Introduction
Efficiënte zenuwgeleiding in het centrale zenuwstelsel (CNS) vereist myelinisatie door oligodendrocyten axonen. Tijdens de ontwikkeling oligodendrocyten ontstaan uit een pool van oligodendrocyten progenitorcellen (OPC) die worden verondersteld te migreren van de ventriculaire zone van de zich ontwikkelende neurale buis voorhersenen en 1. Na de migratie OPCs differentiëren tot rijpe, myeliniserende oligodendrocyten die niet alleen vergemakkelijken efficiënte impuls voortplanting, maar ook axonen met trofische ondersteuning 2. De volwassen CNS handhaaft een overvloedige populatie van OPC's die gedurende de grijze en witte stof dat ongeveer 5-8% van alle cellen 3 worden gedispergeerd. Na een demyeliniserende belediging, OPC's migreren naar de plaats van het letsel, vermenigvuldigen en differentiëren om verloren of beschadigde myeline op blootgestelde axonen te vervangen. In sommige instellingen ziekte / schade dit proces blijkt inefficiënt of kan volledig mislukken 4. Terwijlchronische demyelinatie wordt verondersteld om toe te voegen aan de ziektelast, efficiënte oligodendrogenesis en remyelinisatie kan de symptomen 5 verlichten. Het is ook van belang geweest OPCs studeren in vitro het effect van experimentele factoren oligodendrogenesis bepalen.
Inzicht in de verschillende fasen van oligodendrocyt differentiatie is mede mogelijk gemaakt door de identificatie van de fase waarin specifieke cel markers. Zelfvernieuwende vroege progenitorcellen worden gedefinieerd door hun expressie van bloedplaatjes afgeleide groeifactor-alfa (PDGFRα), neurale / glia antigen 2 (NG2) A2B5 en 6-8. Als OPC initiëren hun differentiatie programma en zich terugtrekken uit de celcyclus, ze downregulate expressie van deze markers en beginnen om eiwitten indicatief voor premyelinating oligodendrocyten waaronder cyclisch-nucleotide 3'-fosfodiesterase (CNPase) en O4 uiten. Tenslotte, hun differentiatie tot meer gerijpte oligodendrocYtes wordt gekenmerkt door de expressie van myeline-geassocieerde proteïnen, zoals myeline geassocieerd glycoproteïne (MAG), proteolipide proteïne (PLP) en myeline basisch eiwit (MBP). MBP is een intracellulair perifeer membraaneiwit en een belangrijke component van de myelineschede. Muizen ontbreekt MBP het ontwikkelen van een ernstige fenotype waarin CNS myelinisatie is aanzienlijk gedaald leidt tot tremoren, convulsies en vroege dood 9,10. Deze belangrijke rol van MBP in myelinisatie heeft geleid tot het gebruik als een marker van oligodendrocyt differentiatie in vitro en in vivo 11.
Kwantificering van MBP kunnen worden bereikt met behulp van verschillende methoden. RT-PCR en Western blot analyse mogelijk voor het kwantificeren van MBP niveaus onder verschillende behandelingsregimes. Immunocytochemie is een gemeenschappelijke kwalitatieve aanpak die ook kwantitatief kan zijn wanneer de camera op basis van microscopie benaderingen worden gebruikt. Hoewel deze systemen zijn betrouwbaar en fundamenteelde studie van oligodendrocyt differentiatie, zij elk hun eigen nadelen die hun gebruik bij het screenen van geneesmiddelen te beperken. Ten eerste, de hoeveelheid primaire OPC's die nodig zijn voor RT-PCR en Western blotanalyse vermindert het aantal variabelen die gelijktijdig kunnen worden onderzocht. Terwijl de eis cel voor immunocytochemie is veel lager, moet veel tijd besteed worden aan elk experiment als kwantificering is het doel. Talrijke afbeeldingen moeten worden vastgelegd en vervolgens gekwantificeerd experimentele analyse te vergemakkelijken. Deze kanttekeningen worden belangrijke belemmeringen om te overwegen voor studies die high throughput beoordeling nodig. Hier beschrijven we een werkwijze die fundamentele aspecten van zowel immunocytochemie en Western blot werkwijzen voor myeline kwantificering gebruikt, terwijl zowel het aantal cellen nodig en tijd kwantitatieve analyse zou reduceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en de Johns Hopkins School of Medicine.
1. Bereiding van Assay platen, Stock Solutions, en OPC Base Media
Opmerking: De rat OPC base (Sato) beschreven media is afgeleid van eerder gepubliceerde studies 12,13. Alternatieve media formuleringen kunnen ook compatibel met deze procedure.
- Resuspendeer poly-L-lysine (PLL) in een concentratie van 10 ug / ml in steriel gedeïoniseerd water. Pipetteer 400 ul van de verdunde PLL in elk putje van een zwarte wand, duidelijke bodem 24 well weefselkweek rang schotel.
- Coat weefselkweek gerechten gedurende 2 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator of 's nachts in een 4 ° C koelkast.
- Aspireren PLL beklede schalen van ten minste 20 min voor plating. Laat de resterende PLL drogen van de put door het plaatsen van platen met 24 putjes met het deksel gedeeltelijk kier in een weefselkweekkap. Controleer of de putten volledig droog zijn voordat plating geïsoleerde OPC's. Cellen zullen niet houden aan plastic dat vloeibare PLL aanwezig is.
- Bereid N-acetyl-L-cysteïne (NAC) voorraadoplossing (1000x): Los 100 mg N-acetyl-L-cysteïne (NAC) in 20 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM). Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid hydrocortison stockoplossing (1000x): Voeg 1 ml van ethanol tot 1 mg hydrocortison en werveling op te lossen. Voeg 19 ml DMEM, meng de oplossing, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. De toevoeging van hydrocortison het basismedium is aangetoond dat de overleving van gliacellen 14 verbeteren.
- Bereid d-Biotine voorraadoplossing (5,000x): Los 2,5 mg d-biotine in 50 ml PBS. Voeg 2/1 x 5 pl druppels van 0,1 N NaOH om te helpen bij het oplossen. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid Insuline stock-oplossing (100x): Los 25 mg Insuline in 50 ml van weefselkweek kwaliteit water. Voeg 250 ul of 1 N HCl en meng tot oplossing helder. Steriliseren met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 6 weken.
- Bereid Sato voorraad-oplossing (100x):
- Bereid progesteron voorraadoplossing (25 ug / ul): Los 2,5 mg progesteron in 100 ui ethanol.
- Bereid natriumseleniet voorraadoplossing (400 ng / pl): Los 4 mg natriumseleniet in 100 pl 0,1 N NaOH. Voeg 10 ml van DMEM en meng.
- Tot 100 ml DMEM, voeg 1 g menselijk apo-transferrine, 1 g runderserumalbumine en 160 mg putrescine en meng tot volledig oplossen. Voeg 25 ul van progesteron voorraad oplossing, 1000 ul van natriumseleniet voorraad-oplossing, en meng. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid OPC basismedium: per 100 ml DMEM (met 4,5 g / l D-glucose, L-glutamine en 110 mg / l natriumpyruvaat), voeg 100 pl NAC, 100 gl hydrocortison, 20 pi d-biotine, 1 ml insuline, 1 ml Sato voorraad, 100 pi oligo-elementen B,2 ml B-27 supplement (50x) en 1 ml penicilline / streptomycine (100x). Steriliseren met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid PDGF-AA voorraadoplossing (1000x): Los 250 g in 12,5 ml PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA) aan een 20 ug / ml oplossing. Aliquot en bewaar bij -80 ° C.
- Bereid OPC proliferatiemedia: OPC basismedium gesupplementeerd met 20 ng / ml PDGF-AA.
- Bereid OPC differentiatie media: OPC basis media, aangevuld met 45 Nm triiodothyronine.
- Bereid kolombuffer: Aan 500 ml PBS, voeg 2,5 g BSA en 2 ml 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en breng de pH op 7,2. Steriliseren met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C.
2. Rat Brain Dissection
Opmerking: P5-P7 rat pups worden in dit protocol. Elke rat pup cortex levert ongeveer 1,5-2,0 x 10 6 A2B5 positieve cellen.
- Steriliseren alle dissectie apparatuur met een 2506; C verwarmd kraal sterilisator.
- Voeg 15-20 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) tot 50 ml conische buizen. Een 50 ml conische buis is voldoende voor 3-4 rattenpup cortex. Plaats 50 ml conische buizen op ijs. Gebruik 50 ml conische buizen in blokjes gesneden cortex weefsel te houden tijdens dissectie.
- Voeg koud PBS tot een 10 cm Petrischaal. Deze schotel wordt gebruikt voor dissectie onder de lichtmicroscoop.
- Offer ratten door onthoofding met grote chirurgische schaar. Spray kop met 70% ethanol.
- Pak het Whole Brain
- Met behulp van kleine schaar knippen de huid beneden de middellijn en achter de oren en schil de huid flappen terug. Snijd de schedel langs de middellijn vanaf de hersenstam en eindigt bij de ogen. Wees voorzichtig niet te diep snijden om de structuur van de onderliggende cortex behouden.
- Voeg twee zijdelingse sneden inferieur aan de kleine hersenen door het invoegen kleine chirurgische schaar in het foramen magnum. Maak een extra snede tussen de ogen, miererior naar de olfactorische bollen.
- Zorgvuldig pellen elke helft van de schedel terug. Verwijder de hele hersenen en plaats in de 10 cm petrischaal gevuld met koud PBS.
- Onder de dissectie lichtmicroscoop, verwijder de olfactorische bollen en cerebellum met fijne chirurgische pincet.
- Flip de hersenen, zodat het ventrale oppervlak is zichtbaar onder de lichtmicroscoop.
- Met behulp van fijne tang rechte uitvoeren van een stompe dissectie door het plaatsen tang gesloten uiteinden tussen de cortex en de hypothalamus tot een diepte ongeveer 2/3 van de hersenen. Eenmaal forceps hun plaats zodat de uiteinden open. Herhaal dit voor het andere halfrond.
- Plagen de cortex van de hypothalamus en middenhersenen regio's.
- Verwijder de hypothalamus, thalamus, middenhersenen door houden van de middenhersenen aan zijn achterste oppervlak en peeling richting het voorste uiteinde van de hersenen. Sever de voorste verbindingen.
- Verwijder de hippocampus van uitwendige afschilferen en vervolgens verbreken de verbinding met decortex met behulp van fijne gebogen dissectie pincet.
- Verwijder de resterende striatum door de sloop van het uit de onderliggende cortex naar buiten diagonale beweging met behulp van fijne gebogen dissectie pincet.
- Verwijder eventuele bloedvaten en hersenvliezen van het ventrale oppervlak van de cortex.
- Flip de hersenen, zodat het dorsale oppervlak zichtbaar is. Hersenvliezen en bloedvaten moet duidelijk zijn. Peel hersenvliezen uit de onderliggende cortex met behulp van fijne dissectie pincet. Begin peeling van de olfactorische locatie gloeilamp bijlage.
- Compleet stappen 2,4-2,14 voor een totaal van 3-4 rat pups.
- Plaats 3-4 ontleed rattenpup cortex in een droge petrischaal en hak met een gesteriliseerde scheermesje tot 1 mm x 1 mm brokken worden bereikt. Verzamel materiaal door spoelen schotel met PBS uit een 50 ml conische buis (stap 2) en plaats weer op ijs.
3. enzymatische en mechanische Tissue Dissociatie
Opmerking: deze stap is een papaïne-gebaseerde neurale dissociatie kit aanbevolen. Met behulp van Neural Dissociatie Kit (P), worden speciale stappen die optimaal zijn voor OPC isolatie beschreven.
- Bereid de eerste dissociatie enzym door verdunning enzym P met de geschikte buffer. De inhoud van elk 50 ml conische (1 monster) wordt opnieuw gesuspendeerd met een totaal van 1950 pl enzymmengsel. Plaats in het enzymmengsel in een 37 ° C bad gedurende 10 minuten.
Voorbeeld 1: 1900 ui buffer + 50 gl enzym papaïne - Spin alle 50 ml conische buisjes met 3-4 blokjes rattenpup cortex bij 300 g gedurende 3 min.
- Zuig het supernatant en voeg 1950 ul enzym oplossing voor elk monster buis en opsplitsen van de pellet door het buisje en schudt zachtjes.
- Incubeer in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 15 minuten onder voortdurend draaien buis.
- Gedurende de laatste 5 minuten van de incubatie bereiden tweede enzymmengsel A. Verdun het enzym in een geschikte buffer. Een totaal van 30 pl wordt toegevoegdelk 50 ml kegelvormige monsterbuis.
Voorbeeld 1: 20 gl buffer + 10 gl enzym - Zodra incubatie voltooid voeg 30 ul van het tweede enzymmengsel aan elke buis en zwenken om te mengen.
- Met een glazen Pasteur pipet verbonden met een pipet controller mechanisch dissociëren het weefsel door pipetteren 10-15 keer of totdat het weefsel stukken worden verkleind en de oplossing troebel. Breng het monster op de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 15 min met een continue rotatie.
- Pipet elk weefsel homogenaat monster 10-15 keer met behulp van een 1 ml pipet.
- Pipet elk weefsel homogenaat monster 15-20 keer met behulp van een 200 ul pipet
- Geeft alle monsters naar de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 10 minuten onder voortdurend draaien.
- Voeg 10 ml PBS (met Ca2 + en Mg2 +) aan elk monster en filtreer het homogenaat door een 40 urn filter poriën geplaatst op een 50 ml buis. Spoel de filter met een extra 1-2 ml PBS.
- Zwembad alle homogenaat monsters in een 50 ml conische buis en het verwerven van een algehele celgetal.
- Na het uitvoeren van de celtelling, splitsen homogenaat gelijkmatig in 15 ml conische buizen (1 buis voor elk monster). Centrifugeer gedurende 10-12 minuten bij 300 x g.
4. Anti-A2B5 Bead Application, Column Zuivering en Plating
- Voer berekeningen voor kolom buffer en anti-A2B5 microbolletjes. Voeg 7 ul Column buffer voor elk 1 x 10 6 cellen. Voeg 2 ul anti-A2B5 microkralen voor elk 1 x 10 6 cellen.
- Combineer alle monsters door resuspenderen van de cellen in een totaal volume van 10 ml kolombuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10-12 min.
- Resuspendeer de celpellet in de juiste hoeveelheid kolombuffer zoals berekend in stap 4.1. Als de pellet is groot en los, alleen maar ongeveer de helft van het volume kolombuffer de anti houdenlichaam de juiste concentratie in de cel resuspensie.
- Incubeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Add anti-A2B5 microbolletjes (berekend in stap 4,1), keer herhaaldelijk en incuberen bij 4 ° C gedurende 30-60 min. Keer de buis een paar keer om de 10 min. Langere incubatietijden kunnen cel opbrengst te verhogen maar kan toenemen aspecifieke binding.
- Voeg 5 volumes kolombuffer. Als de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in een volume van 1 ml, voeg 5 ml kolombuffer, dat wanneer de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 2 ml, voeg 10 ml van kolombuffer.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- Bepalen hoeveel LS kolommen nodig zijn voor de zuivering. Een LS kolom volstaat 15-20 x 10 6 cellen totaal.
- Resuspendeer de celpellet in 1000 pl kolombuffer per LS kolom gebruikt.
- Prime elke LS kolom door toevoeging van 5 ml van kolombuffer. Verzamel de stroom door een 50 ml conische buis. Zodra de kolom buffer volledig geleid door de bovenste kamer, toepassen 1000 pi van de celsuspensie elke kolom en laat de cellen doorlopen door zwaartekracht.
Opmerking: Als de dichtheid van de cellen te hoog is, kan de kolom trage werking. - Onmiddellijk na de celsuspensie door de kolom gepasseerd, voeg langzaam 3 ml kolombuffer elke kolom ongebonden cellen te wassen. Als de was gemakkelijk loopt door de kolom (1 druppel voor elke 30-45 sec), was nog tweemaal met 3 ml van kolombuffer.
- Verwijder elke kolom en plaats deze op een 15 ml conische buis. Voeg 5 ml kolom buffer en duik de buffer door de kolom in een snel tempo met behulp van de plastic zuiger, dat wordt geleverd met de kolom. Kelderen zal de gebonden cellen die hen vrijgeven van de kolom te verwijderen.
- Verhogen zuiverheid uitvoeren van het monster door een tweede ronde van LS kolommen. Met een derde van het aantal kolommen tijdens de eerste doorgang. Prime de kolom met 5 ml van kolombuffer.Laat de kolom buffer door middel van de bovenste kamer te passen.
- Aangezien het volume van celsuspensie veel groter zal zijn, gelijkmatig 1000 gl celsuspensie toepassing op elke kolom en laat de suspensie door de bovenste kamer van de kolom stroomt voor bijvullen met een extra 1000 pl.
- Zodra de celsuspensie volledig is toegepast op de tweede kolommen, was 2-3 maal met 3 ml van kolombuffer.
- Verwijder elke kolom en plaats deze op een steriele 15 ml conische buis. Voeg 5 ml kolombuffer en dompelen de buffer met de plastic zuiger die verpakt is met de kolom. Kelderen zal de gebonden cellen die hen vrijgeven van de kolom te verwijderen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 12-15 min. De pellet moet verschijnen compact.
- Resuspendeer de celpellet 5-10 ml voorverwarmde OPC proliferatiemedia (OPC basismedium gesupplementeerd met PDGF-AA 20 ng / ml).
- Tel de cellen met een hemocytometer. Plate de cellen. Verdun de cellen aan 60.000 cellen / ml met OPC proliferatiemedia. In elk zwart, heldere bodem 24 vormt Pipetteer 500 ul cellen langs de kant van de bron tot 30.000 cellen per putje te verkrijgen. Meng de cellen door schudden van de plaat horizontaal met behulp van een cijfer acht beweging. Als uitvoeren van de bepaling van 48, 96 of 384 putjes, voeg 15.000, 7500 of 1500 cellen per well, respectievelijk. Deze aantallen kunnen worden aangepast afhankelijk van de individuele specificaties plaat.
- Bereid een aparte plaat voor de Dag 0 basislijn controle culturen. Deze bedieningsplaat moeten met 4% paraformaldehyde zoals beschreven in paragraaf 5.7, wanneer onderscheid wordt gemaakt op dag 0.
- Cultuur van de cellen in OPC proliferatiemedia bij 37 ° C gedurende 3 dagen zonder wisselen van materiaal.
5. Inductie van OPC Differentiatie en Bevestiging met 4% paraformaldehyde
Opmerking: Bij het testen van het effect van kleine moleculen op oligodendrogenesis, we routinematig dissolve drugs in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 1000x aandelen die vervolgens bij -80 ° C worden opgeslagen en direct verdund in SATO media tot een eindconcentratie van 0,1% DMSO verkrijgen bereiden. We hebben geen veranderingen in zowel OPC proliferatie of differentiatie met deze concentratie DMSO waargenomen (gegevens niet getoond).
- Voorverwarmen OPC basismedium tot 37 ° C en ontdooien medicatie voorraden kamertemperatuur. Bij het uitvoeren van behandelingen in tweevoud, voor te bereiden van ongeveer 1,25 ml van media per behandelingsgroep in een 1,5 ml buis. Voor drievoudige monsters, gebruik 2 ml centrifugebuizen om rekening te houden speling.
- Bereid de behandeling mastermengsels voor repliceren putten door het verdunnen van de behandeling aandelen direct in OPC base media. Kort vortex of meng elke mastermix homogene verdeling van de behandeling.
- Bereid 45 nM triiodothyronine (T3) als de positieve controle en de geschikte drager als negatieve controle. Verdun 10 mM T 3 stock1: 1000 in 1 ml OPC basismedium en vervolgens verder verdund in de behandeling master mix de eindconcentratie van DMSO verlagen indien nodig.
- Zuig het materiaal uit de cultuur putten één behandeling groep tegelijk om te voorkomen dat het drogen van de cellen. Gebruik een 200 ul pipet tip over het uiteinde van de glazen Pasteur pipet vermijden afschrapen zwart materiaal van de zijkanten van de goot en in de cultuur.
- Voeg langzaam 500 pl behandeling mastermix langs de kant van de put onder toepassing van een 1 ml pipet.
- Incubeer de culturen voor de gewenste periode, het uitvoeren van een volledige media-uitwisseling met verse behandeling media om de 2-3 dagen. We routinematig zich aan een 30-40% MBP + cultuur na 4 dagen in differentiatie media.
- Aan het einde van de gewenste behandelingsperiode, vers bereid 4% paraformaldehyde (PFA) of ontdooien van een ingevroren voorraad tot kamertemperatuur. LET OP: PFA is uiterst giftig en moet worden bereid in een zuurkast.
- Aspireren de media en voeg langzaam 4001, l PFA aan de zijkant van de put om de cellen te repareren. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het PFA en voeg langzaam 500 ul steriel D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) aan de zijde van de put om de cellen te wassen. Herhaal het wassen in totaal twee keer. Niet zuig het laatste wasbeurt.
- Wikkel de plaat in parafilm en bewaar bij 4 ° C voor latere verwerking of direct doorgaan naar de volgende stap. Platen kunnen worden opgeslagen voor meerdere weken.
6. immunocytochemie Kwantificering van myelinebasiseiwit
Opmerking: Bij het uitvoeren vloeistofverwerking procedures in de 24 putjesplaten wordt aanbevolen snel werken om te voorkomen dat het drogen van de cellen. Hier is het gebruik van een multi-channel aspirator vacuum en multichannel pipet aanbevolen.
- Breng de plaat tot kamertemperatuur zuig de putjes en voeg 250 ul van D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bevattende 0,1% Triton X-100 en 5%normaal geit serum (NGS). Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht orbitaal schudden.
- Bereid de primaire incubatie-oplossing door verdunning monoklonaal anti-MBP-antilichaam 1: 1000 en konijn polyklonaal anti-actine antilichaam 1: 200 in D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bevattende 5% NGS. Alternatief, konijn polyklonaal anti-Olig2 bij 1: 1000 kan worden gebruikt voor oligodendrocyten specifieke normalisatie in gemengde gliale kweken. Bereid genoeg primaire oplossing tot 250 ul per putje tegemoet te komen.
- Incubeer primaire antilichamen bij 4 ° C geïncubeerd gedurende 16-18 uur onder zacht orbitaal schudden.
- Zuig het primaire incubatieoplossing en was de cellen 3 x 10 min met 500 ul D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bij kamertemperatuur onder zacht orbitaal schudden.
- Terwijl het wassen van de plaat, de voorbereiding van de secundaire incubatie oplossing door verdunning van anti-muis 680 en 800 anti-konijn antilichamen 1: 500 in D-PBS (met Ca 2+ 2+) met 5% NGS. Minimaliseer omgevingslicht blootstelling bij de voorbereiding van deze oplossing.
- Zuig het laatste wasbeurt en voeg 250 ul van secundaire incubatie-oplossing. Beschermt de plaat tegen licht en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht orbitaal schudden.
- Zuig het secundaire incubatieoplossing en spoel de putjes 3 x 10 min met 500 ul D-PBS (met Ca2 + en Mg2 +) bij kamertemperatuur onder zacht orbitaal schudden.
- Scan de plaat via een beeldvormingssysteem opsporen van 700 nm en 800 nm fluorescentie emissies. Als uitgangspunt, stelt het middelpunt offset naar 3 en gevoeligheden tot 1,5 voor MBP, 5.0 voor actine en 3.5 voor Olig2. De gevoeligheid waarden nodig signaal overbelichting te voorkomen.
- Kwantificeren van de omvang van oligodendrogenesis gebruik van semi-automatische software-gebaseerde methoden.
- Met behulp van de software, zet de plaat analyse modus "24 Well" en lijn cirkels rond thij buitenomtrek van de gescande putjes. Stel de normalisering kanaal naar "800" en de uitvoer van de totale en de relatieve fluorescentie-intensiteiten van de 700 nm (MBP) en 800 nm (Olig2 / actine) kanalen.
- Verdeel de intensiteit bij 700 nm met de intensiteit op 800 nm om de genormaliseerde MBP expressie in relatieve fluorescentie-eenheden geven. Bereken het gemiddelde van herhaalde metingen en de schaal van de expressie van de Dag 0 + PDGF controles, dat bij de analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2B5-positieve OPC zijn geïsoleerd door middel van positieve cel selectie met behulp van een magnetische scheiding column systeem. Voorafgaand aan de isolatiewerkwijze is de gehele hersenen verwijderd uit ratten die tussen P5 en P7. Zodra de gehele hersenen met succes wordt losgemaakt van de schedel, wordt de reukkwabben en cerebellum verwijderd met fijne chirurgische pincet (Figuur 1A). Om cerebraal corticaal weefsel isoleren de hypothalamus, thalamus en midbrain worden uitgesneden door zorgvuldige dissectie (Figuur 1B). Vervolgens worden de hippocampus en striatum worden verwijderd met gebogen Chirurgische tang (figuur 1C - D). De isolatie proces efficiënt elimineert meningeale en fibroblast cellen, maar enzymatische afbraak wordt verbeterd wanneer hersenvliezen en bloedvaten worden verwijderd (figuur 1E). Tenslotte weefsel blokken van 1 mm x 1 mm worden voorbereid voor de volgende weefsel dissociatie stappen (Figure 1F).
Een goede OPC isolatie moet leiden tot een compacte celpellet na centrifugeren stap (Figuur 2A). Zodra geplateerde deze culturen relatief vrij van cellulair puin wanneer bekeken onder een microscoop (Figuur 2B). Een suboptimale isolatie kan leiden tot een grote en zachte pellet door de aanwezigheid van grote hoeveelheden cellulair afval. Dit vuil zal sterk hechten aan de PLL-beklede vat en kan interfereren met de kweek (figuur 2C). Als een grote en zachte pellet voordoet, kan het helpen om de cellen te resuspenderen in 10 ml PBS en herhaal het centrifugeren gedurende 10 min bij <300 x g. Zodra de isolatie is voltooid, kan de zuiverheid van de kweken worden beoordeeld door flowcytometrie om het percentage A2B5-positieve cellen te identificeren. Een succesvolle isolatie moet resulteren in een verzameling van cellen die> 95% positief voor A2B5 (Figuur 2D - F). Vergeleken met cellen gekleurd met een fluorescente kleurstof-geconjugeerd anti-antilichaam A2B5 zou ongekleurde cellen blijken als negatieve populatie en kan worden gebruikt als basis referentie voor gating. Bovendien hebben we eerder aangetoond dat de selectie van OPC met het A2B5 antigen opbrengsten culturen die positieve kleur wordt PDGFRα door immunocytochemie 11.
Zoals aangetoond door immunocytochemie, OPC bij aanvang van de behandeling (Dag 0) zijn Olig2 + / MBP - dat cellen Olig2 + / + MBP op dag 4 (figuur 3). De optimale samenvloeiing van de OPC's en oligodendrocyten op dag 0 en dag 4 worden getoond in representatieve heldere veld beelden (Figuur 4A). De afwezigheid van MBP expressie op dag 0 dient als basis voor het kwantificeren van oligodendrogenesis. Spontane differentiatie als gevolg van PDGF-AA terugtrekking dient als een negatieve controle, terwijl 45 nM schildklierhormoon (triiodothyronine; T3) kan worden gebruikt als een positieve controle 11,15. Quetiapine, ook bekend als quetiapine en clemastine, ook bekend als Tavist worden FDA-goedgekeurde geneesmiddelen die zijn aangetoond in vitro oligodendrogenesis versnellen en kan worden gebruikt als extra positieve controles 16,17. Figuur 4B toont een representatief tweekanaals infrarood fluorescente scan waaruit de verwachte resultaten voor elk van deze voorwaarden in drievoud. Actine en MBP signalen werden respectievelijk groene en rode pseudocolored zodat zeer gedifferentieerde culturen verschijnen geel in samengevoegde beelden. De resultaten tonen aan dat MBP uitdrukking op dag 4 in de PDGF terugtrekking voorwaarde was 4,5 ± 1,4 keer zo hoog in vergelijking met dag 0, terwijl de vouw veranderingen in de MBP als gevolg van de behandeling met schildklierhormoon, quetiapine en clemastine waren 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 en 32,8 ± 0,5 respectievelijk (Figuur 4C). De robuustheid en nauwkeurigheid van de test wordt aangetoond door de smalle standaarddeviaties onder de drievoudige monsters en de grote behandeling activering venster dat is ongeveer 20 standaarddeviaties boven de PDGF terugtrekking controle.
Terwijl Actine dient als betrouwbaar referentiegen voor normalisatie in oligodendrocyten culturen, kunnen referentieantenne genen worden gebruikt. Olig2 is een nucleaire transcriptiefactor die constitutief tot expressie wordt gebracht in cellen van de oligodendrocyt lineage. De specifieke en constitutieve expressie patroon kan dus een voorkeur normaliseringsstreven in heterogene kweek situaties leveren. Figuur 5 laat zien dat in OPC kweken gedifferentieerd met 10 nM schildklierhormoon, de berekende voudige verandering in MBP expressie ten opzichte van PDGF terugtrekking is hetzelfde als ofwel met Olig2 of actine voor normalisatie. Waarschijnlijk omdat de OPC culturen in dit experiment waren zeer zuiver, beide eiwitten kan betrouwbaar voor normalisatie. Echter, we often observeren een kleine populatie van Olig2-negatieve cellen op dag 4, maar de verhouding van deze populatie tot de Olig2-positieve populatie lijkt geen significante verschillen tussen de PDGF terugtrekking en T3 behandelde groep. Zo zijn de fold-changes niet beïnvloed. Gegeven een scenario waarin een behandeling proliferatie van Olig2-negatieve celtypen kunnen veroorzaken, moet de keuze van normalisatie antilichaam zorgvuldig worden overwogen.
Figuur 1:.. Rat hersenen dissectie procedure Stapsgewijze beschrijving van de dissectie procedure Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Flowcytometrieanalyse van geïsoleerdeOPC. (A) Na magnetische kolomzuivering, wordt de gebonden celpopulatie stortte uit de kolom en gecentrifugeerd om een compacte pellet. De hoeveelheid afval wordt aangegeven door de grootte van de pellet. (B) Wanneer de pellet compact, dan zal minimaal afval in de cultuur. (C) Een grote en zachte pellet resulteert typisch in een kweek met zwaar afval. De zuiverheid van de kweek wordt bepaald door stroomcytometrie onder toepassing van een rat anti-muis antilichaam A2B5 dat is geconjugeerd aan APC. (D) Dode cellen en puin zijn uitgesloten van de analyse, zoals aangegeven in voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing percelen. (E) De A2B5 positieve populatie kan worden bepaald met behulp van een ongekleurde bemonsterd als basis referentie voor gating. (F) met succes geïsoleerd OPC's moeten> 95% positief voor A2B5 zijn. Klik hier om viewa grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3:. OPC cultuur en differentiatie procedure De dual-infrarood fluorescentie-scanning (DIFS) test begint met vers isolatedA2B5-positieve rat OPC uitgeplaat op PLL-gecoate kweekvaten (dag 3). Deze kweken worden verspreid gedurende 3 dagen in aanwezigheid van 20 ng / ml PDGF-AA, en vervolgens behandeld met experimentele factoren in zoet PDGF-vrij medium op dag 0. Behandeling media volledig aangevuld op dag 2 en de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde op Dag 4. Immunocytochemie voor Olig2 (groen) en MBP (rood) werd uitgevoerd op representatieve culturen op dag 0 en dag 4 met behulp van Dapi (blauw) als een nucleaire teller vlek. Deze culturen vertonen constitutieve kleuring voor de pan oligodendrocyt lineage cel marker Olig2 op dagen 0 en 4, terwijl kleuring van de volwassen oligodendrocyt marker MBP is alleen evident door Dag 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MBP kwantificering met de dual-infrarood fluorescentie-scanning (DIFS) assay (A) De dichtheid van OPC kweken op dag 0 en dag 4 vereist voor optimale assayprestaties.. (B) Representatieve dual-infrarood fluorescentie scans. OPC werden gedifferentieerd in 24 putjes platen gedurende 4 dagen in aanwezigheid van 45 nM T3, 1 uM quetiapine, 1 uM clemastine, of 0,1% DMSO in drievoud. Een aparte plaat die OPC die waren op dag 0 (+ PDGF) werd parallel verwerkt. Actine (pseudocolored groen) en MBP (pseudocolored rood) werden gelijktijdig gekwantificeerd met behulp van een Licor Odyssey scanner ingesteld op 700 nm en 800 nm-uitstoot te detecteren. (
Figuur 5: Olig2 is een betrouwbare referentie voor het normaliseren eiwit MBP expressie in oligodendrocyten OPCs werden in drievoud gedifferentieerd in de aanwezigheid van 10 nM T3 of 0,1% DMSO controle voertuig 24 well platen gedurende 4 dagen.. De dual-infrarood fluorescentie-scan werd uitgevoerd met behulp van anti-Olig2 of anti-Actin primaire antilichamen voor normalisatie. Olig2 / Actine en MBP werden simultaan gekwantificeerd onder toepassing van een Licor Odyssey scanner ingesteld op 700 nm en 800 nm emissie detecteren. MBP expressie geenrmalized ofwel Olig2 of actine expressie en resultaten werden passend gemaakt met de 0,1% DMSO controle. De gemiddelde relatieve fluorescentie-eenheden ± SD werden uitgezet met behulp van GraphPad Prism 6. De resultaten tonen dat de berekende veelvoudverandering is hetzelfde als genormaliseerd naar een van de twee referentie-eiwitten.
Figuur 6:. Effect van Triton X-100 op MBP kleuring OPCs werden gedifferentieerd in 24 putjes platen gedurende 4 dagen in aanwezigheid van 45 nM T3 of 0,1% DMSO. Kweken werden vervolgens gefixeerd met 4% PFA en gekleurd voor Olig2 en MBP met twee verschillende protocollen immunocytochemie. Voor de hoge Triton X-100 monster werden de cellen gepermeabiliseerd voor 1 uur met 0,4% Triton X -100 en alle antilichaam incubatie stappen werden uitgevoerd bij aanwezigheid van 0,1% Triton X-100. Voor de lage Triton X-100 monster werden de cellen gepermeabiliseerd voor 1 uur met 0,1% Triton X-100, terwijl Antibody incubaties werden uitgevoerd zonder Triton X-100. Olig2 en MBP werden gevisualiseerd met een fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire en afbeeldingen werden verkregen met behulp van een camera op basis van fluorescentie microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol beschrijft een snelle en betrouwbare werkwijze voor het isoleren en kwantificeren OPC rat in vitro oligodendrogenesis reactie op experimentele factoren. Met behulp van positieve selectie, zijn hoge opbrengsten van levensvatbare en pure OPC's direct gebruikt voor experimentele doeleinden. Deze methode stroomlijnt het isoleren, kweken en differentiatiestappen in een 1 week tijd en gefixeerde cellen kan geschikt bij 4 ° C gedurende enkele weken worden opgeslagen zonder verlies van gevoeligheid van de test.
Een groot voordeel met-scanner op basis van fluorescentie assays is dat data-acquisitie en analyse aanzienlijk wordt versneld ten opzichte van traditionele camera's gebaseerde microscopische technieken. Hoewel microscopie heeft met succes in high-throughput-schermen gebruikt om inductoren van OPC differentiatie te identificeren, data-acquisitie is inherent trager omdat het programmeren van het vastleggen van beelden sequenties, enkele uren voor het verzamelen van gegevens, de analyse van honderden vereist aan Thousands van beeldbestanden, en door de gebruiker gedefinieerde algoritmen om individuele cel instanties voor normalisatie of analyse 18,19 onderscheiden. Verder met cameragebaseerde microscopiesystemen het niet mogelijk om gegevens te verkrijgen van het gehele oppervlak van het kweekvat. In plaats daarvan moet representatief zijn beelden worden vastgelegd uit verschillende gebieden binnen één goed, wat kan leiden tot positionele vooringenomenheid en vals-positieve hits. Ter vergelijking, deze test detecteert MBP expressie van alle cellen binnen een bepaald goed, en meerdere platen tegelijkertijd worden gescand. Hoewel deze methode kan worden aangepast voor gebruik in 96 putjes of 384 putjes formaat, kan de 24-putjes plaat bij voorkeur minder behandelingen worden getest. We hebben vastgesteld dat celverlies in de 24-well plaat door vloeistofverwerking geminimaliseerd, hetgeen een complicatie die moet worden gehouden bij het ontwerpen hogere throughput experimenten.
Een kritische parameter van de test is de dichtheid van de cellen bij differentiatie wordt gestart op dag 0. culturen met te weinig cellen blijken om langzamer te differentiëren en sterven af, terwijl de high-density culturen vertonen spontane differentiatie. Beide situaties kan het dynamische bereik en de betrouwbaarheid van de test te verminderen. Om een optimale balans tussen gezondheid cel en cel dichtheid te bereiken, hebben we de cultuur van de OPC's gedurende 3 dagen zonder een media-uitwisseling of aanvulling van verse PDGF-AA. Onze hypothese was dat aangezien de concentratie van PDGF-AA in het medium daalt op dag 3 in vitro (Dag 0) als gevolg van cellulaire katabolisme, de proliferatieve snelheid van de cellen zal vertragen zodat proliferatie wordt verminderd door de eerste dag van PDGF- AA terugtrekking. Deze techniek werkt het beste wanneer de cellen gelijkmatig verdeeld tijdens plating. Pipetteren de cellen langs de zijkant van de put en ze te mengen met een cijfer acht beweging moet bevorderen een gelijkmatige verdeling. Pipetteren in het midden van de put de neiging om clusters van cellen aan de randen van de put produceren met weiniger cellen vast te houden aan het centrum. Dit verschijnsel kan worden veroorzaakt door verstoring van de PLL pas gedroogde laag door pipetteren vloeistof krachten. Accumulatie van cellen aan de omtrek kan assaygevoeligheid door dichtheid-afhankelijke differentiatie verminderen. Het is belangrijk op te merken dat de aanzienlijke verschillen in de intensiteit van het actine / Olig2 signaal kan tussen met geneesmiddel behandelde en controle culturen PDGF terugtrekking. Aanzienlijk gedaald actine / Olig2 signaal kan geneesmiddelentoxiciteit aangeven, terwijl aanzienlijk toegenomen actine / Olig2 signaal geneesmiddel geïnduceerde proliferatie kunnen wijzen. We normaal een iets hogere Actin / Olig2 signaal waarnemen van cellen behandeld met pro-drugs differentiatie vergeleken met de PDGF terugtrekking controles. We schrijven dit verschil met een hoger percentage van spontane apoptose in de PDGF terugtrekking groep over de 4 daagse differentiatie procedure. Bij de beoordeling van oligodendrogenesis, normalisering van de MBP aan actine / Olig2 moet corrigeren voor het aantal cellen verschillen. Om toxi beoordelenstad en proliferatie met deze assay, kan de anti-MBP-antilichaam worden ingewisseld voor primaire antilichamen tegen de betreffende markeringen.
Bij experimenten zowel kwantitatieve als kwalitatieve beoordeling nodig, is het belangrijk om de blootstelling van de vaste rat oligodendrocyten culturen te beperken Triton X-100 bij gebruik van 4% PFA om de cellen te repareren. Andere protocollen voor immunocytochemie oligodendrocyt culturen, die typisch omvatten Triton X-100 in zowel het antilichaam incubatiestappen antilichaam epitoop toegankelijkheid te verbeteren kunnen succes afhankelijk experimentele voorschriften wordt. Anderzijds, hoewel MBP is een intracellulair eiwit kan het mogelijk zijn om Triton X-100 volledig te sluiten als alternatieve bevestigingsmethoden worden gebruikt die voldoende permeabel de cellen. Met de hier beschreven omstandigheden hebben we vastgesteld dat Triton X-100 beïnvloedt de waargenomen morfologie van oligodendrocyten en de lokalisatie van kleuring MBPbij gebruik bij hoge concentraties. We zien een aanzienlijke daling van de antilichaam kleuring als Triton X-100 is weggelaten uit het antilichaam incubatie stappen. Zoals getoond in figuur 6, zoals 0,4% Triton X-100 permeabilisatie en in de blokkeringsstap, en 0,1% Triton X-100 gedurende antilichaam incubatie vermindert de detectie van myeline en -resultaten in discontinue MBP kleuring. Daarom is voor kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie volstaan met een lagere concentratie van Triton X-100 als hier beschreven zijn.
Terwijl het gebruik van A2B5 gekozen OPC uit ratten voordelig kan zijn, hebben we vergelijkbare resultaten in de dual-infrarood fluorescentie-scanning (DIFS) test met behulp van A2B5 gekozen OPC uit C57BL / 6 muizen waargenomen, maar celopbrengst per muis typisch veel lager (gegevens niet getoond). Andere protocollen voor OPC zuivering kan ook compatibel met deze test zijn. Bijvoorbeeld kan oligodendrocyt marker O4 worden gebruikt als een antigeen int zuiverenermediate stadium oligodendrocyt voorlopers met behulp van magnetische bolletjes 20. Als alternatief voor magnetische-gebaseerde werkwijzen kunnen OPC verrijkt worden 9 dagen oude gemengde gliale kweken die astrocyten en microglia door high-speed orbitaal schudden en differentiële hechtmechanismen 21. Bovendien, immuno-panning procedures te nemen waarin zowel negatieve als positieve celselectie kan worden gebruikt als cultuur zuiverheid heeft de voorkeur boven high cel opbrengsten 22. Naast onderzoeken hoe therapeutica direct kunnen versterken de differentiatie van OPCs in reinculturen, is het soms noodzakelijk de indirecte effecten van geneesmiddelen door andere celtypes in een co-kweeksysteem overwegen. Bij MS wordt de infiltratie van autoreactieve T-effectorcellen in het centraal zenuwstelsel geacht worden een rol in ziekteprogressie 23 spelen. Effector-T-cellen kunnen scheiden pro-inflammatoire factoren die de differentiatie van OPC's op plaatsen van demyelinisatie kan remmen. Het is daarom van belang thera identificerenpeutics dat de OPCs kan beschermen en blokkeren van deze pro-inflammatoire factoren uit verergeren letsel. De DIFS test kan ideaal voor deze activiteit modelleren als T-cellen groeien in suspensie en kunnen uit de buurt van de oligodendrocyt cultuur voorafgaand aan MBP kwantificering worden gewassen zijn. Voor co-kweek studies met hechtende cellen zoals neuronen, astrocyten en microglia kunnen Olig2 normalisatie worden gebruikt om gegevens van de oligodendrocyten specifiek verzamelen. Aldus kan de flexibiliteit van de assay DIFS diverse experimentele modellen vergemakkelijken.
Tot slot, dit protocol zorgt voor een snelle en betrouwbare methode om de oligodendrogenesis van A2B5-positieve rat OPC's in vitro te kwantificeren. Deze isolatie methode levert consequent hoge opbrengsten van levensvatbare OPC's die inspelen op de gevestigde differentiatie signalen zijn. Gevoelige analyse kan worden uitgevoerd in multi-well formaat vaartuigen met verschillende experimentele paradigma's, die de bruikbaarheid van dit systeem ma strektny verschillende toepassingen. Bovendien kan de DIFS assay aangepast voor high-throughput screening van geneesmiddelen, of kan worden gebruikt om de resultaten van laag throughput assays zoals kwantitatieve PCR en Western blot verifiëren. Belangrijk is dat dit systeem een eenvoudige maar effectieve middelen voor de identificatie van OPC gerichte therapieën in demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Grant sponsor: National Institutes of Health; Grant nummer: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
