Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Udarbejdelse af Rat oligodendrocyt Stamfader Cultures og Kvantificering af Oligodendrogenesis Brug Dual-infrarød Fluorescens Scanning

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53764
* These authors contributed equally

Introduction

Effektiv nerveledningen i pattedyrs centralnervesystem (CNS) kræver myelinering af axoner ved oligodendrocytter. Under udvikling, opstår oligodendrocytter fra en pulje af oligodendrocyt progenitorceller (OPCs), der menes at migrere fra de ventrikulære zoner af det udviklende forhjernen og neuralrøret 1. Efter migration OPCs differentiere til modne, myelinerende oligodendrocytter, der ikke kun lette effektiv impuls formering, men også give axoner med trofisk støtte 2. Den voksne CNS opretholder en rigelig bestand af OPCs der er spredt over hele det grå og hvid substans omfattende ca. 5-8% af alle celler 3. Efter en demyeliniserende fornærmelse, OPCs migrere til stedet for skaden, formere, og differentierer at erstatte mistede eller beskadigede myelinskeder om eksponering axoner. Men i nogle sygdom / skade indstillinger, er denne proces sig at være ineffektive eller kan svigte helt 4. Menskronisk demyelinisering menes at føje til sygdomsbyrden, effektiv oligodendrogenesis og remyelinering kan lindre symptomerne 5. Det har derfor været af interesse at undersøge OPCs in vitro for at bestemme virkningen af eksperimentelle faktorer på oligodendrogenesis.

Indsigt i de forskellige faser af oligodendrocyt differentiering er blevet muliggjort ved identifikation af fase specifikke cellemarkører. Selvfornyende tidlige progenitorceller er defineret ved deres ekspression af blodpladeafledt vækstfaktor-receptor alpha (PDGFRα), neural / glia antigen 2 (NG2) og A2B5 6 - 8. Som OPCs indleder deres differentiering program og trække sig ud af cellecyklus, de nedregulerer ekspressionen af ​​disse markører og begynder at udtrykke proteiner indikerer premyelinating oligodendrocytter herunder Cyklisk-nukleotid 3'-phosphodiesterase (CNPase) og O4. Endelig deres differentiering til mere modne oligodendrocytes er kendetegnet ved ekspressionen af ​​myelin-associerede proteiner, herunder myelin-associeret glycoprotein (MAG), proteolipidprotein (PLP), og myelin basisk protein (MBP). MBP er et intracellulært perifer membranprotein og en hovedbestanddel af myelinskeden. Mus mangler MBP udvikle en alvorlig fænotype, hvor CNS myelinering markant er faldet fører til rystelser, kramper og tidlig død 9,10. Denne vigtige rolle af MBP i myelinering har ført til dens anvendelse som en markør for oligodendrocyt differentiering både in vitro og in vivo 11.

Kvantificering af MBP kan opnås med flere forskellige metoder. RT-PCR og Western blot-analyse muliggør kvantificering af MBP niveauer under forskellige behandlingsregimer. Immuncytokemi er en fælles kvalitativ tilgang, der kan også være kvantitativ, når der anvendes kamera-baserede mikroskopi tilgange. Selv om disse systemer er pålidelige og grundlæggende forstudiet af oligodendrocyt differentiering, de hver især har deres egne ulemper, der begrænser deres anvendelse i screening narkotika. Først, mængden af ​​primære OPCs at der er behov for RT-PCR og Western blot-analyse reducerer antallet af variabler, der kan undersøges samtidig. Mens kravet cellen for immuncytokemi er meget lavere, skal betydelig tid afsættes til hvert forsøg, hvis kvantificering er målet. Talrige billeder skal opfanges og kvantificeres dernæst at lette eksperimentel analyse. Disse forbehold bliver vigtige hindringer overveje for undersøgelser, der kræver high throughput vurdering. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der udnytter grundlæggende aspekter fra både immunocytokemi og Western blot metoder til myelin kvantificering, mens en markant nedsættelse både antallet af celler, der kræves og tid til at fuldføre kvantitativ analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og Johns Hopkins School of Medicine.

1. Udarbejdelse af assayplader, Stock Solutions, og OPC Base Media

Bemærk: Rotte OPC base (Sato) medier beskrevet her er afledt af tidligere offentliggjorte undersøgelser 12,13. Alternative medier formuleringer kan også være kompatible med denne procedure.

  1. Resuspender poly-L-lysin (PLL) til en koncentration på 10 ug / ml i sterilt deioniseret vand. Pipetter 400 pi fortyndet PLL i hver brønd på en sort-walled, klar bund 24 brønd vævskulturkvalitet skålen.
  2. Coat vævskulturskåle i 2 timer i en 37 ° C vævsdyrkningsinkubator eller natten over i en 4 ° C køleskab.
  3. Aspirer PLL fra coatede skåle i mindst 20 min før udpladning. At den resterende PLL at tørre fra brønden ved at placere plader med 24 brønde med låget delvist klem i en vævskulturhætte. Kontroller, at brøndene er helt tørre, før plating isolerede OPCs. Celler vil ikke klæbe til plast, der har flydende PLL stede.
  4. Forbered N-acetyl-L-cystein (NAC) stamopløsning (1.000 x): Opløs 100 mg N-acetyl-L-cystein (NAC) i 20 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM). Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
  5. Forbered Hydrocortisone stamopløsning (1.000 x): Tilsæt 1 ml ethanol til 1 mg Hydrocortisone og hvirvel at opløse. Tilføj 19 ml DMEM, blande opløsningen, portion og opbevares ved -20 ° C. Tilsætningen af hydrocortison til basen medier har vist sig at forbedre overlevelsen af gliaceller 14.
  6. Forbered d-Biotin-stamopløsning (5,000x): Opløs 2,5 mg d-biotin i 50 ml PBS. Tilføj 1-2 x 5 ul dråber 0,1 N NaOH til støtte i opløsning. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
  7. Forbered Insulin stamopløsning (100x): Opløs 25 mg Insulin i 50 ml vævskulturkvalitet vand. Tilsæt 250 pi of 1 N HCI og bland indtil opløsningen er klar. Sterilisere med et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C i op til 6 uger.
  8. Forbered Sato stamopløsning (100x):
    1. Forbered progesteron-stamopløsning (25 pg / pl): Opløs 2,5 mg progesteron i 100 pi ethanol.
    2. Forbered natriumselenit stamopløsning (400 ng / pl): Opløs 4 mg natriumselenit i 100 pi 0,1 N NaOH. Der tilsættes 10 ml DMEM og blandes.
    3. Til 100 ml DMEM, tilsættes 1 g humant apo-transferrin, 1 g bovint serumalbumin og 160 mg putrescin og blandes til fuldstændig opløsning. Tilsæt 25 pi progesteron stamopløsning, 1.000 pi natriumselenit stamopløsning, og blandes. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
  9. Forbered OPC Base Medie: 100 ml DMEM (med 4,5 g / L D-glucose, L-glutamin og 110 mg / L natriumpyruvat), tilsættes 100 pi NAC, 100 pi hydrocortison, 20 pi d-biotin, 1 ml insulin, 1 ml Sato lager, 100 pi sporstoffer B,2 ml B-27 supplement (50x), og 1 ml penicillin / streptomycin (100x). Sterilisere med et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C.
  10. Forbered PDGF-AA stamopløsning (1.000 x): Opløs 250 ug i 12,5 ml PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) for at lave en 20 ug / ml opløsning. Alikvot og opbevares ved -80 ° C.
  11. Forbered OPC proliferationsmedier: OPC basismedium suppleret med 20 ng / ml PDGF-AA.
  12. Forbered OPC differentiering medier: OPC basismedium suppleret med 45 nM triiodthyronin.
  13. Forbered Column Buffer: Til 500 ml PBS, tilsættes 2,5 g BSA og 2 ml 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), og pH indstilles til 7,2. Sterilisere med et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C.

2. Rat Brain Dissection

Bemærk: P5-P7 rotteunger anvendes i denne protokol. Hver rotte pup cortex giver cirka 1,5-2,0 x 10 6 A2B5-positive celler.

  1. Sterilisere alle dissektion udstyr under anvendelse af en 2506; C opvarmet perle sterilisator.
  2. Tilsættes 15-20 ml PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) til 50 ml koniske rør. En 50 ml konisk rør er tilstrækkeligt til 3-4 rotte pup cortex. Placer 50 ml koniske rør på is. Brug 50 ml koniske rør til at holde tern cortex væv under dissektion.
  3. Tilføj kold PBS til en 10 cm petriskål. Denne skål vil blive anvendt til dissektion under lysmikroskop.
  4. Sacrifice rotteunger ved halshugning med store kirurgiske sakse. Spray hoved med 70% ethanol.
  5. Uddrag hele hjernen
    1. Brug en lille saks skære huden ned midterlinjen og bag ørerne og skræl hudlapper tilbage. Skær kraniet ned midterlinjen startende fra hjernestammen og slutter ved øjnene. Pas på ikke at skære for dybt for at bevare strukturen i den underliggende cortex.
    2. Lav to laterale udskæringer ringere end lillehjernen ved at indsætte små kirurgiske sakse i foramen magnum. Få et ekstra snit mellem øjnene, myreerior til de olfaktoriske pærer.
    3. Træk forsigtigt hver halvdel af kraniet tilbage. Tag hele hjernen og plads i 10 cm petriskål fyldt med kold PBS.
  6. Under dissektion lysmikroskop, fjerne olfaktoriske pærer og lillehjernen med fine kirurgiske pincet.
  7. Flip hjernen, således at den ventrale overflade er synlig under lysmikroskop.
  8. Brug af fin Lige pincet udføre en stump dissektion ved at placere lukkede pincet tips mellem cortex og hypothalamus til en dybde omkring 2/3 af hjernen. Når pincet er på plads tillader enderne til at åbne. Gentag for den anden halvkugle.
  9. Drille cortex fra hypothalamus og midthjernen regioner.
  10. Fjern hypothalamus, thalamus, og midthjernen ved at holde midthjernen ved sin bageste overflade og skrælning mod forreste ende af hjernen. Skille de anteriore forbindelser.
  11. Fjern hippocampus ved pealing den udad og derefter afskære dets forbindelse tilcortex hjælp fine bøjede dissektion pincet.
  12. Fjern resterende striatum ved ophugning det fra den underliggende cortex i en udadgående diagonal bevægelse ved hjælp af fine bøjede dissektion pincet.
  13. Fjerne alle blodkar og meninges fra den ventrale overflade af cortex.
  14. Flip hjernen, således at den dorsale overflade er synlig. Meninges og blodkar bør være indlysende. Skræl meninges fra den underliggende cortex bruger fine dissektion pincet. Start skrælning fra lugtekolben vedhæftede placering.
  15. Komplet trin 2,4-2,14 for i alt 3-4 rotteunger.
  16. Placer 3-4 dissekerede rotte hvalp cortex i en tør petriskål og hak med en steriliseret barberblad indtil 1 mm x 1 mm klumper opnås. Indsamle væv ved at skylle skål med PBS fra en 50 ml konisk rør (trin 2) derefter placere tilbage på is.

3. Enzymatisk og mekaniske Tissue Dissociation

Bemærk: Ved dette trin, anbefales en papain-baserede neurale dissociation kit. Brug Neural Dissociation Kit (P), er specielle trin, der er optimale for OPC isolation beskrevet.

  1. Forbered første dissociation enzym ved at fortynde enzym P med den passende buffer. Indholdet af hver 50 ml konisk (1 prøve) blive resuspenderes med i alt 1.950 pi enzymblanding. Sted i enzymblandingen i et 37 ° C varmt bad i 10 minutter.
    1 Sample: 1.900 pi Buffer + 50 pi papain enzym
  2. Spin alle 50 ml koniske rør indeholdende 3-4 hakkede rotte hvalp cortex ved 300 xg i 3 min.
  3. Aspirere supernatanten, og der tilsættes 1.950 pi enzymopløsning til hvert prøverør og gå i opløsning pellet ved at vende røret og forsigtig omrystning.
  4. Inkuber i et 37 ° C vævskultur inkubator i 15 min med kontinuert rør rotation.
  5. Under de sidste 5 min af inkubationen forberede det andet enzym mix A. Fortynd enzymet i sin passende buffer. vil blive tilføjet i alt 30 pitil hver 50 ml konisk prøveglas.
    1 Sample: 20 pi puffer + 10 pi enzym
  6. Når inkubationen er afsluttet tilsættes 30 pi af det andet enzym blanding til hvert rør og vend for at blande.
  7. Under anvendelse af en glas Pasteur-pipette fastgjort til en pipette controller, mekanisk dissociere vævet ved pipettering 10-15 gange eller indtil vævsstykkerne reduceres i størrelse, og opløsningen er blevet uklar. Returnere prøven til 37 ° C vævskultur inkubator i 15 min med kontinuerlig rotation.
  8. Pipette hver vævshomogenat prøve 10-15 gange ved anvendelse af en 1 ml pipette.
  9. Pipette hver vævshomogenat prøve 15-20 gange ved anvendelse af en 200 pi pipette
  10. Returnere alle prøverne til 37 ° C vævskultur inkubator i 10 min med kontinuerlig rotation.
  11. Der tilsættes 10 ml PBS (med Ca2 + og Mg2 +) til hver prøve og filtrere homogenatet gennem en 40 um pore filter placeret over en 50 ml rør. Filteret skylles med yderligere 1-2 ml PBS.
  12. Pool hele af homogenatet prøver til en 50 ml konisk rør og erhverve et samlet celletal.
  13. Efter udførelse af celletal, opdele homogenatet jævnt i 15 ml koniske rør (1 rør for hver prøve). Centrifuger i 10-12 min ved 300 x g.

4. Anti-A2B5 Bead Application, kolonne Rensning og Plating

  1. Udføre beregninger for søjlepuffer og anti-A2B5 mikroperler. Tilsættes 7 pi Column Buffer for hver 1 x 10 6 celler. Tilsæt 2 ul Anti-A2B5 mikroperler for hver 1 x 10 6 celler.
  2. Kombiner alle prøverne ved at resuspendere cellerne i et totalt volumen på 10 ml søjlepuffer og centrifugeres ved 300 xg i 10-12 min.
  3. Resuspender cellepelleten i den passende mængde af søjlebuffer som beregnet i trin 4.1. Hvis pelleten er stort og løs, tilsættes kun omkring halvdelen af ​​volumenet af kolonnen puffer til at holde antikrop i den rigtige koncentration i cellen resuspension.
  4. Inkubér cellesuspensionen i 10 minutter ved 4 ° C.
  5. Tilføj anti-A2B5 mikroperler (beregnet i trin 4.1) vendes flere gange og inkuberes ved 4 ° C i 30-60 min. Vend forsigtigt røret flere gange hver 10 min. Længere inkubationstider kan øge celleudbytter men kan øge ikke-specifik binding.
  6. Tilsæt 5 volumener søjlepuffer. Hvis cellerne resuspenderes i et volumen på 1 ml, tilsættes 5 ml søjlepuffer, hvorimod hvis cellerne resuspenderes i 2 ml, tilsættes 10 ml søjlepuffer.
  7. Centrifuger i 10 minutter ved 300 x g.
  8. Bestem hvor mange LS kolonner vil være behov for rensning. En LS-søjle er tilstrækkeligt til 15-20 x 10 6 totale celler.
  9. Resuspender cellepelleten i 1000 pi søjlepuffer pr LS-søjle, der anvendes.
  10. Prime hver LS kolonne ved tilsætning af 5 ml søjlepuffer. Opsaml gennemstrømningen i et 50 ml konisk rør. Når kolonnen buffer har fuldstændig passeret gennem det øvre kammer, anvende 1.000 pi af cellesuspensionen til hver kolonne og tillade cellerne at køre gennem ved hjælp af tyngdekraften.
    Bemærk: Hvis densiteten af ​​celler er for høj, kan søjlen køre langsomt.
  11. Umiddelbart efter cellesuspensionen har passeret gennem søjlen, langsomt tilsættes 3 ml søjle buffer til hver kolonne for at vaske ubundne celler. Hvis vasken let løber gennem søjlen (1 dråbe for hver 30-45 sek), vask to yderligere gange med 3 ml søjlepuffer.
  12. Fjern hver kolonne og placere den på en 15 ml konisk rør. Der tilsættes 5 ml søjlepuffer og styrte pufferen gennem søjlen med en hurtig hastighed ved hjælp af den plast stempel, som er pakket med søjlen. Fremryk vil løsne bundne celler frigør dem fra søjlen.
  13. Øge renheden ved at køre prøven gennem en anden runde af LS kolonner. Brug en tredjedel af antallet af anvendte kolonner under den første passage. Prime kolonnerne med 5 ml søjlepuffer.Tillad søjlepuffer at passere gennem det øverste kammer.
  14. Eftersom volumenet af cellesuspensionen vil være meget større, jævnt anvende 1.000 pi cellesuspension til hver kolonne og tillade suspensionen at passere gennem det øverste kammer af søjlen før efterfyldning med yderligere 1.000 pi.
  15. Når cellesuspensionen er blevet fuldstændig påført på anden runde af kolonner, vaskes 2-3 gange med 3 ml søjlepuffer.
  16. Fjern hver kolonne og placere det over en steril 15 ml konisk rør. Der tilsættes 5 ml søjlepuffer og styrte bufferen ved hjælp af plast stempel, som er pakket med søjlen. Fremryk vil løsne bundne celler frigør dem fra søjlen.
  17. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 xg i 12-15 min. Pillen skal vises kompakt.
  18. Resuspender cellepelleten i 5-10 ml forvarmet OPC proliferationsmedier (OPC basismedium suppleret med PDGF-AA 20 ng / ml).
  19. Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Plate cellerne. Fortynd cellerne til 60.000 celler / ml med OPC proliferationsmedier. I hver sort, klar bund 24 brønd, pipette 500 pi celler langs siden af ​​brønden for at opnå 30.000 celler pr. Bland cellerne ved at ryste pladen vandret ved hjælp af et ottetal bevægelse. Hvis der udføres assayet i 48, 96 eller 384 brønde, tilsæt 15.000, 7.500, eller 1.500 celler pr henholdsvis. Disse tal kan justeres afhængigt af individuelle plade specifikationer.
  20. Forbered en separat plade til Dag 0 baseline kontrolkulturer. Denne kontrol plade bør fastsættes med 4% paraformaldehyd som beskrevet i afsnit 5.7, når differentiering påbegyndes på dag 0.
  21. Dyrke cellerne i OPC proliferationsmedier ved 37 ° C i 3 dage uden skift af medium.

5. Induktion af OPC Differentiering og fiksering med 4% paraformaldehyd

Bemærk: Ved test effekten af ​​små molekyler på oligodendrogenesis, vi rutinemæssigt dissolve narkotika i dimethylsulfoxid (DMSO) til fremstilling af 1.000 x bestande, som derefter kan opbevares ved -80 ° C og fortyndet direkte ind SATO medier til opnåelse af en slutkoncentration på 0,1% DMSO. Vi har observeret nogen ændringer i enten OPC proliferation eller differentiering ved hjælp af denne koncentration af DMSO (data ikke vist).

  1. Pre-varme OPC basis medier til 37 ° C og tø narkotikabehandling lagre til stuetemperatur. Når du udfører behandlinger i to eksemplarer, forberede ca. 1,25 ml medium per behandlingsgruppe i et 1,5 ml rør. For tredobbelte prøver, bruge 2 ml kapacitet centrifugerør at tage højde for slap.
  2. Forbered behandlingen masterblandinger for replikatbrønde ved at fortynde behandling lagre direkte i OPC basen medier. Kort vortex eller forsigtigt blande hver Mastermixen at sikre homogen fordeling af behandlingen.
  3. Forbered 45 nM triiodthyronin (T3) som den positive kontrol og den passende vehikel som den negative kontrol. Fortynd 10 mM T3 lager1: 1.000 i 1 ml OPC basismedium og derefter fortynde yderligere i behandlingen mastermix for at reducere slutkoncentrationen af ​​DMSO om nødvendigt.
  4. Aspireres mediet fra dyrkningsbrønde én behandling gruppe ad gangen for at undgå tørring af cellerne. Brug en 200 pi pipettespids på enden af ​​glasset Pasteur-pipette for at undgå afskrabning sort materiale fra siderne af brønden og ind i kulturen.
  5. Langsomt tilsættes 500 pi behandling mastermiksens langs siden af ​​brønden under anvendelse af en 1 ml pipette.
  6. Inkuberes kulturerne for den ønskede tidsramme, udfører en fuld medier udveksling med frisk behandling medier hver 2-3 dage. Vi rutinemæssigt observere en 30-40% MBP + kultur efter 4 dage i differentiering medier.
  7. Ved afslutningen af ​​den ønskede behandlingsperiode, lav en frisk 4% paraformaldehyd (PFA) eller tø en frossen stamopløsning til stuetemperatur. ADVARSEL: PFA er ekstremt giftigt, og skal udarbejdes i et stinkskab.
  8. Aspireres medierne og tilsæt langsomt 4001 l af PFA til siden af ​​brønden for at fikseres cellerne. Inkubér pladen i 20 minutter ved stuetemperatur.
  9. Aspirere PFA og tilsæt langsomt 500 pi sterilt D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) til siden af brønden for at vaske cellerne. Gentag vask i alt to gange mere. Må ikke aspirere den sidste vask.
  10. Pak pladen i parafilm og opbevares ved 4 ° C til senere behandling eller gå direkte til næste trin. Plader kan lagres i flere uger.

6. Immuncytokemi og Kvantificering af myelin basic protein

Bemærk: Når du udfører procedurer flydende håndtering i de brønde 24, anbefales det at arbejde hurtigt for at undgå tørring af cellerne. Her er brugen af ​​en multi-kanal vakuum aspirator og multi-kanal pipette anbefales.

  1. Bringe pladen til stuetemperatur, opsug brøndene, og der tilsættes 250 pi D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) indeholdende 0,1% Triton X-100 og 5%normalt gedeserum (NGS). Inkubér pladen ved stuetemperatur i 1 time under forsigtig orbital rystning.
  2. Forbered primære inkubering ved at fortynde monoklonalt muse-anti-MBP-antistof 1: 1.000 og kanin polyklonalt anti-Actin-antistof 1: 200 i D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) indeholdende 5% NGS. Alternativt kanin polyklonalt anti-Olig2 ved 1: kan 1.000 anvendes til oligodendrocyt specifik normalisering i blandede gliale kulturer. Forbered nok primære løsning til at rumme 250 pi per brønd.
  3. Inkuber primære antistoffer ved 4 ° C natten over i 16-18 timer under forsigtig orbital rystning.
  4. Aspirere den primære inkubering opløsning og vaske cellerne 3 x 10 min med 500 pi D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) ved stuetemperatur under forsigtig orbital rystning.
  5. Mens vaske pladen, forberede den sekundære inkubation ved at fortynde anti-muse 680 og anti-kanin 800-antistoffer 1: 500 i D-PBS (med Ca2 + Mg2 +) indeholdende 5% NGS. Minimer omgivende eksponering lys, når udarbejdelsen af ​​denne løsning.
  6. Aspirere den sidste vask, og der tilsættes 250 pi sekundær inkubation opløsning. Beskytte pladen mod lys og inkuber det ved stuetemperatur i 1 time under forsigtig orbital rystning.
  7. Aspirer sekundære inkubering opløsning og vaske brøndene 3 x 10 min med 500 pi D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) ved stuetemperatur under forsigtig orbital rystning.
  8. Scan pladen under anvendelse af et billedbehandlingssystem stand til at detektere 700 nm og 800 nm fluorescens-emissioner. Som udgangspunkt, skal du indstille omdrejningspunktet offset til 3 og følsomheder til 1,5 for MBP, 5,0 for Actin, og 3.5 for Olig2. Juster følsomhed værdier efter behov for at undgå signal overeksponering.
  9. Opgøre oligodendrogenesis hjælp semi-automatiske software-baserede metoder.
    1. Brug af softwaren, skal du indstille pladen analysen til "24 Well" og tilpasse cirkler omkring than ydre perimeter af de scannede brønde. Indstil normalisering kanalen til "800", og eksportere de samlede og relative fluorescensintensiteter for 700 nm (MBP) og 800 nm (Olig2 / Actin) kanaler.
    2. Opdele intensitet ved 700 nm af intensiteten ved 800 nm til opnåelse af normaliserede MBP-ekspression i relative fluorescensenheder. Beregn gennemsnittet af gentagne målinger og skalere udtrykket til Dag 0 + PDGF kontrol efter behov for analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A2B5-positive OPCs isoleres gennem positiv celleselektion under anvendelse af en magnetisk søjle separationssystem. Forud for isolation procedure, er hele hjernen fjernet fra rotteunger, der er mellem P5 og P7. Når hele hjernen er lykkedes løsrevet fra kraniet, er det olfaktoriske pærer og cerebellum fjernes med fine kirurgiske pincet (figur 1A). For at isolere cerebral cortexvæv hypothalamus, thalamus og midthjernen udskæres ved omhyggelig dissektion (figur 1B). Dernæst hippocampus og striatum fjernes med bøjede kirurgiske pincet (figur 1C - D). Isoleringsprocessen effektivt eliminerer meningeal og fibroblastceller, men enzymatisk fordøjelse forbedres, når meninges og kar er fjernet (figur 1E). Endelig vævsblokke på 1 mm x 1 mm forberedt til de efterfølgende væv dissociation trin (Figure 1F).

En god OPC isolation bør resultere i en kompakt cellepellet efter den endelige centrifugering trin (figur 2A). Når belagt disse kulturer vil være relativt fri for cellerester, når de ses under et mikroskop (figur 2B). En suboptimal isolation kan resultere i en stor og fluffy pellet som følge af tilstedeværelsen af ​​store mængder cellulært debris. Snavset vil klæbe kraftigt til PLL-overtrukne fartøj og kan interferere med kultur (figur 2C). Hvis et stort og luftigt pellet indtræden, kan det hjælpe at opblande cellerne i 10 ml PBS og gentag slutcentrifugeringen i 10 min ved <300 x g. Når isoleringen er færdig, kan renheden af ​​kulturerne vurderes ved flowcytometri for at identificere procentdelen af ​​A2B5-positive celler. En vellykket isolering bør resultere i en pulje af celler, som er> 95% positive for A2B5 (figur 2D - F). Sammenlignet med celler farvet med et fluorescerende farvestof-konjugeret anti-A2B5-antistoffet, bør ufarvede celler er en negativ befolkning og kan bruges som en basislinie reference for gating. Desuden har vi tidligere vist, at udvælgelsen af OPCs hjælp af A2B5-antigen udbytter kulturer, der farves positive for PDGFRα ved immuncytokemi 11.

Som påvist ved immuncytokemi OPCs i begyndelsen af behandlingen (dag 0) er Olig2 + / MBP - mens celler er Olig2 + / MBP + af Dag 4 (figur 3). Den optimale konfluens på OPCs og oligodendrocytter på dag 0 og dag 4 er vist i repræsentative lyse felt billeder (figur 4A). Fraværet af MBP udtryk på dag 0 fungerer som grundlinje til kvantificering oligodendrogenesis. Spontan differentiering som følge af PDGF-AA tilbagetrækning tjener som en negativ kontrol, mens 45 nM thyroidhormon (triiodothyronine; T3) kan anvendes som en positiv kontrol 11,15. Quetiapin, også kendt som Seroquel, og clemastin, også kendt som Tavist, er FDA-godkendte lægemidler, der har vist sig at accelerere in vitro oligodendrogenesis og kan anvendes som ekstra positive kontroller 16,17. Figur 4B viser et repræsentativt to-kanals infrarød fluorescerende scanning viser de forventede resultater for hver af disse betingelser i tre eksemplarer. Actin og MBP signaler blev pseudocolored grøn og rød henholdsvis så stærkt differentierede kulturer synes gul i flettede billeder. Resultaterne viser, at MBP udtryk på dag 4 i PDGF tilbagetrækning tilstand var 4,5 ± 1,4 gange højere i forhold til dag 0, mens fold ændringer i MBP på grund af behandling med thyreoideahormon, quetiapin, og clemastin var 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 og 32,8 ± 0,5 (figur 4C). Robusthed og nøjagtighed af assayet demonstreres af SMalle standardafvigelser blandt tredobbelte prøver og det store behandling aktivering vindue, der er omkring 20 standardafvigelser over PDGF tilbagetrækning kontrol.

Mens Actin tjener som en pålidelig reference gen for normalisering i oligodendrocyt kulturer, kan alternative reference- gener også anvendes. Olig2 er en nuklear transkriptionsfaktor, udtrykkes konstitutivt i celler af oligodendrocyt afstamning. Dens særlige og konstitutiv ekspression mønster kan således tilvejebringe en mere foretrukket normalisering strategi i heterogene kultur situationer. Figur 5 viser, at i OPC kulturer differentierede med 10 nM thyreoideahormon den beregnede gange ændring i MBP-ekspression i forhold til PDGF tilbagetrækning er den samme ved brug af enten Olig2 eller Actin til normalisering. Formentlig eftersom OPC kulturer i dette forsøg var meget ren, begge proteiner kan anvendes pålideligt til normalisering. Men vi oftenn observere en lille population af Olig2-negative celler ved Dag 4, men forholdet mellem denne population til Olig2-positive population synes ikke at afvige væsentligt mellem PDGF tilbagetrækning og T3 behandlede gruppe. Således er fold-changes ikke påvirket. Givet et scenario, hvor en behandling kan forårsage spredning af Olig2-negative celletyper, bør valget af normalisering antistof overvejes nøje.

Figur 1
Figur 1:.. Rat hjerne dissektion procedure Trinvis beskrivelse af dissektion procedure Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Flowcytometrianalyse af isoleretOPCs. (A) efter magnetisk søjlerensning det bundne cellepopulation kastet ud af kolonnen og centrifugeret til dannelse af en kompakt pellet. Mængden af ​​rester er indikeret ved størrelsen af ​​pellet. (B) Hvis pillen er kompakt, så snavs vil være minimal i kulturen. (C) En stor og fluffy pellet resulterer typisk i en kultur med kraftigt affald. Renheden af ​​kulturen bestemmes ved flowcytometri under anvendelse af et rotte-anti-muse A2B5 antistof, som er konjugeret til APC. (D) Døde celler og rester er udelukket fra analysen, som vist i forward scatter og side scatter plots. (E) Den A2B5 positive population kan bestemmes ved hjælp af en ufarvet samplet som en baseline reference for gating. (F) Succesfuld isolerede OPCs bør være> 95% positive for A2B5. Klik her for at viewa større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. OPC kultur og differentiering Proceduren for dual-infrarøde fluorescens-scanning (DIFS) assay begynder med frisk isolatedA2B5-positive rotte OPCs forgyldt på PLL-coatede dyrkningsflasker (dag 3). Disse kulturer prolifereres i 3 dage i nærvær af 20 ng / ml PDGF-AA, og derefter behandlet med eksperimentelle faktorer i frisk PDGF-frie medier på dag 0. Behandling medier er fuldt forsynet på dag 2, og cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd på dag 4. Immuncytokemi for Olig2 (grøn) og MBP (rød) blev udført på repræsentative kulturer på dag 0 og dag 4 ved anvendelse Dapi (blå) som et nukleart counter plet. Disse kulturer udviser konstitutive farvning for den pan oligodendrocyt afstamning celle markør Olig2 på Days 0 og 4, mens farvning for den modne oligodendrocyt markør MBP er kun evident ved Dag 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: MBP kvantificering ved hjælp af dual-infrarøde fluorescens-scanning (DIFS) assay (A) Densiteten af OPC-kulturer på dag 0 og dag 4 ønsket til optimal assay ydeevne.. (B) Repræsentative dual-infrarøde fluorescens scanninger. OPCs blev differentieret i 24-brønds plader i 4 dage i nærvær af 45 nM T3, 1 uM quetiapin, 1 uM clemastin, eller 0,1% DMSO i tre eksemplarer. En separat plade indeholdende OPCs der blev fikseret på dag 0 (+ PDGF) blev behandlet parallelt. Actin (pseudocolored grøn) og MBP (pseudocolored rød) blev samtidigt kvantificeret under anvendelse af et Licor Odyssey scanner indstillet til påvisning 700 nm og 800 nm emission. ( Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Olig2 er en sikker reference protein til normalisering MBP-ekspression i oligodendrocytter OPCs blev differentieret i tre eksemplarer under tilstedeværelse af 10 nM T3 eller 0,1% DMSO vehikelkontrol i 24-brønds plader i 4 dage.. Dual-infrarøde fluorescens-scanning assay blev udført under anvendelse af anti-Olig2 eller anti-actin-primære antistoffer til normalisering. Olig2 / Actin og MBP blev samtidigt kvantificeret under anvendelse af et Licor Odyssey scanner indstillet til påvisning 700 nm og 800 nm emission. MBP-ekspression var ingenrmalized til enten Olig2 eller Actin udtryk, og resultaterne blev skaleret til DMSO kontrol 0,1%. De gennemsnitlige relative fluorescensenheder ± SD blev afsat under anvendelse af GraphPad Prism 6. Resultaterne viser, at den beregnede fold-ændring er den samme, når normalisere til nogen af ​​de to referenceproteiner.

Figur 6
Figur 6:. Virkning af Triton X-100 på MBP farvning OPCs blev differentieret i 24-brønds plader i 4 dage i nærvær af 45 nM T3 eller 0,1% DMSO. Kulturerne blev derefter fikseret med 4% PFA og farvet for Olig2 og MBP under anvendelse af to forskellige immuncytokemi protokoller. For den høje Triton X-100 prøve blev cellerne permeabiliseret i 1 time med 0,4% Triton X -100 og alle antistof-inkubationstrin blev udført i nærvær af 0,1% Triton X-100. For den lave Triton X-100 prøve blev cellerne permeabiliseret i 1 time med 0,1% Triton X-100, mens Antibody inkubationer blev udført uden Triton X-100. Olig2 og MBP blev visualiseret med fluorescerende farvestof-konjugeret sekundærviklinger og billeder blev erhvervet ved hjælp af et kamera-baserede fluorescens mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteres her beskriver en hurtig og pålidelig fremgangsmåde til isolering rotte OPCs og kvantificere in vitro oligodendrogenesis som reaktion på eksperimentelle faktorer. Ved hjælp af positiv selektion, er høje udbytter af levedygtige og rene OPCs anvendes direkte til forsøg. Denne metode strømliner isolation, dyrkning og differentieringsfaktorer skridt ind en 1 uge tidsramme, og fikserede celler kan hensigtsmæssigt opbevares ved 4 ° C i adskillige uger uden tab i analysesensitivitet.

En stor fordel med scanner-baserede fluorescensanalyser er, at indsamling og analyse af data er stærkt fremskyndet versus traditionelle kamera-baserede mikroskopi teknikker. Selvom mikroskopi har været anvendt med succes i high-throughput skærme til at identificere inducere af OPC differentiering, datafangst er i sagens natur langsommere, fordi det kræver programmering af billedoptagelse sekvenser, flere timers dataindsamling, analyse af hundreder til thousands af billedfiler, og brugerdefinerede algoritmer til at skelne de enkelte celle organer for normalisering eller analyse 18,19. Desuden vil der med kamera-baserede mikroskopi systemer er det ikke muligt at erhverve data fra hele overfladen af ​​dyrkningsbeholderen. I stedet skal repræsentative billeder opfanges fra forskellige områder inden for en enkelt brønd, som kan føre til positionelle bias og falsk-positive hits. Til sammenligning dette assay detekterer MBP ekspression fra alle celler i en given brønd, og flere plader kan scannes samtidigt. Selv om denne fremgangsmåde kan tilpasses til anvendelse i 96-brønds eller 384-brønds formater, kan plade 24-brønd foretrækkes, når færre behandlinger bliver testet. Vi har observeret, at celletab i 24-brønds plade grund væskehåndtering minimeres, hvilket er en komplikation, der bør overvejes ved udformning højere throughput eksperimenter.

En kritisk parameter af assayet er massefylden af ​​cellerne, når differentiation initieres ved dag 0. Kulturer med for få celler synes at differentiere langsommere og dør, mens høj densitet kulturer udviser spontan differentiering. Begge situationer kan reducere dynamikområdet og pålideligheden af ​​assayet. For at opnå en optimal balance mellem celle sundhed og celledensitet, vi dyrke OPCs i 3 dage uden et medie ombytning eller supplering af frisk PDGF-AA. Vi antager, at da koncentrationen af PDGF-AA i medierne falder med Dag 3 in vitro (dag 0) som et resultat af cellulær katabolisme, vil den proliferative sats af cellerne langsomt sådan, at spredningen mindskes gennem den første dag i PDGF AA tilbagetrækning. Denne teknik fungerer bedst, når cellerne er jævnt fordelt i løbet af plating. Pipettering af cellerne langs siden af ​​brønden og blande dem ved hjælp af en ottetal bevægelse skal fremme en jævn fordeling. Afpipetteres centrum af brønden tendens til at producere klynger af celler rundt om kanterne på godt med fåER celler klæber til centrum. Dette fænomen kan skyldes forstyrrelse af frisk tørret PLL lag ved flydende pipetteringstrin kræfter. Akkumulering af celler omkring omkredsen kan reducere analysesensitivitet grund af densitet-afhængig differentiering. Det er vigtigt at bemærke, at kan forekomme betydelige forskelle i intensiteten af ​​Actin / Olig2 signalet mellem lægemiddelbehandlede og kontrol, PDGF tilbagetrækning kulturer. Signifikant nedsat Actin / Olig2 signal kan indikere lægemiddeltoksicitet, mens væsentligt forøget Actin / Olig2 signal kan indikere narkotika proliferation. Vi observerer normalt en lidt højere Actin / Olig2 signal fra celler behandlet med pro-differentierende lægemidler sammenlignet med PDGF tilbagetrækning kontroller. Vi tilskriver denne forskel til en højere spontan apoptose i PDGF tilbagetrækning gruppe over differentiering procedure 4 dage. Ved vurderingen oligodendrogenesis, normalisering af MBP til actin / Olig2 bør korrigere for celle nummer forskelle. For at vurdere toxiby og proliferation under anvendelse af dette assay kan det anti-MBP-antistof ombyttes til primære antistoffer rettet mod de passende markører.

Når eksperimenter kræver både kvantitativ og kvalitativ vurdering, er det vigtigt at begrænse eksponeringen af ​​de faste rotte oligodendrocyt kulturer til Triton X-100, når du bruger 4% PFA at fastsætte cellerne. Andre immuncytokemi protokoller for oligodendrocyt kulturer, der typisk indbefatter Triton X-100 i begge de antistof inkubationstrin at forbedre antistofepitop tilgængelighed, kan anvendes med succes afhængigt af eksperimentelle krav. På den anden side, selv om MBP er et intracellulært protein, kan det være muligt at udelukke Triton X-100 helt, hvis alternative fiksering metoder anvendes der i tilstrækkelig grad permeabilisere cellerne. Anvendelse af betingelserne beskrevet her, har vi observeret, at Triton X-100 påvirker den observerede morfologi af oligodendrocytter samt lokalisering af MBP farvningnår de anvendes i høje koncentrationer. Vi kan ikke se en betydelig nedgang i antistoffarvning da Triton X-100 er udeladt fra antistof inkubationstrinnene. Som vist i figur 6, herunder 0,4% Triton X-100 i permeabilisering og blokering trin, og 0,1% Triton X-100 i løbet antistof inkubation reducerer påvisning af myelin processer og resulterer i diskontinuerlig MBP farvning. Derfor, for kvantitativ og kvalitativ vurdering kan det være tilstrækkeligt at anvende en lavere koncentration af Triton X-100 som beskrevet her.

Mens anvendelsen af ​​A2B5-udvalgt OPCs fra rotter kan være fordelagtigt, har vi observeret sammenlignelige resultater i dobbelt-infrarøde fluorescens-scanning (DIFS) assay under anvendelse af A2B5-valgt OPCs fra C57BL / 6-mus, selv om celle udbytte pr mus typisk er meget lavere (data ikke vist). Andre protokoller for OPC rensning kan også være kompatible med denne analyse. For eksempel kan oligodendrocyt markør O4 anvendes som et antigen til at oprense intermediate fase oligodendrocyt forstadier under anvendelse af magnetiske perler 20. Som et alternativ til magnetisk-baserede metoder, kan OPCs blive beriget fra 9 dage gamle blandede gliale kulturer indeholder astrocytter og mikroglia af hi-speed orbital ryster og differentieret vedhæftning metoder 21. Endvidere immuno-panorering procedurer, som inkorporerer både negativ og positiv celleselektion kan anvendes, hvis kulturrenhed foretrækkes ved høj celleudbytter 22. Ud over at undersøge, hvordan lægemidler kan direkte øge differentieringen af ​​OPCs i rene kulturer, er det nogle gange nødvendigt at behandle de indirekte virkninger af narkotika gennem andre celletyper i en co-kultur-systemet. I MS er infiltration af autoreaktive T effektorceller i CNS menes at spille en rolle i sygdommens progression 23. Effector T-celler kan udskille pro-inflammatoriske faktorer, som kan inhibere differentieringen af ​​OPCs ved steder med demyelinisering. Det er derfor af interesse at identificere therapeutics der kan beskytte OPCs og blokere disse pro-inflammatoriske faktorer fra forværrer skaden. Den DIFS assay kan være ideel til modellering denne aktivitet som T-celler vokser i suspension og kan vaskes væk fra oligodendrocyt kultur før MBP kvantificering. For co-kultur undersøgelser med adhærente celler, såsom neuroner, astrocytter og mikroglia kan Olig2 normalisering anvendes til at indsamle data fra de oligodendrocytter specifikt. Således kan fleksibiliteten af ​​DIFS assayet lette en række eksperimentelle design.

Afslutningsvis denne protokol giver en hurtig og pålidelig metode til at kvantificere oligodendrogenesis af A2B5-positive rotte OPCs in vitro. Denne isolation metode konsekvent leverer høje udbytter af levedygtige OPCs, der er lydhøre over for etablerede differentiering stikord. Følsomme analyse kan udføres i multi-brønds format fartøjer ved anvendelse af forskellige eksperimentelle paradigmer, som udvider anvendeligheden af ​​dette system til maNY forskellige applikationer. Endvidere kan DIFS assay tilpasset til high-throughput lægemiddel-screening, eller kan anvendes til at verificere resultaterne af lav-throughput assays, såsom kvantitativ PCR og Western blot. Vigtigt er det, kan dette system tilbyder en enkel, men effektiv metode til identifikation af OPC målrettede behandlinger i demyeliniserende sygdomme såsom dissemineret sklerose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Grant sponsor: National Institutes of Health; Grant nummer: R37 NS041435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+ Mediatech 21-040-CV 1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes Fisherbrand 0857512
Light Dissection Microscope Motic SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
40 μm Cell Strainer Corning 352340
A2B5 Column Purification 
Anti-A2B5 Microbeads Miltenyi Biotec 130-097-864 Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Magnetic Selection Columns
EDTA Corning 46-034-Cl 2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9647 0.50%
Culture Materials
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  Sigma-Aldrich T6397 45 nM
Clemastine fumarate salt Sigma-Aldrich SML0445-100MG 1 μM
Quetiapine hemifumarate salt Sigma-Aldrich Q3638-10MG 1 μM
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165 5 μg/ml
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 60 ng/ml
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524 10 μg/ml
Putrecine Sigma-Aldrich P7505 16 μg/ml
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 40 ng/ml
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135 50 ng/ml
d-Biotin Sigma-Aldrich B4639 10 ng/ml
Insulin Sigma-Aldrich I6634 5 μg/ml
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1147 100 μg/ml
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4161 100 μg/ml
Trace Elements B Corning 25-022-Cl 1x 
B-27 Supplement Life Technologies 17504044 1x 
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122 1x 
DMEM Life Technologies 11995-065 1x 
24-well Black Visiplate with lid Perkin Elmer 1450-605 Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA Sigma-Aldrich 100-13A 4%
Triton X-100 Sigma-Aldrich 78787 0.10%
Normal Goat Serum Jackson Immuno Research 005-000-121 5%
mouse monoclonal anti-MBP Biolegend SMI-99P 1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin Santa Cruz Biotecnology SC-7210 1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2 Millipore AB9610 1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD Licor 926-68070 1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW Licor 926-32211 1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse Life Technologies A11032 1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit Life Technologies A11008 1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI Life Technologies P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System Licor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
  2. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
  3. Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
  4. Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
  5. Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
  6. Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
  7. Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
  8. Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
  9. Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
  10. Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
  11. Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
  12. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  13. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  14. Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
  15. Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
  16. Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
  17. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
  18. Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
  19. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
  20. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  21. O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
  22. Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
  23. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).

Tags

Developmental Biology oligodendrocyt stamcelle oligodendrogenesis A2B5 cytoblot myelin basic protein
Udarbejdelse af Rat oligodendrocyt Stamfader Cultures og Kvantificering af Oligodendrogenesis Brug Dual-infrarød Fluorescens Scanning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schott, J. T., Kirby, L. A.,More

Schott, J. T., Kirby, L. A., Calabresi, P. A., Baxi, E. G. Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (108), e53764, doi:10.3791/53764 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter