Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

निर्देशन में विकास विधि Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

जब जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए एंजाइमों, एक प्रक्रिया है कि निर्माण, क्लोनिंग और उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की अभिव्यक्ति, विवो में उच्च आवृत्ति मुताबिक़ डीएनए पुनर्संयोजन के लिए युग्मित शामिल डिजाइनिंग Saccharomyces cerevisiae में निर्देशित विकास में कई आकर्षक लाभ प्रदान करता है। यहाँ, हम एक कवक aryl शराब oxidase (आओ) का उदाहरण अपने कुल गतिविधि में वृद्धि के आधार पर खमीर में और स्क्रीन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। दो प्रोटीन खंडों यादृच्छिक mutagenesis के द्वारा और इन विवो डीएनए पुनर्संयोजन में ध्यान केंद्रित निर्देशित विकास के अधीन थे। ~ 50 बीपी प्रत्येक खंड flanking overhangs एक linearized वेक्टर एक पूर्ण स्वायत्त नकल प्लाज्मिड को जन्म देने में आओ-संलयन जीन का सही दुबारा अनुमति दी। उत्परिवर्ती कार्यात्मक आओ वेरिएंट के साथ समृद्ध पुस्तकालयों एस में जांच की गई एक संवेदनशील उच्च throughput फेंटन प्रतिक्रिया के आधार पर परख के साथ cerevisiae supernatants। की सामान्य प्रक्रियाएस में पुस्तकालय निर्माण cerevisiae यहाँ वर्णित आसानी से कई अन्य यूकेरियोटिक जीन विकसित करने के लिए लागू किया जा सकता है, अतिरिक्त पीसीआर प्रतिक्रियाओं, इन विट्रो डीएनए पुनर्संयोजन और बंधाव कदम से परहेज।

Introduction

निर्देशन आणविक विकास एक मजबूत, तेज और विश्वसनीय एंजाइमों डिजाइन करने के लिए 1, 2 विधि है। यादृच्छिक उत्परिवर्तन, पुनर्संयोजन और स्क्रीनिंग, एंजाइमों के उन्नत संस्करण उत्पन्न किया जा सकता चलने का दौर है कि नई substrates पर कार्रवाई, उपन्यास प्रतिक्रियाओं में, गैर प्राकृतिक में के माध्यम से वातावरण, या यहां तक कि नए चयापचय लक्ष्यों को हासिल करने के लिए 3-5 सेल की सहायता के लिए। निर्देशित विकास में इस्तेमाल किया मेजबानों के बीच, शराब बनानेवाला है खमीर जटिल यूकेरियोटिक प्रोटीन है कि अन्यथा प्रोकार्योटिक समकक्षों 6.7 में उपलब्ध नहीं हैं के कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए समाधान की एक सूची प्रदान करता है।

कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन में विस्तृत रूप से प्रयुक्त, इस छोटे से यूकेरियोटिक मॉडल बाद translational संशोधनों, हेरफेर और परिवर्तन दक्षता में आसानी, जो सभी के लिए निर्देशित विकास 8 से एंजाइमों इंजीनियर करने के लिए महत्वपूर्ण लक्षण हैं के संदर्भ में कई फायदे हैं। इसके अलावा, उच्च आवृत्तिएस में मुताबिक़ डीएनए पुनर्संयोजन के cerevisiae अपने कुशल प्रूफ रीडिंग तंत्र के लिए युग्मित विवो में पुस्तकालय के निर्माण और जीन विधानसभा के लिए संभावनाओं की एक विस्तृत सरणी खोलता है, जटिल कृत्रिम रास्ते 9-12 करने के लिए एकल एंजाइमों से विभिन्न प्रणालियों के विकास को बढ़ावा देने। हमारी प्रयोगशाला में पिछले एक दशक में खर्च किया गया है खमीर अलग ligninases की आणविक इवोल्यूशन (प्राकृतिक लकड़ी क्षय दौरान लिग्निन की गिरावट में शामिल oxidoreductases) 13-14 के लिए उपकरण और रणनीतियों डिजाइन। इस संचार में, हम तैयार है और एस में स्क्रीन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश एक मॉडल flavooxidase, -aryl शराब oxidase के लिए cerevisiae (आओ 15) - यह है कि आसानी से कई अन्य एंजाइमों में अनुवाद किया जा सकता है। (: मुताबिक़ इन विवो समूह द्वारा mutagenic संगठित प्रक्रिया पुनर्संयोजन morphing) खमीर सेल तंत्र 16, एक द्वारा सहायता प्रोटोकॉल एक केंद्रित निर्देशित विकास विधि शामिलदा बहुत ही संवेदनशील स्क्रीनिंग परख आदेश आओ गतिविधि संस्कृति शोरबा 17 में स्रावित पता लगाने के लिए फेंटन प्रतिक्रिया पर आधारित है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. उत्परिवर्ती पुस्तकालय निर्माण

  1. चुनें क्षेत्रों उपलब्ध क्रिस्टल संरचना या अनुरूपता मॉडल 18 के आधार पर कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम की मदद से Morphing के अधीन किया जाएगा।
    1. इधर, यादृच्छिक mutagenesis और पुनर्संयोजन (मौसम विभाग [α1] -Val109, Phe392-Gln566), (चित्रा 1) उच्च निष्ठा पीसीआर द्वारा जीन (844 बीपी) के शेष amplifying देर के लिए Pleurotus eryngii से आओ के दो क्षेत्रों को लक्षित।
      नोट: कई क्षेत्रों में एक स्वतंत्र या संयुक्त ढंग से 16 में morphing द्वारा अध्ययन किया जा सकता है।
  2. mutagenic पीसीआर द्वारा लक्षित क्षेत्रों बढ़ाना। परिभाषित क्षेत्रों की पीसीआर प्रतिक्रियाओं superimposing द्वारा (~ 50 बीपी प्रत्येक) क्षेत्रों के बीच क्षेत्रों ओवरलैपिंग बनाएँ।
    1. 50 (0.92 एनजी / μl), 90 एनएम oligo भावना (खंड एमआई और खंड एम-II के लिए आओ-बीपी के लिए RMLN) डीएनए टेम्पलेट युक्त μl के अंतिम मात्रा में लक्षित क्षेत्रों की mutagenic पीसीआर तैयार, 90 एनएम एकntisense प्राइमर (खंड एम-II के लिए खंड एमआई और RMLC के लिए आओ-92C), 0.3 मिमी dNTPs (0.075 मिमी प्रत्येक), 3% (वी / वी) dimethylsulfoxide (DMSO), 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.05 मिमी MnCl 2 और 0.05 यू / μl Taq डीएनए पोलीमरेज़। प्राइमर दृश्यों चित्र 1 में विस्तृत रहे हैं।
    2. निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम का उपयोग करें: 2 मिनट (1 चक्र) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 45 सेकंड, 45 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 74 डिग्री सेल्सियस (28 चक्र) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; और 10 मिनट (1 चक्र) के लिए 74 डिग्री सेल्सियस।
  3. अति उच्च निष्ठा पोलीमर्स के साथ गैर mutagenic क्षेत्रों बढ़ाना और mutagenic क्षेत्रों और / या linearized वेक्टर overhangs ओवरलैपिंग इसी क्षेत्रों में शामिल हैं।
    1. जिसमें 50 μl के अंतिम मात्रा में प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: डीएनए टेम्पलेट (0.2 एनजी / μl), 250 एनएम oligo भावना HFF, 250 एनएम oligo antisense HFR, 0.8 मिमी dNTPs (0.2 मिमी प्रत्येक), 3% (वी / वी) dimethylsulfoxide (DMSO) और 0.02 यू / μl डीएनए पोलीमरेज़ iproof। प्राइमर दृश्यों में विस्तृत रहे हैं <strong> चित्रा 1।
    2. निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम का उपयोग करें: 30 सेकंड (1 चक्र) के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 10 सेकंड, 25 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस (28 चक्र) के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; और 10 मिनट (1 चक्र) के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: 1.2 में वर्णित शर्तों और 43 बीपी (प्लाज्मिड-M1 क्षेत्र) के 1.3 ओवरलैप के साथ; 46 बीपी (एम 1 क्षेत्र-एचएफ क्षेत्र); 47 बीपी (एचएफ क्षेत्र-M2 क्षेत्र) और 61 बी पी (M2 क्षेत्र- प्लाज्मिड) (चित्रा 1) खमीर में विवो splicing में पक्ष में करने के लिए तैयार कर रहे हैं।
    3. एक वाणिज्यिक जेल निकालना निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट के साथ सभी पीसीआर टुकड़े (mutagenic और गैर-mutagenic) शुद्ध।
  4. वेक्टर कि इस तरह के लगभग 50 बीपी के क्षेत्रों flanking बनाई गई हैं कि लक्ष्य जीन की 5'- और 3'-छोर तक मुताबिक़ हैं Linearize।
    1. एक linearization प्रतिक्रिया 2 माइक्रोग्राम डीएनए, 7.5 यू Bam हाय, 7.5 यू Xho मैं, बफर बा की 20 माइक्रोग्राम बीएसए और 2 μl युक्त मिश्रण तैयार करें20 μl के अंतिम मात्रा में मीटर HI 10x।
    2. 2 घंटा और 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं। बाद में, 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रियता के साथ आगे बढ़ें।
  5. Agarose जेल निष्कर्षण द्वारा linearized वेक्टर शुद्ध अवशिष्ट परिपत्र प्लाज्मिड (चित्रा 2) के साथ संक्रमण से बचने के लिए।
    1. अच्छी तरह से एक पत्रकार के रूप में आसन्न में प्रतिक्रिया मिश्रण के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक विभाज्य (5 μl): पाचन प्रतिक्रिया मिश्रण एक अर्द्ध प्रारंभिक कम पिघलने बिंदु agarose जेल के मेगा अच्छी तरह से में लोड (v 0.75%, डब्ल्यू)।
    2. भागो डीएनए वैद्युतकणसंचलन (इलेक्ट्रोड के बीच 5 वी / सेमी, 4 ᵒC) और agarose जेल मेगा अच्छी तरह से करने के लिए इसी अलग और 1x TAE में 4 ᵒC पर यह दुकान।
    3. आणविक भार सीढ़ी और पत्रकार के साथ लेन दाग। पराबैंगनी प्रकाश के तहत बैंड कल्पना। निक स्थिति जहां linearized वेक्टर स्थानों पर।
      नोट: शुद्ध linearized वेक्टर की गुणवत्ता में एक Criti हैकैलोरी कारक सफल पुनर्संयोजन और खमीर में विधानसभा के लिए, अर्द्ध प्रारंभिक डीएनए वैद्युतकणसंचलन के लिए जेल धुंधला करने से बचें। रंगों और जेल निकासी के लिए यूवी जोखिम के उपयोग के डीएनए वेक्टर की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है, इन विवो पुनर्संयोजन दक्षता समझौता किए। विषाक्त EtBr रंगों के लिए विकल्प के रूप में, जेल और लाल रंगों SYBR सामान्यतः जेल धुंधला के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
    4. पराबैंगनी प्रकाश के अभाव में, दाग संवाददाता लेन में खरोंच के मार्गदर्शन का उपयोग इतना है कि यह अलग किया जा सकता मेगा अच्छी तरह से टुकड़ा में linearized वेक्टर की पहचान।
    5. agarose से linearized वेक्टर निकालें और एक व्यावसायिक जेल निकालना निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट के साथ यह शुद्ध।
      नोट: उपयोग उच्च प्रतिलिपि एंटीबायोटिक और auxotrophy मार्कर के साथ episomal शटल वैक्टर: इस उदाहरण में हम uracil स्वतंत्र और एम्पीसिलीन प्रतिरोध pJRoC30 वेक्टर कार्यरत हैं, खमीर GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन।
  6. एक equimolar मील तैयारपीसीआर टुकड़े की xture और एक 2 पर linearized वेक्टर के साथ मिश्रण: 1 के अनुपात, linearized प्लाज्मिड का कोई कम से कम 100 एनजी के साथ (equimolar पुस्तकालय / खुला वेक्टर की कसौटी पर विभिन्न अनुपात अच्छा परिवर्तन पैदावार प्राप्त करने के लिए)।
    1. पीसीआर टुकड़े और 260 एनएम और 280 एनएम पर linearized वेक्टर के absorbance के उपाय उनकी एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण।
  7. एक वाणिज्यिक खमीर परिवर्तन किट का उपयोग डीएनए मिश्रण के साथ खमीर सक्षम कोशिकाओं को बदलने (आपूर्ति के लिए तालिका देखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
    1. निर्भर एस - यहाँ, एक प्रोटीज की कमी और URA3 का उपयोग cerevisiae तनाव, BJ5465। स्क्रीनिंग (देखें नीचे) के दौरान एक आंतरिक मानक के रूप में माता पिता का circularized वेक्टर के साथ कोशिकाओं को बदलने। इसके अतिरिक्त, पीसीआर टुकड़े के अभाव में linearized वेक्टर बदलने से पृष्ठभूमि की जाँच करें।
      नोट: प्रारंभिक कम स्राव का स्तर पता लगाने के मामले में, एस का उपयोगBJ5465 तरह cerevisiae प्रोटीज की कमी उपभेदों संस्कृति supernatants में सक्रिय प्रोटीन का संचय को बढ़ावा के लिए। लक्ष्य एंजाइम hyperglycosylation, ग्लाइकोसिलेशन की कमी उपभेदों के उपयोग की प्रक्रिया से गुजरते हैं (जैसे, Δ kre2 कि केवल छोटे mannose oligomers संलग्न करने में सक्षम है) एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है।
  8. प्लेट अनुसूचित जाति ड्रॉप आउट प्लेटों पर बदल कोशिकाओं और तीन दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं। प्लेट (uracil के साथ पूरक अनुसूचित जाति ड्रॉप आउट प्लेटों पर) URA3 - एस cerevisiae कोशिकाओं स्क्रीनिंग के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्लाज्मिड कमी (देखें नीचे)।

2. उच्च throughput परख स्क्रीनिंग (चित्रा 3)

  1. एक pipetting रोबोट की मदद से अच्छी तरह से प्रति 50 μl कम से कम मध्यम के साथ (2,000 क्लोन के एक पुस्तकालय का विश्लेषण करने के लिए 23 प्लेटें) बाँझ 96 अच्छी तरह से प्लेटों की एक उचित संख्या भरें।
  2. प्लेटों बाहर अनुसूचित जाति-बूंद से अलग-अलग कालोनियों उठाओ और उन्हें 96 अच्छी तरह प्लेटें के लिए स्थानांतरण।
    1. प्रत्येक थाली में, एक आंतरिक मानक के रूप में माता पिता का प्रकार और अच्छी तरह से URA3 साथ H1 के साथ स्तंभ संख्या 6 टीका लगाना - एस cerevisiae कोशिकाओं को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई प्लाज्मिड के साथ (अनुसूचित जाति मध्यम uracil के साथ पूरक में)।
      नोट: अच्छी तरह से एच 1 विशेष uracil के साथ पूरक ड्रॉप आउट मीडिया से भर जाता है। कोशिकाओं के बिना एक खाली अच्छी तरह से युक्त मीडिया को भी एक अतिरिक्त बाँझपन नियंत्रण के रूप में तैयार किया जा सकता है।
  3. उनकी पलकों के साथ प्लेट कवर किया और उन्हें Parafilm में लपेट। एक नम प्रकार के बरतन में 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा, 225 आरपीएम और 80% सापेक्ष आर्द्रता के लिए प्लेटें सेते हैं।
  4. Parafilm निकालें, pipetting रोबोट की मदद से एक अच्छी तरह से अभिव्यक्ति माध्यम के 160 μl जोड़ने, प्लेट reseal और एक और 24 घंटे के लिए उन्हें सेते हैं।
    नोट: के रूप में कहीं 19 सूचना मिनिमल मध्यम और मध्यम अभिव्यक्ति तैयार हैं। स्राव का स्तर और तदनुसार अध्ययन के तहत जीन के आधार पर भिन्न, टी सकता हैवह बार सभी कुओं में सेल के विकास को सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रत्येक मामले में अनुकूलित किया जाना चाहिए ऊष्मायन।
  5. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट (मास्टर प्लेट) पर 10 मिनट के लिए 2800 x जी।
  6. स्थानांतरण एक तरल रोबोट multistation से निपटने का उपयोग कर प्रतिकृति थाली करने के लिए मास्टर थाली में कुओं से सतह पर तैरनेवाला के 20 μl।
    नोट: एंजाइम स्राव के पक्ष में यह संकेत पेप्टाइड्स सामान्यतः खमीर में heterologous अभिव्यक्ति (के लिए इस्तेमाल किया द्वारा लक्ष्य प्रोटीन के देशी संकेत पेप्टाइड को बदलने के लिए सलाह दी जाती है जैसे, α कारक prepro-नेता, एस से कश्मीर 1 हत्यारा विष के नेता cerevisiae, या दोनों पेप्टाइड्स 13) की भी कैमेरिक संस्करणों। वैकल्पिक रूप से, देशी संकेत पेप्टाइड विशेष रूप से खमीर में स्राव के लिए विकसित किया जा सकता है।
  7. Pipetting रोबोट की मदद से 100 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 6.0 में 2 मिमी पी -methoxybenzylalcohol के 20 μl जोड़ें। एक 96-हम साथ संक्षिप्त प्लेटों हिलाओडालूँगा प्लेट मिक्सर और उन्हें आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. Pipetting रोबोट के साथ, प्रत्येक प्रतिकृति थाली करने के लिए फॉक्स अभिकर्मक के 160 μl जोड़ें और अच्छी तरह से में फॉक्स मिश्रण के मिक्सर (अंतिम एकाग्रता के साथ संक्षेप में हलचल: 100 माइक्रोन के xylenol नारंगी, 250 माइक्रोन के फे (एनएच 4) 2 (अतः 4) 2 और 25 मिमी एच 2 अतः 4)।
    1. अभिकर्मक के लिए कई additives जोड़ने के इस तरह के कार्बनिक सॉल्वैंट्स सह (DMSO, इथेनॉल, मेथनॉल) या sorbitol 17 के रूप में संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए। इधर, 100 मिमी (चित्रा 4) के एक अंतिम एकाग्रता के लिए sorbitol जोड़कर प्रतिक्रिया बढ़ाना।
  9. एक प्लेट रीडर पर 560 एनएम पर प्लेट (अंत बिंदु मोड, टी 0) पढ़ें।
  10. आरटी पर प्लेटें सेते हैं जब तक रंग विकसित और अवशोषण फिर मापने (टी 1)।
    1. ऊष्मायन के बाद पेट मूल्य के बीच अंतर से रिश्तेदार गतिविधि की गणना और प्रारंभिक माप की कि पारे के लिए सामान्यीकृतएक थाली के लिए ntal प्रकार (Δt 1 - 0 टी)।
  11. झूठी सकारात्मक बाहर शासन करने के लिए लगातार दो फिर से चोकर के लिए सबसे अच्छा उत्परिवर्ती हिट अधीन।
    नोट: आमतौर पर, फिर से चोकर खमीर, प्रवर्धन और कोलाई में शुद्धि से प्लाज्मिड अलगाव, प्लाज्मिड 19 के साथ ताजा खमीर कोशिकाओं के परिवर्तन के द्वारा पीछा शामिल हैं। प्रत्येक चयनित क्लोन pentaplicate में फिर से जांच की जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पी से आओ eryngii एक बाह्य flavooxidase कि एच 2 ओ 2 के साथ कवक पराक्सिडेजों की आपूर्ति लिग्निन पर हमला शुरू करने के लिए है। आओ के दो खंडों क्रम में morphing अपनी गतिविधि और एस में अपनी अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए ध्यान केंद्रित द्वारा निर्देशित विकास के लिए किए गए थे cerevisiae 19। एस द्वारा harbored विदेशी एंजाइमों के चाहे cerevisiae, सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा है जब खमीर में उत्परिवर्ती पुस्तकालयों का निर्माण विशिष्ट अतिव्यापी क्षेत्रों के इंजीनियरिंग चिंताओं टुकड़े और linearized वेक्टर में उनकी क्लोनिंग के बीच splicing के पक्ष में। वर्तमान उदाहरण में, प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, सभी टुकड़े लगभग 50 बीपी के overhangs खमीर में विवो splicing में बढ़ावा देने के लिए किया था। पुनर्संयोजन घटनाओं की संख्या निर्भर है पर क्षेत्रों की संख्या इकट्ठा किया और linearized वेक्टर के साथ क्लोन करने के लिए (यानी, दो विदेशी घटनाओं के बीच जगह ले लीचित्रा 1), तीन पीसीआर खंडों दो mutagenic गैर mutagenized segment- flanking खंडों प्लस linearized वेक्टर के साथ दो अतिरिक्त क्रॉसओवर -इस। जबकि वे परिवर्तन दक्षता में सुधार नहीं करते हमारे अनुभव के अनुसार, 50 बीपी की तुलना में अब ओवरलैपिंग दृश्यों आंतरिक पुनर्संयोजन की संभावना कम।

Mutational भार, अलग अलग परिदृश्य के साथ उत्परिवर्ती पुस्तकालयों नमूने पैतृक एंजाइम गतिविधि के <10% के साथ क्लोन की संख्या की गणना, और आगे उन्हें सक्रिय और गैर सक्रिय वेरिएंट (चित्रा 5 ए) के एक यादृच्छिक नमूना अनुक्रमण द्वारा जाँच द्वारा समायोजित किया गया। विचरण एस के गुणांक के निर्धारण के लिए cerevisiae कोशिकाओं पैतृक आओ साथ बदल गया है और प्लेटों के बाहर अनुसूचित जाति-बूंद पर चढ़ाया गया। अलग-अलग कालोनियों उठाया गया था और टीका एक साथ 96-थाली में और क्लोन की गतिविधि ताजा तैयारियों से मूल्यांकन किया गया था। mutagenic नमूना2 (Taq / MnCl 2 0.05 मिमी) पुस्तकालय निर्माण और स्क्रीनिंग के लिए प्रस्थान बिंदु के रूप में चुना गया था।

आओ की जैविक गतिविधि प्रतिक्रिया माध्यम में एच 2 ओ 2 एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में, हम एक संवेदनशील और सटीक परख एच 2 ओ 2 में मामूली परिवर्तन यों की खोज की। फॉक्स एक रासायनिक प्रतिक्रिया फेंटन 20, के आधार पर विधि है जिससे एच द्वारा ऑक्सीकरण 2 ओ 2 ड्राइव फे की प्रतिक्रिया 3 + xylenol नारंगी के साथ एक नीले, बैंगनी जटिल प्रपत्र (ओ -cresolsulfone-phthalein 3 ',' 3 '- बीआईएस (methylimino) diacetate ε 560 = 1.5 x 10 4 एम -1 सेमी -1)। लौह ऑक्सीकरण कदम परख की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए sorbitol उनका कहना है, एक स्पष्ट ε के साथ कण के प्रसार में वृद्धि से परिलक्षित किया गया था 560 = 2.25 x 10 5 एम -1 सेमी -1 (Fiआंकड़ा 4)।

इस परख की सीमा का पता लगाने (माइक्रोन रेंज में) तीन प्रतियों (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 और 4 माइक्रोन के एच में मानकों के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली में रिक्त दृढ़ संकल्प विधि द्वारा गणना की गई 2 ओ 2 ) और एस से कई supernatants का उपयोग कर प्लाज्मिड (चित्रा 5 ब) - cerevisiae URA3 कमी। परख sorbitol की उपस्थिति में रेखीय (8 एच 2 के सुक्ष्ममापी हे 2 अप करने के लिए), और हालांकि linearity इस चीनी के अभाव में और अधिक लगातार था (कम से कम अप करने के लिए एच 2 ओ 2 के 30 माइक्रोन) प्रतिक्रिया कमजोर था (जैसे, पर एच 2 ओ 2 के 6 माइक्रोन, एक 4 गुना वृद्धि इसके अभाव -dark नारंगी (चित्रा 5 ब) में 0.24 की एक absorbance से sorbitol दीप बैंगनी की उपस्थिति में प्राप्त किया गया था)। पेट और आओ एकाग्रता के बीच संबंधों को ई की मात्रा में वृद्धि के साथ मूल्यांकन किया गया थाnzyme (खमीर supernatants से) और एक रेखीय प्रतिक्रिया मनाया गया; आर 2 = 0.997 (चित्रा 5C)।

ऐसा नहीं है कि फॉक्स संकेत संस्कृति शोरबा में विभिन्न तत्वों द्वारा कोई स्पष्ट हस्तक्षेप के बिना कई घंटे के लिए स्थिर था उल्लेखनीय है। लोमड़ी की अनुमानित संवेदनशीलता ~ 2 ओ 2 एच सतह पर तैरनेवाला में आओ द्वारा उत्पादित के 0.4 माइक्रोन के था इसके अभाव में sorbitol की उपस्थिति, और ~ 2 माइक्रोन में।

2,000 क्लोन के एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय का निर्माण किया और इस परख के साथ दिखाई गई। कई आओ म्यूटेंट विशेष रूप से सुधार हुआ है स्राव और पी -methoxybenzyl शराब (चित्रा 5 डी), 19 के खिलाफ गतिविधि के साथ पहचान की गई।

आकृति 1
आकृति 1।। आओ विकास के लिए प्रोटोकॉल morphing आओ के दो अलग-अलग क्षेत्रों यादृच्छिक mutagenesis और पुनर्संयोजन के लिए निशाना बनाया गया: एम 1 (नीले, 590 बीपी) कि संकेत पेप्टाइड (सपा) शामिल हैं; M2 (पीला, 528 बीपी)। एचएफ क्षेत्र (ग्रे, 844 बीपी) उच्च निष्ठा पीसीआर के साथ परिलक्षित किया गया था। Mutagenic क्षेत्रों आओ (पी डी बी आईडी: 3FIM) के क्रिस्टल संरचना में मैप किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पीसीआर उत्पादों और linearized वेक्टर की तैयारी (ए) विश्लेषणात्मक agarose जेल (1% w: वि)। एक आणविक वजन मार्कर (1 केबी सीढ़ी) गलियों 1 और 7 में से युक्त; Bam हाई और Xho मैं linearized वेक्टर, 2 लेन; पीसीआर खंड एम 1, 3 लेन; पीसीआर खंड M2, लेन 4; पीसीआर खंड एचएफ, लेन 5; वी मेंइवो ​​reassembled Nhe मैं (क्षेत्र एमआई, एचएफ और एम-द्वितीय के साथ पूरा आओ जीन युक्त) के साथ linearized वेक्टर, लेन 6. (बी) के वेक्टर linearization, गलियों 1 और 6 आणविक मानकों, 1 Kb सीढ़ी; प्लाज्मिड miniprep, 2 लेन; Nhe मैं, 3 लेन के साथ linearized प्लाज्मिड; Bam हाई और Xho मैं, 4 लेन के साथ linearized प्लाज्मिड; linearized प्लाज्मिड जेल निकालना और पाचन के बाद साफ हुआ, लेन 5. (सी) प्लाज्मिड शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल के द्वारा प्राप्त की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल। प्रक्रिया का अवलोकन। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के आयन।

चित्रा 4
चित्रा 4. फॉक्स विधि। व्हाइट सड़ांध कवक एक फेंटन प्रतिक्रिया है कि ओह • हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी उत्पादन के माध्यम से लकड़ी के सेल की दीवार पर हमला। फॉक्स विधि युगल इस प्रतिक्रिया के लिए xylenol नारंगी (XO), और XO-फे 3 + परिसर के absorbance के 560 एनएम पर मापा जाता है। लौह ऑक्सीकरण अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए sorbitol के अलावा द्वारा परिलक्षित होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. mutagenic परिदृश्य पुस्तकालय morphing अलग त्रुटि प्रवण पीसीआर स्थितियों और स्क्रीनिंग परख के मान्यकरण उपयोग करने के लिए। (ए एनजी>) Morphing परिदृश्य। जबकि धराशायी लाइनों परख के विचरण के गुणांक से संकेत मिलता ठोस क्षैतिज रेखा परख में पैतृक प्रकार की गतिविधि से पता चलता है। प्रतिशत के माता पिता का एंजाइम गतिविधि के कम से कम 10% के साथ क्लोन की संख्या से संकेत मिलता है। क्रियाएँ अवरोही क्रम में प्लॉट किए जाते हैं। (बी) फॉक्स का पता लगाने सीमा उपस्थिति (काले घेरे) में एच 2 ओ 2 की सांद्रता बढ़ रही है और sorbitol की अनुपस्थिति (सफेद चौकों) के साथ मूल्यांकन किया गया था। आओ एकाग्रता (transformant supernatants) और पेट के बीच 560nm (सी) रैखिक संबंध। प्रत्येक बिंदु 8 प्रयोगों की औसत से मेल खाती है और मानक विचलन भी शामिल है। (डी) उत्परिवर्ती पुस्तकालय परिदृश्य। के रूप में कहीं 19 से चयनित सूचना वेरिएंट (छाया वर्ग) rescreened थे। ठोस लाइन आओ पैतृक प्रकार की गतिविधि से पता चलता है।> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अनुच्छेद में, हम टिप्स और ट्रिक्स के सबसे हमारी प्रयोगशाला एस में निर्देशित विकास द्वारा एंजाइमों के लिए इंजीनियर में कार्यरत संक्षेप है cerevisiae (आओ एक उदाहरण के रूप में उपयोग करते हुए) इतना है कि वे बस आम दृष्टिकोण यहाँ वर्णित का पालन करते हुए कई अन्य यूकेरियोटिक एंजाइम सिस्टम के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

पुस्तकालय सृजन के मामले में, morphing परिचय और छोटे प्रोटीन हिस्सों में यादृच्छिक म्यूटेशन recombine जबकि प्रोटीन अनछुए 16 के शेष क्षेत्रों छोड़ने के लिए एक तेजी से एक-पॉट विधि है। कई mutational भार के साथ पुस्तकालय आसानी से तैयार किया जा सकता है और इन विवो में recombined, linearized प्लाज्मिड के साथ साथ, एक पूर्ण स्वायत्त नकल वेक्टर उत्पन्न करते हैं। ऐसा नहीं है कि ओवरलैपिंग दृश्यों प्रत्येक खंड पूर्ण जीन के टुकड़े में विवो पुनर्संयोजन के माध्यम से पुन: संयोजित किए जाने की अनुमति देने के लिए पार्श्व, अतिरिक्त पीसीआर प्रतिक्रियाओं और इन विट्रो बंधाव चरणों में परहेज महत्वपूर्ण है। इस पी मेंrotocol, पीसीआर टुकड़े के बीच विदेशी घटनाओं की आवृत्ति, अतिव्यापी क्षेत्रों के आकार को कम करके बढ़ाया जा सकता है, हालांकि इस परिवर्तन दक्षता समझौता हो सकता है। डीएनए mutagenic पीसीआर के लिए इस्तेमाल पीसीआर के बावजूद, mutational भार पहले से निर्माण और छोटे उत्परिवर्ती पुस्तकालय परिदृश्य का विश्लेषण (चित्रा 5 ए) द्वारा समायोजित किया जा सकता है। GeneMorph द्वितीय किट का इस्तेमाल किया जाता है, यह अभी भी सलाह दी जाती है इस दृष्टिकोण का पालन करने के बाद से इन विवो डीएनए पुनर्संयोजन विशेषकर mutational निर्माता द्वारा अनुमान लगाया लोड संशोधित कर सकते है। सामान्य शब्दों में, उत्परिवर्ती परिदृश्य जिसमें 35 - जांच की कुल क्लोन का 50% माता पिता की गतिविधि के 10% से कम है, निर्देशित विकास अभियानों के लिए उपयुक्त हैं, हालांकि इस संख्या में लक्ष्य प्रोटीन और अपनी गतिविधि के समारोह में बदलता है। आमतौर पर, उत्परिवर्ती पुस्तकालयों परिदृश्य के विश्लेषण के आगे म्यूटेंट के एक यादृच्छिक नमूने के डीएनए अनुक्रमण द्वारा सत्यापित कर रहे हैं। वर्तमान उदाहरण में, Taqडीएनए पोलीमरेज़ इसकी उच्च त्रुटि दर है, जो → 5'proof-पढ़ने exonuclease गतिविधि 3'की कमी से जुड़ा हुआ है की वजह से किया गया था। Taq पुस्तकालयों में mutational भार MnCl 2 के विभिन्न सांद्रता के अलावा द्वारा संशोधित किया गया है, लेकिन असंतुलित dNTPs और / या जीन टेम्पलेट सांद्रता में कमी का उपयोग भी उपयुक्त विकल्प हैं। क्षेत्रों की संख्या से आते हैं Morphing के निहित सीमाओं recombined किया जाना है। हमारे अनुभव के अनुसार, चार प्रोटीन ब्लॉक (पांच विदेशी घटनाओं linearized वेक्टर के साथ पुनर्संयोजन क्षेत्रों की गिनती) तक अच्छा परिवर्तन पैदावार के साथ spliced ​​जा सकता है (~ परिवर्तन प्रतिक्रिया प्रति 10 5 क्लोन)। इस विधि को आसानी से किया एकाधिक साइट संतृप्ति म्युटाजेनेसिस करने के लिए संशोधित किया जा सकता है (जैसे, एनडीटी degenerated प्राइमरों का उपयोग या 22 अद्वितीय कोडोन के लिए अपकर्ष बनाने) एक साथ कई पदों का पता लगाने के लिए है, जबकि काफी स्क्रीनिंग प्रयासों 21,22 को कम करने।

"अंधा" स्क्रीनिंग आओ लिए प्रोटोकॉल अत्यंत संवेदनशील और विश्वसनीय (एच के प्रत्यक्ष पता लगाने 2 ओ 2 एंजाइम द्वारा इस्तेमाल किया सब्सट्रेट की परवाह किए बिना आधार पर) है, दूसरे को अच्छी तरह अप्रत्यक्ष स्थापित करने के लिए एक पूरक परख का प्रतिनिधित्व प्रोटोकॉल पेरोक्साइड (वर्णमिति substrates के साथ ज्यादातर युग्मन पराक्सिडेजों) का पता लगाने के लिए। दरअसल, लोमड़ी परख नियमित तौर पर एच मापने के लिए जैविक तरल पदार्थ में 2 ओ 2 नियोजित किया गया है, और यह अब आसानी से आओ और किसी भी अन्य एच 2 ओ 2 एंजाइमों के उत्पादन विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल में अनुवाद किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, ग्लूकोज oxidases, cellobiose डीहाइड्रोजनेज, glyoxal oxidases, मेथनॉल oxidases), विशेष रूप से गैर प्राकृतिक substrates जहां प्रतिक्रियाओं अन्यथा पता लगाने के लिए मेहनत कर रहे हैं पर गतिविधि के लिए।

एस cerevisiae यूकेरियोटिक जीन का निर्देश दिया विकास के लिए सबसे पर्याप्त मेजबान है, क्योंकि यह उच्च परिवर्तन क्षमता प्रदान करता है (अप करने के लिए 1 एक्स 10 को6 transformants / माइक्रोग्राम डीएनए), यह जटिल बाद translational प्रसंस्करण और संशोधनों (एन और सी टर्मिनल प्रसंस्करण, और ग्लाइकोसिलेशन सहित करता है) और यह एक स्रावी मार्ग के माध्यम से संस्कृति शोरबा में विदेशी प्रोटीन निर्यात करता है। इसके अलावा, अच्छी तरह से स्थापित आणविक जीव विज्ञान उपकरण अलग अलग शक्तियों के प्रमोटरों के नियंत्रण में विश्वविद्यालय या द्वि-दिशात्मक episomal (गैर एकीकृत) शटल वैक्टर सहित इस खमीर, के साथ काम करने के लिए उपलब्ध हैं। पिछले नहीं बल्कि कम से कम, मुताबिक़ डीएनए पुनर्संयोजन के अपने उच्च आवृत्ति तरीकों की एक श्रृंखला डीएनए विविधता है कि वर्तमान में एक प्रोटीन, साथ ही और अधिक जटिल एंजाइम रास्ते 8, 12, 13, 23 विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा प्राप्त करने के लिए विकसित किए जाने की अनुमति दी गई है। इन विवो खाई मरम्मत और यह खमीर की प्रूफ रीडिंग डिवाइस भी जब विभिन्न जीनों के पुनर्संयोजन के साथ (डीएनए अनुक्रम पहचान के लगभग। 60%) काइमेरा बनाने के लिए, साथ ही एक सीधे से सबसे अच्छा वंश / म्यूटेशन फेरबदल करने के लिए नियोजित किया जा सकताडी विकास अभियान, या इन विट्रो में और विकास के एक दौर में विवो पुनर्संयोजन तरीकों में एक साथ लाने के लिए है, जिससे foldability और समारोह के संदर्भ में उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को समृद्ध।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 110 निर्देशन विकास, ध्यान केंद्रित यादृच्छिक mutagenesis उच्च throughput स्क्रीनिंग
निर्देशन में विकास विधि<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: उत्परिवर्ती पुस्तकालय निर्माण और स्क्रीनिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viña-Gonzalez, J.,… More

Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter