا يمكن تطبيقها بسهولة أن تتطور العديد من الجينات حقيقية النواة الأخرى، وتجنب ردود الفعل PCR إضافية، في المختبر إعادة التركيب الحمض النووي وربط الخطوات.

Introduction

التطور الجزيئي الموجه هو وسيلة قوية وسريعة وموثوق بها لتصميم الإنزيمات 1، 2، ومن خلال جولات متكررة من الطفرات العشوائية، إعادة التركيب والفحص، إصدارات محسنة من الإنزيمات يمكن أن تتولد التي تعمل على ركائز جديدة، في تفاعلات جديدة، في غير طبيعي البيئات، أو حتى لمساعدة الخلية لتحقيق أهداف الأيض جديدة 3-5. بين المضيفين استخدامها في التطور الموجه، والبيرة خميرة الخباز يوفر ذخيرة من الحلول للتعبير الوظيفي للبروتينات حقيقية النواة المعقدة التي لا تتوفر إلا في نظرائهم بدائية النواة 6،7.

تستخدم شاملة في دراسات بيولوجيا الخلايا، وهذا النموذج حقيقية النواة الصغيرة لديها العديد من المزايا من حيث التعديلات بعد متعدية، وسهولة التلاعب والتحول الكفاءة، وكلها صفات هامة لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه 8. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وتيرةإعادة التركيب الحمض النووي مثلي في س. الخباز بالإضافة إلى جهاز فعال في تصحيح التجارب المطبعية يفتح مجموعة واسعة من الاحتمالات لإنشاء مكتبة والتجمع الجينات في الجسم الحي، وتعزيز تطور أنظمة مختلفة من الانزيمات واحدة لمسارات صناعية معقدة 9-12. أنفقت مختبرنا العقد الماضي أدوات واستراتيجيات تصميم للتطور الجزيئي للligninases مختلفة في خميرة (إنزيم أكسدة-اختزال تشارك في تدهور اللجنين خلال تسوس الخشب) 13-14. في هذه الاتصالات، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لإعداد والمكتبات شاشة متحولة في س. الخباز لنموذج flavooxidase، أوكسيديز -aryl من الكحول (AAO 15) -، والتي يمكن ترجمتها بسهولة إلى العديد من الإنزيمات الأخرى. ويشمل البروتوكول طريقة التطور الموجه تركيزا (تحوير: الطفري المنظمة التوحد عملية كتبها مثلي في الجسم الحي التجمع) بمساعدة من جهاز خلية الخميرة 16، لدا حساس جدا الفحص الفحص بناء على رد فعل فنتون من أجل الكشف عن النشاط AAO تفرز في مرق الثقافة 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المسخ مكتبة البناء

  1. اختيار مناطق يتعرضون لتتحول مع مساعدة من خوارزميات حسابية على أساس المتاحة التركيب البلوري أو التماثل نماذج 18.
    1. هنا، استهداف منطقتين من AAO من محاري ايرنغي عن الطفرات العشوائية وإعادة التركيب (الأرصاد [α1] -Val109، Phe392-Gln566)، في حين أن تضخيم ما تبقى من الجينات (844 بي بي) عن ارتفاع الدقة PCR (الشكل 1).
      ملاحظة: عدة قطاعات يمكن دراستها عن طريق تتحول بطريقة مستقلة أو مجتمعة 16.
  2. تضخيم المناطق المستهدفة من قبل مطفرة PCR. إنشاء المناطق الواقعة بين شرائح (~ 50 نقطة لكل منهما) متداخلة عن طريق إضافة ردود الفعل PCR في مناطق محددة.
    1. إعداد مطفرة PCR من شرائح المستهدفة في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر التي تحتوي على قالب الحمض النووي (0.92 نانوغرام / ميكرولتر)، و 90 نانومتر بنسبة ضئيلة معنى (RMLN لقطاع MI وAAO-BP لشريحة M-II)، و 90 نانومتر لntisense التمهيدي (AAO-92C لقطاع MI وRMLC لشريحة M-II)، 0.3 ملي dNTPs (0.075 مم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 1.5 ملي MgCl 2، 0.05 ملي MnCl 2 و 0.05 U / ميكرولتر طق الحمض النووي بوليميريز. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في الشكل 1.
    2. استخدام البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، 74 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 74 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة).
  3. تضخيم المناطق غير مطفرة مع فائق البلمرة الإخلاص وتشمل المناطق المقابلة تداخل القطاعات تسبب الطفرات الوراثية و / أو يتدلى ناقلات خطي.
    1. تحضير مخاليط رد فعل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر تحتوي على قالب الحمض النووي (0.2 نانوغرام / ميكرولتر)، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة الشعور HFF، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة العقاقير HFR، 0.8 ملي dNTPs (0.2 ملم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) و 0.02 U / ميكرولتر iproof البلمرة DNA. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في <قوي> الشكل 1.
    2. استخدام البرنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (1 دورة)؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة).
      ملاحظة: مع الشروط الموضحة في 1.2 و 1.3 التداخل من 43 سنة مضت (المنطقة البلازميد-M1)؛ 46 سنة مضت (M1 المنطقة منطقة HF)؛ 47 سنة مضت (HF المنطقة-M2 المنطقة) و61 سنة مضت (M2 البلازميد كل إقليم) مصممة (الشكل 1) لصالح في الربط المجراة في الخميرة.
    3. تنقية كافة شظايا PCR (مطفرة وغير مطفرة) مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. خطي ناقلات بحيث مناطق ما يقرب من 50 نقطة المرافقة يتم إنشاؤها التي هي مثلي إلى 5'- و3'ينتهي من الجين المستهدف.
    1. إعداد خليط التفاعل الخطية التي تحتوي على 2 ميكروغرام الحمض النووي، 7.5 U بام مرحبا، 7.5 U Xho الأول، 20 ميكروغرام BSA و 2 ميكرولتر من الاحتياطي بام مرحبا 10X في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    2. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة و 40 دقيقة. بعد ذلك، انتقل مع تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. تنقية ناقلات خطي عن طريق استخراج هلام الاغاروز لتجنب التلوث مع البلازميد دائري المتبقية (الشكل 2).
    1. تحميل مزيج رد فعل الهضم في ميجا جيدا من شبه إعدادي انخفاض درجة انصهار agarose هلام (0.75٪، ث: •)، فضلا عن قسامة (5 ميكرولتر) من مزيج رد فعل في المتاخمة كذلك المراسل.
    2. تشغيل الحمض النووي الكهربائي (5 فولت / سم بين الأقطاب، 4 ᵒC) وفصل agarose هلام الموافق الضخمة جيدا وتخزينها في 4 ᵒC في 1X تاي.
    3. وصمة عار على حارة مع سلم الوزن الجزيئي والصحفي. تصور العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. نيك الموقف حيث متجه الأماكن خطي.
      ملاحظة: كما أن نوعية ناقلات خطي تنقيته هو critiعامل كال لإعادة التركيب الناجح والتجمع في الخميرة، وتجنب تلطيخ هلام لالكهربي الحمض النووي شبه إعدادي. استخدام الأصباغ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لاستخراج الهلام قد تؤثر على استقرار ناقلات الحمض النووي، والمساس في الجسم الحي كفاءة إعادة التركيب. كبديل لالأصباغ EtBr السامة، يتم استخدام جل الأحمر والأصباغ SYBR عادة لتلطيخ هلام.
    4. في حالة عدم وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد ناقلات خطي في جزء الضخمة جيدا باستخدام بتوجيه من النكات في حارة مراسل الملون بحيث يمكن أن تكون معزولة.
    5. استخراج ناقلات خطي من الاغاروز وتطهيره مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: استخدام نسخة عالية-ناقلات المكوك episomal مع علامات المضادات الحيوية وauxotrophy: في هذا المثال قمنا باستخدام اليوراسيل مستقل والأمبيسلين المقاومة pJRoC30 ناقلات تحت سيطرة المروج الخميرة GAL1.
  6. إعداد ميل متساوي الموليةxture من شظايا PCR ومزجها مع ناقلات خطي في نسبة 2: 1، مع ما لا يقل عن 100 نانوغرام البلازميد خطي (اختبار نسب مختلفة من مكتبة متساوي المولية / ناقلات مفتوحة لتحقيق عوائد التحول جيدة).
    1. قياس الامتصاصية من شظايا PCR وناقلات خطي في 260 نانومتر و 280 نانومتر لتحديد تركيز والنقاء.
  7. تحويل خلايا المختصة الخميرة مع الخليط الحمض النووي باستخدام عدة خميرة التحول التجاري (أنظر الجدول لوازم) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. هنا، استخدام البروتيني ناقصة وURA3 - S. تعتمد الخباز السلالة، BJ5465. تحويل الخلايا مع ناقلات circularized الوالدين كمعيار داخلي أثناء الفرز (أنظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، تحقق الخلفية من خلال تحويل ناقلات خطي في حالة عدم وجود شظايا PCR.
      ملاحظة: في حالة اكتشاف مستويات إفراز منخفضة الأولية، استخدم س.الخباز البروتيني سلالات ناقصة مثل BJ5465 لتعزيز تراكم البروتينات النشطة في supernatants الثقافة. إذا كان انزيم الهدف يخضع hyperglycosylation، واستخدام سلالات بالغليكوزيل ناقصة (على سبيل المثال، Δ kre2 التي هي قادرة على ربط الأوليغومرات المانوز أصغر فقط) يمكن أن يكون خيارا مناسبا.
  8. لوحة الخلايا تحولت على لوحات SC التسرب واحتضان لهم عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. لوحة (على SC التسرب لوحات تستكمل مع اليوراسيل) URA3 - S. خلايا خميرة تفتقر البلازميد كعنصر تحكم السلبية للفحص (أنظر أدناه).

2. عالية الإنتاجية الفحص الفحص (الشكل 3)

  1. ملء عدد مناسب من لوحات 96-جيدا العقيمة (23 وحات لتحليل مكتبة من 2000 استنساخ) مع 50 ميكرولتر الحد الأدنى من المتوسط ​​لكل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل.
  2. اختيار المستعمرات الفردية من SC التسرب لوحات وتحويلها إلى لوحات 96-جيدا.
    1. في كل لوحة، تطعيم العمود رقم 6 مع نوع الوالدين كمعيار داخلي وH1 بشكل جيد مع URA3 - S. خلايا خميرة (في المتوسط ​​SC تستكمل مع اليوراسيل) مع عدم وجود البلازميد كعنصر تحكم السلبية.
      ملاحظة: شغل حسنا H1 تحديدا مع وسائل الاعلام التسرب تستكمل مع اليوراسيل. وفارغة تحتوي كذلك وسائل الإعلام دون الخلايا يمكن أن تكون مستعدة أيضا كعنصر تحكم العقم إضافية.
  3. تغطية لوحات مع أغطية والتفاف عليها في بارافيلم. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية، 225 دورة في الدقيقة والرطوبة النسبية 80٪ في شاكر رطب.
  4. إزالة بارافيلم، إضافة 160 ميكرولتر من المتوسط ​​التعبير إلى كل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل، ختم لوحات واحتضان لهم لمدة 24 ساعة أخرى.
    ملاحظة: يتم إعداد المتوسطة الحد الأدنى والمتوسط ​​التعبير كما ذكرت في مكان آخر (19). قد تختلف مستويات إفراز اعتمادا على الجينات قيد الدراسة وفقا لذلك، رانه الحضانة يجب أن يكون الأمثل مرات في كل حالة لمزامنة نمو الخلايا في جميع الآبار.
  5. أجهزة الطرد المركزي لوحات (لوحات رئيسية) في 2800 ز س لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. نقل 20 ميكرولتر من طاف من الآبار في لوحة الرئيسي إلى لوحة المتماثلة باستخدام السائل التعامل مع multistation الروبوتية.
    ملاحظة: لصالح إفراز انزيم فإنه من المستحسن أن تحل محل الببتيد إشارة الأصلي من البروتين الهدف من الببتيدات إشارة تستخدم عادة للتعبير مغاير في الخميرة (على سبيل المثال، فإن العامل α prepro زعيم، زعيم K 1 القاتل السم من س. الخباز، أو حتى إصدارات خيالية من كلا الببتيدات 13). بدلا من ذلك، إشارة الببتيد الأصلي ويمكن أن تتطور بشكل حصري لإفراز في الخميرة.
  7. إضافة 20 ميكرولتر من 2 مم ص -methoxybenzylalcohol في 100 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 6.0 بمساعدة الروبوت pipetting ل. تحريك لوحات لفترة وجيزة مع 96-نحنليرة لبنانية لوحة خلاط واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT.
  8. مع الروبوت pipetting ل، إضافة 160 ميكرولتر من كاشف FOX إلى كل لوحة نسخة ويقلب لفترة وجيزة مع الخلاط (تركيز النهائي من FOX الخليط في البئر: 100 ميكرومتر زايلينول البرتقال، و 250 ميكرومتر الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 و25 مم H 2 SO 4).
    1. إضافة عدة إضافات إلى كاشف لتعزيز حساسية، مثل العضوية المشارك المذيبات ([دمس، والإيثانول والميثانول) أو السوربيتول 17. هنا، تضخيم الاستجابة عن طريق إضافة السوربيتول إلى تركيز النهائي من 100 ملي (الشكل 4).
  9. قراءة لوحات (وضع نقطة النهاية، ر 0) في 560 نانومتر على قارئ لوحة.
  10. احتضان لوحات في RT حتى يتطور لون وقياس امتصاص مرة أخرى (ر 1).
    1. حساب النشاط النسبي من الفرق بين القيمة المطلقة بعد الحضانة، وأنه من القياس المبدئي تطبيع لحلجنوع ntal لكل لوحة (Δt 1 - ر 0).
  11. تعرض يضرب أفضل متحولة إلى مرتين متتاليتين إعادة الفحوصات لاستبعاد ايجابيات كاذبة.
    ملاحظة: عادة، تتضمن إعادة الفحص والعزل البلازميد من الخميرة، والتضخيم والتنقية في كولاي، تليها التحول من خلايا الخميرة الطازجة مع البلازميد 19. يعاد فحص-كل استنساخ مختارة في pentaplicate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AAO من P. eryngii هو flavooxidase خارج الخلية التي تزود مستخلصات الفطرية مع H 2 O 2 لبدء الهجوم على اللجنين. تعرض اثنين من شرائح AAO إلى التطور الموجه تركز على أيدي تتحول من أجل تعزيز نشاطها والتعبير في س. الخباز 19. بغض النظر عن الانزيمات الخارجية آوى من قبل س. الخباز، فإن القضية الأكثر أهمية عند بناء المكتبات متحولة في الخميرة يتعلق هندسة المناطق المتداخلة محددة لصالح الربط بين شظايا والاستنساخ بهم في ناقلات خطي. في المثال الحالي، على كل رد فعل PCR، كان جميع أجزاء يتدلى من ما يقرب من 50 نقطة لتعزيز الربط في الجسم الحي في الخميرة. عدد الأحداث التوحد يعتمد على عدد من القطاعات ليتم تجميعها واستنساخ مع ناقل خطي (أي أخذت حدثين كروس مكان بينثلاثة قطاعات PCR -الولايات جزأين مطفرة المرافقة segment- غير mutagenized زائد اثنين عبور إضافية مع ناقلات خطي، الشكل 1). وفقا لتجربتنا، متواليات متداخلة أطول من 50 سنة مضت تقلل من احتمال إعادة التركيب الداخلي في حين أنها لا تحسن كفاءة التحول.

تم تعديل الأحمال طفرية عن طريق أخذ عينات المكتبات متحولة مع المناظر الطبيعية المختلفة، وحساب عدد من الحيوانات المستنسخة مع <10٪ من نشاط انزيم الوالدين، وكذلك التحقق منها بواسطة تسلسل عينة عشوائية من المتغيرات النشطة وغير النشطة (الشكل 5A). لتحديد معامل التباين س. تم تحويل خلايا خميرة مع AAO الوالدين ومطلي على SC التسرب لوحات. تم القبض على المستعمرات الفردية وتلقيح في بئر لوحة 96 و تم تقييم النشاط من الحيوانات المستنسخة من الاستعدادات جديدة. عينة مطفرةكانت 2 (طق / MnCl 2 0.05 ملم) التي اختيرت لتكون نقطة انطلاق لبناء مكتبة والفرز.

وبما أن النشاط البيولوجي للAAO يزيد من H تركيز 2 O 2 في وسط التفاعل، بحثنا عن فحص حساسة ودقيقة لقياس التغيرات الطفيفة في H 2 O 2. FOX هو أسلوب الكيميائية على أساس رد فعل فنتون 20، حيث الأكسدة التي كتبها H 2 O 2 محركات رد فعل من الحديد 3+ مع زايلينول البرتقالي لتشكيل مجمع الأزرق الأرجواني (س -cresolsulfone-فثالئين 3 '، 3' '- مكرر (methylimino) ثنائي الأسيتات ε 560 = 1.5 × 10 4 م -1 سم -1). تم تضخيم الخطوة الأكسدة الحديدية عن طريق إضافة السوربيتول لتعزيز حساسية مقايسة، وزيادة انتشار الجذور مع ε الظاهر 560 = 2.25 × 10 5 م -1 سم -1 (فايجوري 4).

تم احتساب الحد الكشف عن هذا الاختبار (في نطاق ميكرومتر) من خلال طريقة تحديد فارغ في لوحة 96-جيدا مع معايير (ثلاث نسخ 0، 0.5، 1، 1.5، 2، 2.5 و 3 و 4 ميكرومتر H 2 O 2 ) وباستخدام عدة supernatants من س. الخباز تفتقر إلى URA3 - بلازميد (الشكل 5B). وكان فحص خطي في وجود السوربيتول (ما يصل إلى 8 ميكرومتر من H 2 O 2)، وعلى الرغم من الخطي كان الأكثر ثباتا في حالة عدم وجود هذا النوع من السكر (على الأقل ما يصل إلى 30 ميكرومتر من H 2 O 2) كانت الاستجابة ضعيفة (على سبيل المثال، في 6 ميكرومتر من H 2 O 2، وقد حصل على تعزيز 4 أضعاف في وجود السوربيتول أعماق purple- من الامتصاصية من 0.24 في غيابها -dark أورانج (الشكل 5B)). تم تقييم العلاقة بين عبس وتركيز AAO مع كميات متزايدة من البريدوقد لوحظ nzyme (من supernatants الخميرة) والاستجابة الخطية. R 2 = 0.997 (الشكل 5C).

ومن الجدير بالذكر أن إشارة FOX كانت مستقرة لعدة ساعات دون أي تدخل واضح من قبل العناصر المختلفة في مرق الثقافة. وكانت حساسية تقدر ب FOX ~ 0.4 ميكرومتر من H 2 O 2 التي تنتجها AAO في طاف في ظل وجود السوربيتول، و~ 2 ميكرومتر في غيابها.

شيد مكتبة متحولة من 2000 استنساخ وفحص مع هذا الاختبار. وقد تم تحديد عدة طفرات AAO مع لا سيما تحسين إفراز ونشاط ضد ص -methoxybenzyl الكحول (الشكل 5D) 19.

الشكل 1
الشكل 1.. تتحول بروتوكول AAO تطور استهدفت منطقتين مختلفتين من AAO عن الطفرات العشوائية وإعادة التركيب: M1 (الأزرق، 590 بي بي) يتضمن الببتيد إشارة (SP)؛ M2 (الأصفر، 528 سنة مضت). وقد تضخمت المنطقة HF (الرمادي، 844 سنة مضت) مع بلمرة الدقة العالية. تم تعيين المناطق مطفرة في التركيب البلوري للAAO (PDB الرقم: 3FIM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. إعداد PCR المنتجات وخطي ناقل (A) هلام الاغاروز التحليلي (1٪ ث: ت). تحتوي على الوزن الجزيئي علامة (1 كيلوبايت سلم) في الممرات 1 و 7؛ وبام مرحبا وXho أنا متجه خطي، 2 لين. PCR قطاع M1، حارة 3؛ PCR قطعة M2، حارة 4؛ PCR HF الجزء، حارة 5؛ وفي الخامسايفو تجميعها ناقلات خطي مع NHE الأول (الذي يحتوي على الجينات AAO الكامل مع المناطق MI، HF و M-II)، حارة 6. (B) المتجهات الخطية، والممرات 1 و 6 معايير الجزيئية، 1 كيلو بايت سلم. البلازميد miniprep، 2 لين. البلازميد خطي مع NHE الأول، حارة 3؛ البلازميد خطي مع بام مرحبا وXho الأول، حارة 4؛ البلازميد خطي حصلت عليها استخراج الهلام وتنظيف بعد الهضم، حارة 5. (C) بروتوكول لتنقية البلازميد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. عالية الإنتاجية فحص بروتوكول لمحة عامة عن هذه العملية. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرسأيون من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. أسلوب FOX. الفطريات وايت تعفن تهاجم جدار الخلية من الخشب من خلال رد فعل فنتون التي تنتج الهيدروكسيل OH •. الأزواج طريقة FOX هذا رد فعل على زايلينول البرتقال (XO)، ويتم قياس الامتصاصية للXO الحديد 3+ المجمع في 560 نانومتر. يتم تضخيمه الحديدية أكسدة عن طريق إضافة السوربيتول إلى خليط كاشف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الطفري المناظر الطبيعية لتتحول المكتبات عن طريق الخطأ مختلفة المعرضة PCR الشروط والتحقق من الفحص الفحص. (A نانوغرام>) المناظر الطبيعية تتحول. يظهر خط أفقي صلب النشاط من نوع الوالدين في الفحص في حين أن الخطوط المتقطعة تشير إلى معامل التباين من الفحص. وتشير النسب المئوية لعدد من الحيوانات المستنسخة مع أقل من 10٪ من نشاط انزيم الوالدين. يتم رسم الأنشطة في ترتيب تنازلي. (ب) تم تقييم حد الكشف FOX مع زيادة تركيزات H 2 O 2 في حضور (الدوائر السوداء) وغياب (المربعات البيضاء) من السوربيتول. (C) الخطي العلاقة بين تركيز AAO (supernatants المحولة) وعبس 560nm. كل نقطة يتوافق مع المتوسط ​​من 8 تجارب وتشمل الانحراف المعياري. (D) متحولة المشهد المكتبة. تم rescreened المتغيرات المختارة (مظلل مربع) كما ذكرت في مكان آخر (19). يظهر خط الصلبة نشاط AAO نوع الوالدين.> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نحن لخصت معظم النصائح والحيل المستخدمة في المختبر لدينا لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه في س. الخباز (باستخدام AAO كمثال) بحيث يمكن تكييفها للاستخدام مع العديد من أنظمة انزيم حقيقية النواة الأخرى ببساطة عن طريق اتباع النهج المشترك هو موضح هنا.

من حيث إنشاء مكتبة، وتتحول بسرعة طريقة وعاء واحد لتقديم وتتحد الطفرات العشوائية في مساحات صغيرة من البروتين في حين ترك المناطق المتبقية من البروتين دون تغيير 16. المكتبات مع العديد من الأحمال طفرية يمكن إعداد بسهولة ومعاد في الجسم الحي، جنبا إلى جنب مع البلازميد خطي، لتوليد كامل ناقلات تكرار مستقل. ومن الأهمية بمكان أن متواليات متداخلة تطويق كل تمتد للسماح للشظايا من الجين كامل ليتم تجميعها من خلال إعادة التركيب في الجسم الحي، وتجنب ردود الفعل PCR اضافية وفي خطوات ربط المختبر. في هذه الصفحةrotocol، وتواتر الأحداث كروس بين شظايا PCR يمكن زيادة عن طريق تقليل حجم المناطق المتداخلة، على الرغم من أن هذا قد تؤثر سلبا على كفاءة التحول. بغض النظر عن بلمرة DNA المستخدمة في مطفرة PCR، يحمل طفرة وراثية يمكن تعديلها عن طريق بناء وتحليل صغيرة المناظر الطبيعية مكتبة متحولة (الشكل 5A) سابقا. إذا تم استخدام عدة GeneMorph الثاني، فإنه لا يزال من المستحسن أن تتبع هذا النهج منذ المجراة DNA إعادة التركيب يمكن أبرزها تعديل الأحمال طفرية يقدر من قبل الشركة المصنعة. بصفة عامة، والمناظر الطبيعية متحولة فيه 35-50٪ من مجموع الحيوانات المستنسخة فرزهم لديها أقل من 10٪ من النشاط والدية هي مناسبة لحملات التطور الموجه، على الرغم من أن هذا الرقم يختلف في وظيفة البروتين المستهدفة ونشاطها. عادة، يتم التحقق من تحليل المكتبات متحولة المناظر الطبيعية مزيد من تسلسل الحمض النووي لعينة عشوائية من المسوخ. في المثال الحالي، وطق وقد استخدم البلمرة DNA بسبب معدل خطأ عال، الذي يرتبط نقص 3'→ النشاط نوكلياز خارجية القراءة 5'proof. تم تعديل الأحمال طفرة في المكتبات طق بإضافة تركيزات مختلفة من MnCl 2، ولكن استخدام dNTPs غير المتوازنة و / أو انخفاض في تركيزات قالب الجينات أيضا خيارات مناسبة. القيود المتأصلة في تحوير تأتي من عدد القطع المراد معاد. وفقا لتجربتنا، وتصل إلى أربع كتل البروتين (خمسة أحداث كروس عد المناطق التوحد مع ناقلات خطي) ويمكن تقسم مع عوائد التحول جيدة (~ 10 5 الحيوانات المستنسخة في رد فعل التحول). هذه الطريقة يمكن تعديلها بسهولة لتنفيذ الطفرات متعددة التشبع الموقع (على سبيل المثال، وذلك باستخدام NDT الاشعال المتخلفة أو إنشاء الانحطاط لمدة 22 الكودونات فريدة من نوعها) لاستكشاف العديد من المناصب في وقت واحد في حين أن الحد بشكل كبير من جهود الفحص 21،22.

SS = "jove_content"> بروتوكول الفحص المباشر "الأعمى" لAAO حساس للغاية ويمكن الاعتماد عليها (استنادا إلى الكشف المباشر من H 2 O 2 بغض النظر عن الركيزة المستخدمة بواسطة انزيم)، وهو ما يمثل فحص مكملة لغيرها راسخة غير مباشرة بروتوكولات للكشف عن البيروكسيدات (ومعظمهم من اقتران بيروكسيديزات مع ركائز اللونية). في الواقع، وفحص FOX قد استخدمت بشكل روتيني لقياس H 2 O 2 في السوائل البيولوجية، ويمكن الآن أن تترجم بسهولة إلى بروتوكولات لتطوير AAO وأي H الآخر 2 O 2 إنتاج الأنزيمات (على سبيل المثال، oxidases الجلوكوز، أنزيم نازع للهيدروجين سيلوبيوز، الجليوآسال oxidases، والميثانول oxidases)، ولا سيما بالنسبة النشاط على ركائز غير طبيعية حيث الردود يصعب كشفه خلاف ذلك.

س الخباز هو المضيف الأنسب لالتطور الموجه للجينات حقيقية النواة لأنه يقدم كفاءة تحويل عالية (تصل إلى 1 × 106 transformants / ميكروغرام DNA)، فإنه يؤدي معقدة التجهيز والتعديلات بعد متعدية (بما في ذلك N- ومعالجة C-محطة، وارتباط بالغليكوزيل) وتصدر البروتينات الخارجية في مرق الثقافة عن طريق المسار إفرازية. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر للعمل مع هذه الخميرة، بما في ذلك ناقلات المكوك episomal أحادي أو ثنائي الاتجاه (غير تكاملية) تحت سيطرة المروجين لمختلف جوانب القوة الراسخة أدوات البيولوجيا الجزيئية. وأخيرا وليس آخرا، وقد سمح تردد عال من إعادة التركيب الحمض النووي مثلي مجموعة من الأساليب التي وضعت للحصول على التنوع الحمض النووي التي يتم استخدامها حاليا في التطور البروتينات واحدة، وكذلك مسارات انزيم أكثر تعقيدا 8، 12، 13، 23. يمكن استخدامها في الجسم الحي إصلاح الفجوة وجهاز قراءة دليل على ذلك الخميرة أيضا لخلق الوهم عند إعادة توحيد جينات مختلفة (مع حوالي 60٪ من هوية تسلسل الحمض النووي)، وكذلك لخلط أفضل ذرية / الطفرات من directeد حملة تطور، أو أن يجمع في المختبر وطرق إعادة التركيب المجراة في جولة واحدة من التطور، وبالتالي إثراء المكتبات متحولة من حيث foldability وظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 110، إخراج التطور،
توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viña-Gonzalez, J.,… More

Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter