Introduction
Efficace conduction nerveuse dans le système nerveux central des mammifères (CNS) exige la myélinisation des axones par les oligodendrocytes. Au cours du développement, les oligodendrocytes proviennent d'un pool de cellules progénitrices oligodendrocytes (OPC) qui sont pensés pour migrer des zones ventriculaires du cerveau antérieur développement et tube neural 1. Après OPC de migration se différencient en oligodendrocytes matures, myélinisantes que non seulement faciliter la propagation de l'influx efficace, mais aussi de fournir des axones avec le soutien trophique 2. Le SNC adulte conserve une population abondante d'OPC qui sont dispersées dans toute la substance grise et blanche comprenant environ 5-8% de toutes les cellules 3. Suite à une insulte démyélinisante, OPC migrent vers le site de la lésion, prolifèrent, et se différencient pour remplacer les gaines de myéline perdus ou endommagés sur axones exposés. Cependant, dans certains contextes maladie / blessure, ce processus est jugée inefficace ou peut échouer complètement 4. Tandis quedémyélinisation chronique est pensé pour ajouter à la charge de morbidité, oligodendrogenèse et la remyélinisation efficace peut atténuer les symptômes 5. Il a donc été intéressant d'étudier les OPC in vitro pour déterminer l'effet de facteurs expérimentaux sur oligodendrogenèse.
Aperçu des différentes phases de différenciation des oligodendrocytes a été rendue possible par l'identification de marqueurs cellulaires spécifiques de la scène. Auto-renouvellement des cellules souches précoces sont définis par leur expression dérivé des plaquettes récepteur du facteur de croissance alpha (PDGFRa), l'antigène de neurones / cellules gliales 2 (NG2) et A2B5 6-8. Comme OPC lancer leur programme de différenciation et se retirent du cycle cellulaire, ils régulent à la baisse l'expression de ces marqueurs et commencent à exprimer des protéines indiquant premyelinating oligodendrocytes dont Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) et O4. Enfin, leur différenciation en oligodendroc plus matureytes est caractérisé par l'expression de protéines associées à la myéline, y compris la glycoprotéine associée à la myéline (MAG), la protéine protéolipidique (PLP), et la protéine basique de la myéline (MBP). MBP est une protéine de membrane périphérique intracellulaire et une composante majeure de la gaine de myéline. Les souris dépourvues MBP développent un phénotype sévère dans laquelle myélinisation du SNC est diminué de façon significative conduit à des tremblements, des convulsions et la mort précoce 9,10. Ce rôle important dans la myélinisation de MBP a conduit à son utilisation en tant que marqueur de la différenciation des oligodendrocytes in vitro et in vivo 11.
La quantification de la MBP peut être réalisée en utilisant plusieurs méthodes différentes. RT-PCR et l'analyse par transfert de Western pour permettre la quantification des niveaux MBP sous différents régimes de traitement. Immunocytochimie est une approche qualitative commune qui peut aussi être quantitative lorsque des approches de microscopie par caméra sont utilisés. Bien que ces systèmes sont fiables et fondamentale pourl'étude de la différenciation des oligodendrocytes, ils ont chacun leurs propres inconvénients qui limitent leur utilisation dans le criblage de médicaments. En premier lieu, la quantité d'OPC de base qui sont nécessaires pour la RT-PCR et l'analyse par Western blot de réduire le nombre de variables qui peuvent être examinées simultanément. Bien que l'exigence de la cellule pour immunocytochimie est beaucoup plus faible, beaucoup de temps doit être consacré à chaque expérience, si la quantification est le but. De nombreuses images doivent être capturés et ensuite quantifiés pour faciliter l'analyse expérimentale. Ces mises en garde deviennent des obstacles importants à considérer pour les études qui nécessitent une évaluation à haut débit. Nous décrivons ici un procédé qui utilise les aspects fondamentaux à la fois du immunocytochimie et les méthodes de Western blot pour la quantification de la myéline, tout en réduisant considérablement le nombre de cellules nécessaires et de temps pour terminer l'analyse quantitative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l'utilisation Commission (IACUC) et Johns Hopkins School of Medicine.
1. Préparation de l'essai plaques, Solutions mères et OPC Base de médias
Remarque: La base de OPC de rat (Sato) milieux décrits ici sont tirées d'études publiées antérieurement 12,13. formulations de milieux alternatifs peuvent également être compatible avec cette procédure.
- Remettre en suspension de poly-L-lysine (PLL) à une concentration de 10 ug / ml dans de l'eau déminéralisée stérile. Pipette 400 pi de la PLL diluée dans chaque puits d'un fond plat à parois noires, clairement 24 tissus et de qualité de la culture.
- Manteau des boîtes de culture de tissu pendant 2 heures dans un 37 ° C tissu incubateur de culture ou toute la nuit dans un réfrigérateur C 4 °.
- Aspirer PLL plats revêtus d'au moins 20 min avant le placage. Laisser le PLL restante de sécher du puits en plaçant des plaques de 24 puits avec le couvercle partiellement entrouverte dans une culture tissulairecapuche. Vérifiez que les puits sont complètement secs avant placage OPC isolés. Les cellules ne seront pas adhérer au plastique qui a liquide PLL présente.
- Préparer N -acétyl-L-cystéine (NAC) solution mère (1,000x): dissoudre 100 mg N -acétyl-L-cystéine (NAC) dans 20 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM). Aliquote et conserver à -20 ° C.
- Préparer la solution mère d'hydrocortisone (1,000x): Ajouter 1 ml d'éthanol à 1 mg d'hydrocortisone et agiter pour dissoudre. Ajouter 19 ml de DMEM, mélanger la solution, aliquote et conserver à -20 ° C. L'addition d'hydrocortisone sur le support de base a été montré pour améliorer la survie des cellules gliales 14.
- Préparer la solution mère de D-biotine (5000 x): Dissoudre 2,5 mg de d-biotine dans 50 ml de PBS. Ajouter 1-2 gouttes x 5 pi de NaOH 0,1 N pour aider à la dissolution. Aliquote et conserver à -20 ° C.
- Préparer la solution de réserve d'insuline (100x): Dissoudre 25 mg d'insuline dans 50 ml de culture de tissus de l'eau de qualité. Ajouter 250 pi of 1 N HCl et mélanger jusqu'à ce que la solution est claire. Stériliser avec un filtre et un magasin de 0,22 um à 4 ° C pendant jusqu'à 6 semaines.
- Préparer la solution mère Sato (100x):
- Préparer la solution de progestérone de stock (25 ug / ul): Dissoudre 2,5 mg de progestérone dans 100 pi d'éthanol.
- Préparer sélénite solution stock de sodium (400 ng / ul): Dissoudre sélénite de sodium à 4 mg dans 100 pi de NaOH 0,1 N. Ajouter 10 ml de DMEM et mélanger.
- A 100 ml de DMEM, ajouter 1 g de l'apo-transferrine humaine, 1 g de sérum-albumine bovine et 160 mg de putrescine et mélanger pour dissoudre complètement. Ajouter 25 pi de solution progestérone boursier, 1000 pi de solution de sélénite de sodium d'actions, et mélanger. Aliquote et conserver à -20 ° C.
- Préparer OPC base de support: 100 ml de DMEM (avec 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamine et 110 mg / L de pyruvate de sodium), on ajoute 100 ul du CNA, 100 pl d'hydrocortisone, 20 pi de d-biotine, 1 ml insuline, 1 ml Sato actions, 100 pi d'oligo-éléments B,2 B-27 ml supplémentaire (50x), et 1 ml de pénicilline / streptomycine (100x). Stériliser avec un filtre et un magasin de 0,22 um à 4 ° C.
- Préparer la solution mère PDGF-AA (1,000x): dissoudre 250 pg dans 12,5 ml de PBS avec 0,1% de sérum albumine bovine (BSA) pour faire une solution / ml à 20 ng. Aliquote et conserver à -80 ° C.
- Préparer des milieux de prolifération OPC: les médias de base OPC complétées avec 20 ng / ml de PDGF-AA.
- Préparer des milieux de différenciation OPC: les médias de base OPC complété avec 45 nM triiodothyronine.
- Préparer tampon de colonne: Pour 500 ml de PBS, ajouter 2,5 g de BSA et 2 ml d'acide éthylènediaminetétra-acétique 0,5 M (EDTA) et ajuster le pH à 7,2. Stériliser avec un filtre et un magasin de 0,22 um à 4 ° C.
2. cerveau de rat Dissection
Remarque: chiots P5-P7 rat sont utilisés dans ce protocole. Chaque cortex raton donne environ 1,5-2,0 x 10 cellules positives 6 A2B5.
- Stériliser tous les équipements de dissection en utilisant un 2506; C bourrelet chauffé stérilisateur.
- Ajouter 15-20 ml de PBS (sans Ca 2+ et Mg 2+) à 50 ml tubes coniques. Un 50 ml tube conique est suffisante pour 3-4 cortex chez les ratons. Placer 50 ml tubes coniques sur la glace. Utilisez 50 ml tubes coniques pour maintenir le tissu de cortex dés lors de la dissection.
- Ajouter PBS froid pour une boîte de 10 cm de Pétri. Ce plat sera utilisé pour la dissection au microscope optique.
- Sacrifier les ratons par décapitation avec de grands ciseaux chirurgicaux. Vaporiser tête avec 70% d'éthanol.
- Extraire le Cerveau Global
- L'aide de petits ciseaux coupent la peau vers le bas de la ligne médiane et derrière les oreilles et les volets peler la peau du dos. Couper le crâne vers le bas à partir de la ligne médiane du tronc cérébral et se terminant au niveau des yeux. Veillez à ne pas couper trop profondément afin de préserver la structure du cortex sous-jacent.
- Faire deux coupes latérales inférieures au cervelet par l'insertion de petits ciseaux chirurgicaux dans le trou occipital. Faire une coupe supplémentaire entre les yeux, fourmierior aux bulbes olfactifs.
- Retirer délicatement chaque moitié du crâne en arrière. Retirer l'ensemble du cerveau et le placer dans la boîte de Petri 10 cm rempli de PBS froid.
- Sous le microscope optique de dissection, retirez les bulbes olfactifs et cervelet avec pinces chirurgicales fines.
- Retournez le cerveau de telle sorte que la surface ventrale est visible au microscope optique.
- Aide de pinces fines droites effectuer une dissection en plaçant forceps fermés conseils entre le cortex et l'hypothalamus à une profondeur d'environ 2/3 du cerveau. Une fois la pince sont en place permettra aux extrémités d'ouvrir. Répétez l'opération pour l'autre hémisphère.
- Taquiner le cortex de l'hypothalamus et les régions du mésencéphale.
- Supprimer l'hypothalamus, le thalamus, le mésencéphale et en maintenant le mésencéphale, à sa face postérieure et le pelage vers l'extrémité antérieure du cerveau. Couper les connexions antérieures.
- Retirer l'hippocampe par carillonner vers l'extérieur, puis couper sa connexion à lacortex à l'aide de fines pinces à dissection courbés.
- Retirer restant striatum par la mise au rebut à partir du cortex sous-jacent dans un mouvement vers l'extérieur en diagonale à l'aide de fines pinces à dissection courbés.
- Effacer les vaisseaux sanguins et les méninges de la surface ventrale du cortex.
- Retourner le cerveau de sorte que la surface dorsale est visible. Méninges et les vaisseaux sanguins devraient être apparente. méninges Peel du cortex sous-jacent à l'aide de fines pinces à dissection. Lancer le pelage de l'emplacement olfactive de fixation de l'ampoule.
- Suivez les étapes 2.4 à 2.14 pour un total de 3-4 ratons.
- Placez 3-4 disséqués cortex chez les ratons dans une boîte de Pétri sec et hacher avec une lame de rasoir stérilisée jusqu'à 1 mm x 1 mm morceaux sont atteints. Prélever des tissus par rinçage lave avec du PBS d'un 50 ml tube conique (étape 2), puis replacer sur la glace.
3. La dissociation enzymatique et mécanique tissulaire
Remarque: Pour cette étape, un kit de dissociation de neurones en fonction de la papaïne est recommandée. avec NeKit de dissociation de l'Oural (P), des dispositions particulières qui sont optimales pour l'isolement de l'OPC sont décrits.
- Préparer la première enzyme de dissociation en diluant enzyme P avec le tampon approprié. Le contenu de chaque conique de 50 ml (1 échantillon) sont remises en suspension avec un total de 1950 ul de mélange enzymatique. Place dans le mélange d'enzymes dans un bain de 37 ° C pendant 10 min.
1 échantillon: 1.900 pi de tampon + 50 pl de la papaïne enzyme - Spin tous les tubes de 50 ml coniques contenant 3-4 dés rat cortex chiot à 300 g pendant 3 min.
- Aspirer le surnageant et ajouter 1.950 pi de solution d'enzyme dans chaque tube de l'échantillon et briser le culot en inversant le tube et en secouant doucement.
- Incuber dans un 37 ° C incubateur de culture de tissu pendant 15 minutes avec rotation du tube continu.
- Pendant les 5 dernières minutes de l'incubation, préparer la seconde enzyme mélange A. Diluer l'enzyme dans sa mémoire tampon appropriée. Un total de 30 ul est ajoutéepour chaque 50 ml conique tube d'échantillon.
Echantillon 1: 20 pl de tampon + 10 ul d'enzyme - Une fois l'incubation terminée ajouter 30 ul du deuxième mélange d'enzymes à chaque tube et mélanger par inversion.
- En utilisant une pipette Pasteur en verre fixé à un dispositif de commande de pipette, dissocier mécaniquement le tissu par pipetage 10-15 fois ou jusqu'à ce que les morceaux de tissu sont de taille réduite et la solution est devenue trouble. Remettre l'échantillon à la 37 ° C tissu incubateur de culture pendant 15 minutes avec rotation continue.
- Pipeter chaque échantillon d'homogénat de tissu 10-15 fois l'aide d'une pipette de 1 ml.
- Pipeter chaque échantillon d'homogénat de tissu 15-20 fois à l'aide d'une pipette 200 ul
- Tous les échantillons revenir à la 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 10 minutes avec rotation continue.
- Ajouter 10 ml de PBS (avec du Ca 2+ et Mg 2+) à chaque échantillon et filtrer l'homogénat à travers un filtre de 40 um des pores placée sur un 50 ml tube. Rincer le filtre avec un 1-2 ml supplémentaires de PBS.
- Regrouper tous les échantillons d'homogénat dans un tube conique de 50 ml et d'acquérir un nombre d'ensemble de cellules.
- Après avoir effectué la numération cellulaire, répartis uniformément dans l'homogénat 15 ml tubes coniques (1 tube pour chaque échantillon). Centrifugeuse pour 10-12 min à 300 x g.
4. Anti-A2B5 application Perle, Colonne purification et placage
- Effectuer des calculs pour tampon de la colonne et les microbilles anti-A2B5. Ajouter 7 ul tampon de colonne pour chaque 1 x 10 6 cellules. Ajouter 2 ul microbilles anti-A2B5 pour chaque 1 x 10 6 cellules.
- Combiner tous les échantillons en remettant en suspension les cellules dans un volume total de 10 ml de tampon de colonne et centrifuger à 300 g pendant 10 à 12 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans la quantité appropriée de tampon de colonne, tel que calculé à l'étape 4.1. Si la pastille est grand et lâche, ajouter seulement environ la moitié du volume de tampon de colonne pour maintenir la luttecorps à la concentration appropriée dans la mise en suspension des cellules.
- Incuber la suspension de cellules pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter microbilles anti-A2B5 (calculée à l'étape 4.1), inverser plusieurs fois et incuber à 4 ° C pendant 30-60 min. Retourner doucement le tube à plusieurs reprises toutes les 10 minutes. De plus longues durées d'incubation peuvent accroître le rendement des cellules, mais peuvent augmenter la liaison non spécifique.
- Ajouter 5 volumes de tampon de colonne. Si les cellules sont remises en suspension dans un volume de 1 ml, ajouter 5 ml de tampon de colonne, alors que si les cellules sont remises en suspension dans 2 ml, ajouter 10 ml de tampon de colonne.
- Centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
- Déterminer le nombre de colonnes LS sera nécessaire pour la purification. Une colonne LS est suffisant pour 15-20 x 10 6 cellules totales.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1000 pi de tampon de colonne par colonne LS utilisé.
- Premier chaque colonne LS en ajoutant 5 ml de tampon de colonne. Recueillir l'écoulement à travers un tube conique de 50 ml. Une fois que les bu de colonneffer ait complètement passé à travers la chambre supérieure, appliquer 1000 ul de la suspension cellulaire à chaque colonne et de permettre aux cellules de se traversent par gravité.
Remarque: Si la densité des cellules est trop élevé, la colonne peut courir lentement. - Immédiatement après la suspension de cellules est passé à travers la colonne, on ajoute lentement 3 ml de tampon de colonne pour chaque colonne pour laver les cellules non liées. Si le lavage est facilement en cours d'exécution à travers la colonne (1 goutte pour chaque 30-45 sec), laver deux fois supplémentaires avec 3 ml de tampon de colonne.
- Retirer chaque colonne et le placer sur un tube conique de 15 ml. Ajouter 5 ml de tampon de colonne et plonger le tampon à travers la colonne à un débit rapide à l'aide du piston en plastique qui est empaqueté avec la colonne. Plongeante sera déloger les cellules liées les libérant de la colonne.
- Augmenter la pureté en exécutant l'échantillon à travers une deuxième série de colonnes LS. Utiliser un tiers du nombre de colonnes utilisées lors du premier passage. Amorcer les colonnes avec 5 ml de tampon de colonne.Laisser le tampon de la colonne de passer à travers la chambre supérieure.
- Etant donné que le volume de la suspension cellulaire sera beaucoup plus grande, appliquer uniformément 1.000 pi de suspension cellulaire à chaque colonne et permettre à la suspension de passer à travers la chambre supérieure de la colonne avant la reconstitution avec un supplément de 1000 pi.
- Une fois que la suspension de cellules a été complètement appliqué à la deuxième série de colonnes, laver 2-3 fois avec 3 ml de tampon de colonne.
- Retirez chaque colonne et placez-le sur un tube de 15 ml conique stérile. Ajouter 5 ml de tampon de colonne et plonger le tampon à l'aide du piston en plastique qui est empaqueté avec la colonne. Plongeante sera déloger les cellules liées les libérant de la colonne.
- Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 12-15 min. Le culot doit apparaître compact.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 à 10 ml de milieu OPC prolifération préchauffé (milieu de base supplémenté avec OPC PDGF-AA 20 ng / ml).
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Plaque les cellules. Diluer les cellules à 60.000 cellules / ml avec les médias OPC de prolifération. Dans chaque noir, clair fond 24 ainsi, pipette 500 pi de cellules le long du côté du puits pour obtenir 30.000 cellules par puits. Mélanger les cellules en secouant la plaque horizontalement à l'aide d'un chiffre huit mouvement. Si la réalisation du test en 48, 96 ou 384 puits plaques, ajouter 15.000, 7.500 ou 1.500 cellules par puits, respectivement. Ces chiffres peuvent être ajustés en fonction de caractéristiques individuelles de la plaque.
- Préparer une plaque séparée pour la journée 0 cultures de contrôle de base. Cette plaque de commande doit être fixé avec 4% de paraformaldehyde comme décrit à la section 5.7, lorsque la différenciation est initié le jour 0.
- Culture des cellules dans des milieux de prolifération OPC à 37 ° C pendant 3 jours sans changement de support.
5. L'induction de la différenciation et OPC Fixation avec 4% de paraformaldehyde
Note: Lors du test de l'effet de petites molécules sur oligodendrogenèse, nous dissolv régulièremente médicaments dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer des stocks 1,000x qui peuvent ensuite être stockés à -80 ° C et diluées dans du milieu directement SATO pour obtenir une concentration finale de 0,1% de DMSO. Nous avons observé aucun changement dans les deux la prolifération ou la différenciation OPC en utilisant cette concentration de DMSO (données non présentées).
- médias de base OPC préchauffer à 37 ° C et dégeler les stocks de traitement de la toxicomanie à la température ambiante. Lors de l'exécution des traitements en double exemplaire, préparer environ 1,25 ml de milieu par groupe de traitement dans un tube de 1,5 ml. Pour les échantillons en triple, utiliser 2 tubes ml de capacité de centrifugeuses pour tenir compte de jeu.
- Préparer les mélanges maîtres de traitement pour les puits répliqués en diluant les stocks de traitement directement dans OPC médias de base. vortex brièvement ou mélanger doucement chaque mastermix d'assurer une répartition homogène du traitement.
- Préparer 45 nM triiodothyronine (T 3) que le contrôle positif et le véhicule approprié comme contrôle négatif. Diluer 10 mM T 3 disponible1: 1 000 dans 1 ml de milieu de base OPC puis diluer dans le cadre d'un traitement mélange pour réduire la concentration finale de DMSO si nécessaire.
- Aspirer le support du puits de culture une groupe de traitement à la fois, afin d'éviter le séchage des cellules. Utiliser un embout de pipette de 200 pi sur l'extrémité de la pipette Pasteur en verre pour éviter racler la matière noire sur les côtés du puits et dans la culture.
- Ajouter lentement 500 pl de mélange maître de traitement le long du côté du puits à l'aide d'une pipette de 1 ml.
- Incuber les cultures pour la période souhaitée, d'effectuer un échange de médias complète avec les médias de traitement frais tous les 2-3 jours. On observe régulièrement un 30-40% MBP + culture au bout de 4 jours dans les médias de différenciation.
- À la fin de la période de traitement désiré, préparer frais paraformaldéhyde 4% (PFA) ou dégeler un stock congelé à la température ambiante. ATTENTION: PFA est extrêmement toxique et doit être préparé dans une hotte.
- Aspirer les médias et ajouter lentement 4001; l de PFA sur le côté du puits pour fixer les cellules. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante.
- Aspirer le PFA et ajouter lentement 500 pl de PBS stérile D-(avec Ca 2+ et Mg 2+) sur le côté du puits pour laver les cellules. Répétez le lavage d'un total de deux fois plus. Ne pas aspirer le lavage final.
- Enveloppez la plaque dans parafilm et conserver à 4 ° C pour un traitement ultérieur ou passer directement à l'étape suivante. Les plaques peuvent être conservées pendant plusieurs semaines.
6. Immunocytochimie et la quantification de protéine basique de myéline
Remarque: Lors de l'exécution des procédures de manipulation de liquides dans les plaques et 24, il est recommandé de travailler vite pour éviter le dessèchement des cellules. Ici, l'utilisation d'un aspirateur à vide multi-canaux et multi-canal pipette sont recommandés.
- Amener la plaque à la température ambiante, aspirer le puits et ajouter 250 ul de D-PBS (avec du Ca 2+ et Mg 2+) contenant 0,1% de Triton X-100 et 5%sérum de chèvre normal (NGS). Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure avec agitation orbitale douce.
- Préparer la solution d'incubation par dilution primaire monoclonal de souris anti-MBP anticorps 1: 1000 et un anticorps polyclonal de lapin anti-Actine 1: 200 dans du D-PBS (avec du Ca 2+ et Mg 2+) contenant 5% de NGS. En variante, polyclonal de lapin anti-Olig2 à 1: 1000 peut être utilisé pour la normalisation des oligodendrocytes spécifique dans des cultures mixtes gliales. Préparer assez de solution primaire pour accueillir 250 pi par puits.
- Incuber des anticorps primaires à 4 ° C pendant la nuit pour les 16-18 heures avec agitation orbitale douce.
- Aspirer la solution d'incubation primaire et laver les cellules 3 x 10 min avec 500 ul de D-PBS (avec du Ca 2+ et Mg 2+) à la température ambiante avec une agitation douce orbital.
- En lavant la plaque, préparer la solution d'incubation en diluant secondaire anti-souris 680 anti-lapin et d'anticorps 800 1: 500 dans du D-PBS (avec du Ca 2+ Mg 2+) contenant 5% de NGS. Minimiser l'exposition de la lumière ambiante lors de la préparation de cette solution.
- Aspirer le lavage final et ajouter 250 pi de solution d'incubation secondaire. Protéger la plaque de la lumière et incuber à température ambiante pendant 1 heure avec agitation orbitale douce.
- Aspirer la solution d'incubation secondaire et laver les puits 3 x 10 min avec 500 ul de D-PBS (avec du Ca 2+ et Mg 2+) à la température ambiante avec une agitation douce orbital.
- Balayer la plaque en utilisant un système d'imagerie capable de détecter à 700 nm et les émissions de fluorescence à 800 nm. Comme point de départ, régler le décalage de 3 et sensibilités à 1,5 pour MBP, 5.0 pour l'actine, et 3,5 pour Olig2 focal. Ajuster les valeurs de sensibilité au besoin pour éviter le signal de surexposition.
- Quantifier l'ampleur des oligodendrogenèse utilisant des méthodes logicielles semi-automatisés.
- En utilisant le logiciel, réglez le mode d'analyse de plaque "24 Eh bien" et aligner des cercles autour de til périmètre extérieur des puits numérisés. Réglez le canal de normalisation à "800" et d'exporter les totaux et relatifs intensités de fluorescence pour le 700 nm (MBP) et 800 nm (Olig2 / actine) canaux.
- Diviser l'intensité à 700 nm par l'intensité à 800 nm pour obtenir l'expression de MBP normalisée en unités relatives de fluorescence. Calculer la moyenne des mesures répétées et l'échelle de l'expression à la Journée 0 contrôles + PDGF selon les besoins de l'analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OPC de A2B5 positifs sont isolés par sélection cellulaire positive en utilisant un système de séparation de la colonne magnétique. Avant la procédure d'isolement, l'ensemble du cerveau est retiré de ratons qui sont entre P5 et P7. Une fois l'ensemble du cerveau est détaché avec succès du crâne, des bulbes olfactifs et le cervelet sont enlevés à l'aide de pinces chirurgicales fines (figure 1A). Afin d'isoler des tissus du cortex cérébral de l'hypothalamus, le thalamus et le mésencéphale sont excisés par dissection minutieuse (figure 1B). Ensuite, l'hippocampe et le striatum sont enlevés à l'aide de pinces chirurgicales courbées (figure 1C - D). Le processus d'isolement élimine efficacement les cellules méningées et fibroblastes, mais la digestion enzymatique est améliorée lorsque les méninges et vasculaire sont supprimés (figure 1E). Enfin, les blocs de tissu de 1 mm x 1 mm sont préparés pour les étapes ultérieures de dissociation du tissu (figure 1F).
Une bonne isolation OPC devrait se traduire par un culot cellulaire compact après l'étape d'essorage final (figure 2A). Une fois plaqué ces cultures seront relativement exempt de débris cellulaires lorsqu'on les observe au microscope (figure 2B). Une isolation optimale peut entraîner une grande culot et moelleux en raison de la présence de grandes quantités de débris cellulaires. Ces débris adhère fortement à la cuve PLL-couché et peut interférer avec la culture (figure 2C). Si un grand et moelleux culot matérialise, il peut aider à remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS et répétez l'essorage final pendant 10 min à <300 x g. Une fois que l'isolement est terminée, la pureté des cultures peut être évaluée par cytométrie en flux pour déterminer le pourcentage de cellules positives A2B5. Un isolement réussi devrait se traduire par un pool de cellules qui sont> 95% positif pour A2B5 (figure 2D - F). Par rapport aux cellules colorées avec un anticorps anti-A2B5 colorant conjugué fluorescent, les cellules non colorées doivent apparaître comme une population négative et peut être utilisé comme une référence de base pour déclenchement. En outre, nous avons précédemment montré que la sélection des OPC en utilisant les rendements de l'antigène de A2B5 cultures qui tachent positif pour PDGFRa par immunocytochimie 11.
Comme démontré par immunocytochimie, OPC au début du traitement (jour 0) sont Olig2 + / MBP - tandis que les cellules sont Olig2 + / MBP + par Jour 4 (Figure 3). La confluence optimale des OPC et des oligodendrocytes au jour 0 et le jour 4 sont présentées dans les images de champ lumineux représentatifs (figure 4A). L'absence d'expression MBP au jour 0 sert de base de référence pour quantifier oligodendrogenèse. différenciation spontanée à la suite du retrait du PDGF-AA sert de témoin négatif, alors que 45 nM d'hormone thyroïdienne (triiodothyronine; T3) peut être utilisé en tant que témoin positif 11,15. Quétiapine, également connu sous le Seroquel, et clemastine, aussi connu comme Tavist, sont des médicaments qui ont été montrés pour accélérer oligodendrogenèse in vitro et peuvent être utilisés comme contrôles positifs supplémentaires 16,17 approuvé par la FDA. La figure 4B montre un représentant infrarouge à deux canaux scan fluorescent démontrant les résultats attendus pour chacune de ces conditions, en triple exemplaire. signaux d'actine et MBP ont été pseudocolored vert et rouge respectivement de sorte que les cultures hautement différenciés apparaissent en jaune en images fusionnées. Les résultats montrent que l'expression de MBP au Jour 4 dans la condition de retrait PDGF était de 4,5 ± 1,4 fois plus élevée par rapport à Jour 0, tandis que les changements de pliage en MBP due au traitement par hormone thyroïdienne, la quétiapine et clemastine étaient de 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 et 32,8 ± 0,5, respectivement (figure 4C). La robustesse et la précision de l'analyse sont mises en évidence par le smtous les écarts-types parmi les échantillons en triple et la grande fenêtre d'activation de traitement qui est d'environ 20 écarts-types au-dessus de la commande de retrait PDGF.
Bien que l'actine sert en tant que gène de référence fiable pour la normalisation dans les cultures d'oligodendrocytes, les gènes de référence alternatifs peuvent également être utilisés. Olig2 est un facteur de transcription nucléaire qui est exprimé de manière constitutive dans des cellules de la lignée des oligodendrocytes. Son motif spécifique et constitutive expression peut ainsi fournir une stratégie de normalisation plus préférable dans les situations de culture hétérogènes. La figure 5 montre que, dans les cultures OPC différenciées avec 10 nM d'hormone thyroïdienne, le facteur de variation calculé MBP expression relative au retrait du PDGF est le même lors de l'utilisation, soit Olig2 ou actine pour la normalisation. On peut supposer que, depuis les cultures OPC dans cette expérience étaient très pure, les deux protéines peuvent être utilisés de manière fiable pour la normalisation. Cependant, nous often observer une petite population de cellules OLIG2 négatif par Jour 4, mais le rapport de cette population à la population de Olig2 positif ne semble pas différer de manière significative entre le retrait PDGF et le groupe T3 traité. Ainsi, les facteurs de variation ne sont pas affectés. Dans un scénario où un traitement peut provoquer la prolifération de types de cellules Olig2 négatif, le choix d'un anticorps de normalisation doivent être soigneusement pris en compte.
Figure 1:.. Rat procédure cerveau de dissection Description pas à pas de la procédure de dissection S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: La cytométrie en flux analyse de isoléOPC. (A) après purification sur colonne magnétique, la population de cellules lié est plongé sur la colonne et centrifugé pour former un culot compact. La quantité de débris est indiquée par la taille de la pastille. (B) Si le culot est compact, les débris seront minimes dans la culture. (C) Une pastille grand et moelleux se traduit généralement par une culture avec des débris lourds. La pureté de la culture est déterminée par cytométrie de flux en utilisant un anticorps anti-souris A2B5 rat qui est conjugué à APC. (D) Les cellules mortes et les débris sont exclus de l'analyse comme indiqué sur la dispersion et la diffusion latérale des parcelles avant. (E) La population positive A2B5 peut être déterminée en utilisant une tache échantillonné comme une référence de base pour déclenchement. (F) OPC succès isolés doivent être> 95% positif pour A2B5. S'il vous plaît cliquez ici pour rivaliserwa version agrandie de cette figure.
Figure 3:. Culture OPC et de la procédure de différenciation La fluorescence à balayage (DIFS) dosage à double infrarouge commence avec OPC de rat isolatedA2B5 positif fraîchement plaquée sur des récipients de culture PLL revêtues (jour 3). Ces cultures sont proliféré pendant 3 jours en présence de 20 ml de PDGF-AA / ng, puis traitées avec des facteurs expérimentaux dans les médias PDGF sans frais au jour 0. médias de traitement est entièrement reconstitué le jour 2, et les cellules sont fixées avec paraformaldéhyde 4% le jour 4. Immunocytochimie pour Olig2 (vert) et MBP (rouge) a été effectuée sur des cultures représentatives au jour 0 et le jour 4 en utilisant Dapi (bleu) comme contre-colorant nucléaire. Ces cultures présentent coloration constitutive pour la casserole oligodendrocytes lignée marqueur cellulaire Olig2 aux jours 0 et 4, alors que la coloration pour le marqueur des oligodendrocytes matures MBP est seulement evident au jour 4. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: la quantification de MBP en utilisant l'analyse de fluorescence à balayage à double infrarouge (DIFS) (A) La densité des cultures OPC au jour 0 et le jour 4 requise pour une performance optimale de dosage.. (B) représentatifs des analyses de fluorescence à double infrarouge. OPC ont été différenciées dans des plaques à 24 puits pendant 4 jours en présence de 45 nM de T3, 1 uM quétiapine, 1 uM de clemastine, ou 0,1% de DMSO, en triple exemplaire. Une plaque séparée contenant les OPC qui ont été fixés au jour 0 (+ PDGF) a été traité en parallèle. Actine (pseudocolored vert) et MBP (pseudocolored rouge) ont été simultanément quantifiés à l'aide d'un scanner Odyssey Licor mettre à détecter 700 nm et 800 nm émissions. (
Figure 5: Olig2 est une protéine de référence fiable pour normaliser l'expression de MBP dans les oligodendrocytes OPC ont été différenciées en trois exemplaires en présence de 10 nM T3 ou 0,1% de DMSO contrôle du véhicule dans les plaques à 24 puits pendant 4 jours.. Le dosage à double infrarouge fluorescence numérisation a été effectuée en utilisant des anticorps primaires anti-actine anti-Olig2 ou pour la normalisation. Olig2 / actine et MBP ont été simultanément quantifiés à l'aide d'un scanner Odyssey Licor mettre à détecter 700 nm et 800 nm émissions. MBP expression avait pas dermalized Olig2 l'une ou l'expression d'actine, et les résultats ont été mis à l'échelle pour le contrôle de DMSO de 0,1%. Les unités de fluorescence relative moyenne ± écart-type ont été tracée en utilisant GraphPad Prism 6. Les résultats montrent que le changement fois calculée est de même lorsque la normalisation à l'une des deux protéines de référence.
Figure 6:. Effet du Triton X-100 sur la coloration OPC MBP ont été différenciées dans des plaques à 24 puits pendant 4 jours en présence de 45 nM de T3 ou 0,1% de DMSO. Les cultures ont été ensuite fixées avec 4% de PFA et colorées pour Olig2 et MBP en utilisant deux protocoles d'immunocytochimie différents. Pour l'échantillon à haute Triton X-100, les cellules ont été perméabilisées pendant 1 heure avec 0,4% de Triton X -100 et toutes les étapes d'incubation d'anticorps ont été réalisées en présence de 0,1% de Triton X-100. La faible échantillon de Triton X-100, les cellules ont été perméabilisées pendant 1 heure avec 0,1% de Triton X-100, tandis que Antibody incubations ont été effectuées sans Triton X-100. Olig2 et MBP ont été visualisées avec des secondaires et des images de colorants fluorescents conjugués ont été acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence en fonction de la caméra. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole présenté ici décrit une méthode rapide et fiable pour isoler les OPC de rat et de quantifier en oligodendrogenèse vitro en réponse à des facteurs expérimentaux. Utilisation de la sélection positive, les rendements élevés de OPC viables et purs sont utilisés directement à des fins expérimentales. Cette méthode simplifie l'isolement, la culture, et les étapes de différenciation dans un délai de 1 semaine, et les cellules fixes peut être facilement stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines sans aucune perte de sensibilité du test.
Un avantage majeur avec les dosages de fluorescence par balayage électronique est que l'acquisition et l'analyse des données est considérablement accéléré par rapport à des techniques de microscopie à base de caméras traditionnelles. Bien que la microscopie a été utilisé avec succès dans les écrans à haut débit pour identifier les inducteurs de différenciation OPC, l'acquisition de données est intrinsèquement plus lent, car il nécessite une programmation de séquences de capture d'image, plusieurs heures de collecte de données, l'analyse de centaines de thousands de fichiers d'images, et des algorithmes définis par l'utilisateur de distinguer les corps cellulaires individuelles pour la normalisation ou l'analyse 18,19. En outre, avec des systèmes de microscopie par caméra, il est impossible d'acquérir des données à partir de toute la surface du récipient de culture. Au lieu de cela, des images représentatives doivent être capturées à partir de différents domaines au sein d'un seul puits, ce qui peut conduire à des biais de position et de résultats faussement positifs. Par comparaison, ce test détecte l'expression de MBP de toutes les cellules dans un puits donné, et plusieurs plaques peuvent être numérisés simultanément. Bien que ce procédé peut être adapté pour une utilisation dans des formats de 96 puits ou 384 puits, la plaque de 24 puits peut être préféré lorsque moins de traitements sont actuellement testées. Nous avons observé que la perte de cellules dans la plaque de 24 puits en raison de la manipulation de liquides est réduite au minimum, ce qui est une complication qui doit être considéré lors de la conception des expériences de plus grande capacité.
Un paramètre critique de l'essai est la densité des cellules lorsque Differentiation est initié au jour 0. Les cultures avec trop peu de cellules semblent différencier plus lentement et meurent, alors que les cultures à haute densité présentent différenciation spontanée. Les deux situations peuvent réduire la plage dynamique et la fiabilité du test. Pour atteindre un équilibre optimal entre la santé des cellules et la densité cellulaire, nous cultivons les OPC pour 3 jours sans un échange de médias ou de la supplémentation des frais PDGF-AA. Nous émettons l'hypothèse que, puisque la concentration de PDGF-AA dans les baisses de médias par Jour 3 in vitro (jour 0) à la suite du catabolisme cellulaire, le taux de prolifération des cellules ralentira que cette prolifération est réduite par le premier jour du PDGF AA retrait. Cette technique fonctionne mieux lorsque les cellules sont uniformément distribués au cours de placage. Pipetage des cellules le long du côté du puits et en les mélangeant à l'aide d'un chiffre huit mouvement devrait favoriser une distribution uniforme. Pipettant dans le centre du puits tend à produire des amas de cellules sur les bords du puits avec quelquescellules er adhérant au centre. Ce phénomène peut être dû à la perturbation de la couche fraîchement séché PLL par les forces de pipetage de liquides. L'accumulation de cellules dans le périmètre peut réduire la sensibilité test en raison de la différenciation dépendant de la densité. Il est important de noter que les différences significatives dans l'intensité du signal A / Olig2 actine, peuvent se produire entre PDGF cultures de retrait traités avec le médicament et de contrôle. Considérablement diminué actine / signaux Olig2 peut indiquer la toxicité des médicaments, alors augmenté de façon significative du signal / Olig2 actine peut indiquer la prolifération induite par le médicament. On observe normalement un signal actine / de Olig2 légèrement plus élevé de cellules traitées avec des médicaments pro-différenciation par rapport aux contrôles de sevrage PDGF. Nous attribuons cette différence à un taux plus élevé de l'apoptose spontanée dans le groupe de retrait du PDGF sur la procédure de différenciation de 4 jours. Lors de l'évaluation oligodendrogenèse, la normalisation de MBP à l'actine / Olig2 devrait corriger les différences de nombre de cellules. Pour évaluer toxiville et la prolifération en utilisant ce dosage, l'anticorps anti-MBP peut être échangé contre des anticorps primaires dirigés contre les marqueurs appropriés.
Lorsque expériences nécessitent à la fois une évaluation quantitative et qualitative, il est important de limiter l'exposition des oligodendrocytes de rat cultures fixées à Triton X-100 lors de l'utilisation de 4% PFA pour fixer les cellules. D'autres protocoles d'immunocytochimie pour les cultures d'oligodendrocytes, qui comprennent typiquement le Triton X-100 pendant les deux étapes d'incubation d'anticorps afin d'améliorer l'accessibilité de l'épitope d'anticorps, peuvent être utilisés avec succès en fonction des exigences expérimentales. D'autre part, bien que la MBP est une protéine intracellulaire, il peut être possible d'exclure le Triton X-100 entièrement si d'autres méthodes de fixation qui sont utilisés de façon adéquate perméabiliser les cellules. En utilisant les conditions décrites ici, nous avons observé que le Triton X-100 affecte la morphologie observée des oligodendrocytes ainsi que la localisation de la coloration MBPlorsqu'il est utilisé à des concentrations élevées. Nous ne voyons pas une baisse importante de la coloration des anticorps quand Triton X-100 est omis dans les étapes anticorps d'incubation. Comme le montre la Figure 6, comprenant 0,4% de Triton X-100 dans la perméabilisation et l'étape de blocage, et 0,1% de Triton X-100 pendant anticorps incubation, réduit la détection de processus de la myéline et des résultats en discontinu coloration MBP. Par conséquent, pour l'évaluation quantitative et qualitative, il peut être suffisant d'utiliser une plus faible concentration de Triton X-100 comme décrit ici.
Bien que l'utilisation des OPC de A2B5-sélectionné de rats peut être avantageux, nous avons observé des résultats comparables dans l'essai de fluorescence à balayage à double infrarouge (DIFS) utilisant OPC de A2B5-sélectionné de souris C57BL / 6, même si le rendement des cellules par souris est généralement beaucoup inférieures (données non présentées). D'autres protocoles de purification OPC peuvent également être compatibles avec ce dosage. Par exemple, un marqueur des oligodendrocytes O4 peut être utilisée comme un antigène pour purifier intermediate précurseurs d'oligodendrocytes de scène à l'aide de billes magnétiques 20. Comme une alternative aux méthodes magnétiques à base, les OPC peuvent être enrichis de 9 jours anciennes cultures gliales mixtes contenant les astrocytes et la microglie en secouant et d'adhérence différentielle orbitales méthodes salut-vitesse 21. En outre, immuno-panoramique procédures qui intègrent à la fois la sélection négative et positive cellule peut être utilisé si la pureté de la culture est préférable à de hauts rendements cellulaires 22. En plus d'examiner la façon dont la thérapeutique peuvent directement améliorer la différenciation des OPC dans des cultures pures, il est parfois nécessaire de prendre en considération les effets indirects de la drogue par le biais d'autres types de cellules dans un système de co-culture. Dans la SEP, l'infiltration de cellules T effectrices autoréactifs dans le SNC est pensé pour jouer un rôle dans la progression de la maladie 23. cellules T effectrices peuvent sécréter des facteurs pro-inflammatoires qui peuvent inhiber la différenciation des OPC sur les sites de démyélinisation. Il est donc intéressant d'identifier Therapeutics qui peuvent protéger les OPC et de bloquer ces facteurs pro-inflammatoires de l'exacerbation des blessures. Le dosage de DIFS peut être idéal pour la modélisation de cette activité que les cellules T se développent en suspension et peuvent être éliminés par lavage de la culture des oligodendrocytes MBP avant quantification. Pour les études de co-culture impliquant des cellules adhérentes telles que des neurones, des astrocytes et la microglie,, Olig2 normalisation peut être utilisé pour collecter des données à partir des oligodendrocytes en particulier. Ainsi, la souplesse de l'essai de DIFS peut faciliter une variété de modèles expérimentaux.
En conclusion, ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour quantifier la oligodendrogenèse des OPC de rat A2B5 positif in vitro. Cette méthode d'isolement offre toujours des rendements élevés d'OPC viables qui répondent aux signaux de différenciation établies. analyse sensible peut être réalisée dans des récipients de format multi-puits en utilisant une variété de paradigmes expérimentaux, qui étend l'utilité de ce système pour many différentes applications. En outre, le dosage de DIFS peut être adapté pour le criblage de médicaments à haut débit, ou peut être utilisé pour vérifier les résultats d'essais à faible débit telle que la PCR quantitative et Western blot. Surtout, ce système peut offrir un moyen simple mais efficace pour l'identification des OPC thérapies ciblées dans les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Grant commanditaire: National Institutes of Health; Numéro de subvention: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
