Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53764
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

הולכה עצבית יעילה במערכת העצבים המרכזית היונקת (CNS) דורשת מעטפת המיאלין של אקסונים על ידי oligodendrocytes. במהלך פיתוח, oligodendrocytes להתעורר מתוך מאגר של ובתאים oligodendrocyte (OPCs) כי הם חשבו להגר מאזורי חדרית של המוח קדמי בפיתוח עצבי צינור 1. לאחר OPCs הגירה להתמיין oligodendrocytes בוגרת, myelinating כי לא רק להקל התפשטות הדחף יעיל, אלא גם לספק אקסונים עם תמיכה trophic 2. המבוגר CNS שומרת אוכלוסיה שופעת של OPCs כי הם מפוזרים בכל רחבי החומר האפור-לבן המהוות כ 5-8% מכלל התאים 3. בעקבות עלבון demyelinating, OPCs להגר באתר של פציעה, להתרבות, ולבדל להחליף נדני המיאלין אבודים או פגומים על אקסונים חשופים. עם זאת, בכמה הגדרות מחלה / פציעה, תהליך זה נמצא להיות יעיל או יכול להיכשל 4 לחלוטין. בשעה שdemyelination כרוני הוא חשב להוסיף את נטל המחלה, oligodendrogenesis ויצירת מיאלין יעיל עשוי להקל תסמינים 5. בהתאם לכך, כבר היה עניין ללמוד OPCs במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים הניסיונות על oligodendrogenesis.

תובנה השלבים השונים של בידול oligodendrocyte כבר מתאפשר על ידי זיהוי של סמני תאים ספציפיים הבמה. עצמית חידוש ובתאים מוקדם מוגדרים על ידי הביטוי שלהם של אלפא הקולטן לגורם הצמיחה נגזר טסיות (PDGFRα), עצביים / גליה אנטיגן 2 (NG2) ו A2B5 6 - 8. כפי OPCs ליזום תכנית הבידול שלהם לסגת מחזור התא, הם downregulate ביטוי של סמנים אלה ולהתחיל לבטא חלבונים מעידים premyelinating oligodendrocytes כולל המחזורי-נוקלאוטיד 3'-phosphodiesterase (CNPase) ו O4. לבסוף, הבידול שלהם לתוך oligodendroc בוגרת יותרytes מתאפיין ביטוי של חלבונים הקשורים המיאלין, כולל גליקופרוטאין הקשורים המיאלין (הפצ"ר), חלבון proteolipid (PLP), ואת חלבון המיאלין הבסיסי (MBP). MBP הוא חלבון קרום היקפי תאיים מרכיב עיקרי של מעטפת המיאלין. עכברים שחסר MBP לפתח פנוטיפ חמור שבו myelination CNS הוא ירד מוביל משמעותי רעידות, עוויתות 9,10 מוות מוקדם. תפקיד חשוב זה של MBP ב myelination הוביל שימוש בו כסמן של בידול oligodendrocyte היא במבחנת in vivo 11.

כימות של MBP יכולה להיות מושגת באמצעות מתודולוגיות שונות. RT-PCR וניתוח כתם המערבי לאפשר כימות של רמות MBP תחת משטרי טיפול שונים. Immunocytochemistry היא שיטה איכותית נפוצה שיכולה גם להיות כמותית כאשר גישות מיקרוסקופיה מבוסס מצלמה משמשות. למרות שמערכות אלה מהימנות יסודיש המחקר של בידול oligodendrocyte, הם כל החסרונות שלהם כי להגביל את השימוש שלהם ב ההקרנה סמים. ראשית, כמות OPCs העיקרית הדרושים RT-PCR וניתוח כתם המערבי מפחית את מספר משתנים שיכולים להיבחן בו זמנית. בעוד דרישת תא immunocytochemistry היא הרבה יותר נמוכה, זמן ניכר חייב להיות מוקדש כל ניסוי אם כימות היא מטרה. תמונות רבות חייבות להיות בשבי ואז לכמת כדי להקל על הניתוח הניסיון. אזהרות אלה הופכים מכשולים חשובים לשקול ללימודים הדורשים הערכת קצב העברת נתונים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה אשר מנצל היבטים בסיסיים משני immunocytochemistry ומתודולוגיות כתם המערבי כימות המיאלין, תוך הפחתה משמעותית של שניהם את מספר התאים הדרושים זמן להשלמת ניתוח כמותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) ואוניברסיטת ג'ונס הופקינס הספר לרפואה.

1. הכנת צלחות assay, פתרונות המניות, ו OPC Media Base

הערה: בסיס העכברוש OPC (סאטו) תקשורת המתוארת כאן כבר נגזרה מחקרים שפורסם בעבר 12,13. ניסוחי מדיה אלטרנטיביים יכולים להיות גם תואמים עם הליך זה.

  1. Resuspend-פולי- L- ליזין (PLL) לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים סטריליים deionized. פיפטה 400 μl של PLL בדילול לבאר כל צלחת תרבות כיתה שחורה קירות, ברורה תחתונה 24 גם רקמות.
  2. תרבות מנות מעיל רקמה 2 שעות בתוך חממה תרבות 37 ° C רקמה או לילה במקרר 4 ° C..
  3. לשאוב PLL מן המנות צופה לפחות 20 דקות לפני ציפוי. אפשר הנותרים PLL להתייבש מהבאר ידי הצבת 24 צלחות גם עם מכסה פתוחה חלקית תרבית רקמהמכסה מנוע. ודאו הבארות יבשות לחלוטין לפני ציפוי OPCs המבודד. תאים לא לדבוק פלסטיק, שיש לו בהווה PLL נוזלי.
  4. הכן N -Acetyl-L-ציסטאין (NAC) פתרון המניות (1,000x): ממיסים 100 מ"ג N -Acetyl-L-ציסטאין (NAC) ב 20 מ"ל של מדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  5. הכן פתרון המניות הידרוקורטיזון (1,000x): הוסף 1 מ"ל של אתנול ל 1 מ"ג הידרוקורטיזון מערבולת לפזר. להוסיף 19 מ"ל של DMEM, לערבב את הפתרון, aliquot ולאחסן ב -20 ° C. התוספת של הידרוקורטיזון לתקשורת הבסיס הוכחה כדי לשפר את ההישרדות של תאי גליה 14.
  6. הכן פתרון מניות ד-ביוטין (5,000x): ממיסים 2.5 מ"ג ביוטין ד ב 50 מ"ל של PBS. להוסיף 1-2 x 5 טיפות μl של 0.1 N NaOH כדי לסייע בפירוק. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  7. כן פתרון מניות אינסולין (100x): ממסי 25 מ"ג אינסולין ב 50 מ"ל מי כיתה בתרבית רקמה. הוסף 250 μl of 1 N HCl ומערבבים עד פתרון ברור. לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שבועות.
  8. כן פתרון מניות סאטו (100x):
    1. כן פתרון מניות פרוגסטרון (25 מיקרוגרם / μl): ממסי פרוגסטרון 2.5 מ"ג ב 100 μl של אתנול.
    2. כן פתרון מניות סלניט נתרן (400 ng / μl): ממסי סלניט נתרן 4 מ"ג ב 100 μl של 0.1 N NaOH. הוסף 10 מ"ל של DMEM ומערבבים.
    3. ל -100 מ"ל של DMEM, להוסיף 1 גרם של האדם apo-transferrin, 1 גרם של אלבומין בסרום שור, ו -160 מ"ג של פוטרסין ומערבבים לפזר באופן מלא. הוסף 25 μl של פתרון המניות פרוגסטרון, 1,000 μl של פתרון המניות סלניט נתרן, ומערבבים. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  9. הכן בסיס מדיה OPC: לכל 100 מ"ל של DMEM (עם 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז, L- גלוטמין, ו -110 מ"ג / L פירובט נתרן), להוסיף 100 NAC μl, 100 הידרוקורטיזון μl, 20 μl ד-ביוטין, 1 מ"ל אינסולין, 1 מיליליטר מניות סאטו, 100 μl יסודות קורט B,2 מ"ל B-27 תוספת (50x), ו 1 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (100x). לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הכן פתרון המניות PDGF-AA (1,000x): ממיסים 250 מיקרוגרם ב 12.5 מ"ל של PBS עם אלבומין 0.1% שור (BSA) לבצע פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot ולאחסן ב -80 ° C.
  11. כן תקשורת התפשטות OPC: בסיס מדיה OPC בתוספת 20 ng / ml PDGF-AA.
  12. כן תקשורת בידול OPC: בסיס מדיה OPC בתוספת 45 triiodothyronine ננומטר.
  13. הכן טור הצפת: 500 מ"ל של PBS, להוסיף 2.5 גרם של BSA ו -2 מ"ל של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולהתאים את ה- pH ל -7.2. לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

2. מוח החולדה Dissection

הערה: גורי חולדה P5-P7 משמשים בפרוטוקול זה. כל קליפת גור עכברוש בתשואה של כ 1.5-2.0 x 10 6 תאים חיוביים A2B5.

  1. לעקר את כל הציוד לנתיחה באמצעות 2506; C מעקר חרוז מחומם.
  2. להוסיף 15-20 מ"ל של PBS (ללא Ca 2 + ו Mg 2+) 50 מ"ל צינורות חרוטי. שפופרת 50 מיליליטר חרוטים אחת מספיקה עבור הקורטקס עכברוש גור 3-4. מניח 50 מ"ל צינורות חרוטים על קרח. השתמש 50 מ"ל צינורות חרוטי להחזיק רקמות קליפה לקוביות במהלך לנתיחה.
  3. הוסף קר PBS על צלחת 10 ס"מ פטרי. המנה זו תשמש לנתיחה תחת מיקרוסקופ האור.
  4. להקריב גורי חולדה על ידי עריפת הראש עם מספרי כירורגיות גדולות. תרסיס ראש עם 70% אתנול.
  5. חלץ את המוח כולו
    1. מספריים קטנים באמצעות לחתוך את העור לאורך קו האמצע ומאחורי האוזניים ואת שולי העור לקלף בחזרה. חותכים את הגולגולת לאורך קו ההפרדה החל גזע המוח ומסתיים העיניים. היזהר שלא לחתוך עמוק מדי כדי לשמר את המבנה של קליפה הבסיסית.
    2. לעשות שני חתכים לרוחב נחים המוחון ידי החדרת מספרי כירורגיות קטנות לתוך מגנום foramen. תן קיצוץ נוסף בין העיניים, נמלהerior כדי נורה חוש הריח.
    3. בזהירות לקלף כל מחצית של גולגולת אחורית. הסר את המוח ואת המקום כולו ב -10 ס"מ צלחת פטרי מלא PBS קר.
  6. תחת מיקרוסקופ האור לנתיחה, להסיר את נורות המוח קטן חוש ריח עם מלקחי כירורגיות בסדר.
  7. תהפכו את המוח כך את פני השטח הגחון גלוי תחת מיקרוסקופ אור.
  8. בעזרת מלקחיים ישר בסדר לבצע דיסקציה קהה ידי הצבת טיפי מלקחיים סגורים שבין הקליפה וההיפותלמוס עד לעומק כ 2/3 של המוח. לאחר מלקחיים נמצאים במקום לאפשר את הקצוות כדי לפתוח. חזור על הפעולה עבור חצי הכדור השני.
  9. להקניט את קליפת מההיפותלמוס ואזורי מוח תיכונים.
  10. הסר את ההיפותלמוס, התלמוס, ו המוח התיכון ידי החזקת המוח התיכון על פני השטח האחורי שלה לקלף אותה לקראת סוף הקדמי של המוח. לנתק את הקשרים הקדמיים.
  11. הסר את ההיפוקמפוס ידי פילינג זה כלפי חוץ ולאחר מכן ניתוק הקשר בינו לביןקליפה באמצעות מלקחיים דיסקציה מכופף.
  12. סור בסטריאטום הנותרים ידי מבטל אותו מהקורטקס הבסיסי בתנועות אלכסוניות החוצה באמצעות מלקחיים דיסקציה מכופף.
  13. נקה כל כלי דם ואת קרומי המוח מפני שטח הגחון של הקורטקס.
  14. תהפוך את המוח כך את פני השטח הגבה גלוי. קרום המוח וכלי הדם צריך להיות ברור. קרומי המוח פיל מהקורטקס הבסיסית באמצעות מלקחיים דיסקציה בסדר. התחל קילוף מהמיקום מצורף פקעת ההרחה.
  15. להשלמת שלבים 2.4-2.14 עבור סכום כולל של 3-4 גורי חולדה.
  16. מניח 3-4 הקורטקס גור עכברוש גזור לתוך צלחת פטרי יבש וקוצץ עם סכין גילוח מעוקר עד 1 מ"מ x 1 מ"מ נתחי מושגות. אסוף רקמה על ידי שטיפת צלחת עם PBS מאחד 50 מיליליטר חרוטי צינור (שלב 2) ולאחר מכן למקם בחזרה על קרח.

3. אנזימתי ודיסוציאציה רקמות מכני

הערה: בשלב זה, ערכת דיסוציאציה עצבי מבוסס פפאין מומלצת. שימוש Neקיט דיסוציאציה אוראל (P), צעדים מיוחדים שהם אופטימליים בידוד OPC מתואר.

  1. מכינים את אנזים דיסוציאציה הראשון על ידי דילול אנזים P עם המאגר המתאים. התכנים של כל חרוטי 50 מ"ל (1 מדגם) יהיה resuspended עם סך של 1,950 μl של תמהיל האנזים. מקום בתמהיל האנזים באמבט 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    לדוגמא 1: 1,900 μl של הצפת + 50 μl של אנזים פפאין
  2. ספין כל 50 מ"ל צינורות חרוטים המכילים 3-4 הקורטקס גור עכברוש קצוץ ב XG 300 במשך 3 דקות.
  3. לשאוב supernatant ולהוסיף 1,950 μl של פתרון אנזים על צינור אחד מדגם להתפרק את הכדור על ידי צינור היפוך ורועד בעדינות.
  4. מדגירים את תרבות חממה 37 ° C רקמות במשך 15 דקות עם סיבוב צינור רציף.
  5. במהלך 5 הדקות האחרונות של הדגירה, להכין את א תמהיל האנזים השני לדלל את האנזים במאגר הראוי לו. סך של 30 μl יתווסףעל צינור אחד מדגם 50 מיליליטר חרוטים.
    לדוגמא 1: 20 μl של הצפת + 10 μl של אנזים
  6. לאחר הדגירה תושלם להוסיף 30 μl של תמהיל האנזים השני לצינור כל להפוך לערבב.
  7. בעזרת פיפטה זכוכית פסטר מחוברת בקר פיפטה, לנתק את הרקמה באופן מכני על ידי pipetting 10-15 פעמים או עד פיסות הרקמה הם בגודל מופחת והפתרון הפך מעונן. החזר את המדגם אל האינקובטור תרבות C רקמה 37 מעלות במשך 15 דקות עם סיבוב רציף.
  8. פיפטה מדגם homogenate רקמות 10-15 פעמים בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  9. פיפטה מדגם homogenate רקמות 15-20 פעמים בעזרת פיפטה μl 200
  10. להחזיר את כל דגימות אל האינקובטור תרבות 37 ° C רקמה למשך 10 דקות עם סיבוב רציף.
  11. הוסף 10 מ"ל של PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) מדגם ולסנן את homogenate דרך פילטר 40 מיקרומטר הנקבוביות ממוקם מעל 50 מ 'צינור l. יש לשטוף את המסנן עם 1-2 מ"ל נוספים של PBS.
  12. פינה כל דגימות homogenate לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוטים לרכוש ספירה תאים הכוללת.
  13. לאחר ביצוע ספירת תאים, לפצל את homogenate שווה לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (1 צינור לכל מנוע מדגם). צנטריפוגה במשך 10-12 דקות ב g 300 x.

4. בקשת חרוז אנטי A2B5, טיהור טור, ו ציפוי

  1. לבצע חישובים עבור חיץ העמודה microbeads אנטי A2B5. להוסיף 7 טור μl הצפת לכל 1 x 10 6 תאים. מוסיפים 2 microbeads μl אנטי A2B5 לכל 1 x 10 6 תאים.
  2. לשלב את כל דגימות ידי resuspending התאים בנפח כולל של 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגות טור ב XG 300 במשך 10-12 דקות.
  3. Resuspend התא גלולה ב את הכמות המתאימה של חיץ טור כפי שחושב בשלב 4.1. אם הגלולה גדולה ומשוחררת, רק להוסיף כמחצית מהיקף חיץ טור לשמור על אנטיגוף בריכוז המתאים resuspension התא.
  4. לדגור על השעיית התא למשך 10 דקות ב 4 °.
  5. להוסיף microbeads אנטי A2B5 (המחושב בשלב 4.1), להפוך מספר פעמים לדגור על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כל 10 דקות. פעמי דגירה כבר עשויות להגדיל את תשואות תא, אך עלולות להגביר את הלא ספציפי מחייב.
  6. הוסף 5 כרכים של חיץ טור. אם התאים הם resuspended בנפח של 1 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל של חיץ טור, ואילו אם התאים resuspended ב 2 מ"ל, להוסיף 10 מ"ל של חיץ טור.
  7. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x.
  8. ברר כמה LS עמודות יהיה צורך לטיהור. טור אחד LS מספיק 15-20 x 10 6 תאים בסך הכל.
  9. Resuspend התא גלולה ב 1,000 μl של חיץ טור לכל עמודה LS בשימוש.
  10. ראש כל עמודה LS ידי הוספת 5 מ"ל של חיץ טור. אסוף את הזרימה דרך צינור חרוטי 50 מ"ל. לאחר bu העמודהffer עבר לחלוטין דרך החדר העליון, להחיל 1,000 μl של ההשעיה תא כל עמודה ולאפשר לתאים לרוץ דרך על ידי כוח הכבידה.
    הערה: אם צפיפות תא גבוה מדי, בעמודה יכולה לרוץ לאט.
  11. מיד לאחר ההשעיה תא עבר דרך העמודה, לאט להוסיף 3 מ"ל של חיץ טור כל עמודה כדי לשטוף את התאים מאוגד. אם לשטוף פועל בקלות דרך העמודה (1 טיפה לכל 30-45 שניות), לשטוף פעמיים נוספות עם 3 מ"ל של חיץ טור.
  12. הסר כל עמודה ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של חיץ טור לצלול למאגר דרך העמודה בקצב מהיר באמצעות הבוכנה פלסטיק שארוז עם הטור. צולל יהיה לסלק את התאים כבול משחררים אותם מהעמודה.
  13. גדל טוהר על ידי הפעלת המדגם באמצעות סיבוב השני של עמודות LS. השתמש שליש את מספר עמודות השימוש במהלך המעבר הראשון. ראש העמודות עם 5 מ"ל של חיץ טור.אפשר למאגר העמודה לעבור דרך החדר העליון.
  14. מאז נפח תא השעיה יהיה גדול הרבה, חל באופן שווה 1,000 μl של השעית תא כל עמודה ולאפשר ההשעיה לעבור דרך החדר העליון של עמודה לפני החידוש עם תוספת 1,000 μl.
  15. לאחר ההשעיה תא יושם לחלוטין לסיבוב השני של עמודות, לשטוף 2-3 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ טור.
  16. הסר כל עמודה ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי. הוסף 5 מ"ל של חיץ טור לצלול למאגר באמצעות הבוכנה פלסטיק שארוז עם הטור. צולל יהיה לסלק את התאים כבול משחררים אותם מהעמודה.
  17. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300 12-15 דקות. הגלולה צריך להופיע קומפקטית.
  18. Resuspend התא גלולה ב 5-10 מ"ל של התקשורת התפשטות OPC מחומם מראש (בסיס מדיה OPC בתוספת מ"ל / PDGF-AA 20 נ"ג).
  19. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. פלייט תאים. לדלל את התאים ל -60,000 תאים / מ"ל ​​עם התקשורת התפשטות OPC. לתוך כל שחור, ברור התחתון 24 היטב, pipet 500 μl של תאים לאורך דופן הבאר להשיג 30,000 תאים לכל טוב. מערבבים את התאים על ידי רועדת את הצלחת אופקית באמצעות הספרה שמונה תנועה. אם ביצוע assay ב 48, 96, או 384 גם הצלחות, להוסיף 15,000, 7,500, או 1,500 תאים לכל טוב, בהתאמה. מספרים אלה עשויים להיות מותאמים בהתאם למפרטי צלחת פרט.
  20. הכן צלחת נפרדת עבור תרבויות שליטת בסיס יום 0. צלחת מלאה זה אמור להיות קבוע עם paraformaldehyde 4% כמפורט בסעיף 5.7, כאשר ההבחנה היא יזמה ביום 0.
  21. התרבות התאים מדיה התפשטות OPC על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים ללא שינוי התקשורת.

אינדוקציה 5. בידול OPC ו קיבוע עם 4% Paraformaldehyde

הערה: כאשר בודקים את ההשפעה של מולקולות קטנות על oligodendrogenesis, אנו שגרנו dissolvתרופות דואר ב sulfoxide דימתיל (DMSO) להכין 1,000x מניות שניתן לאחסן מכן ב -80 ° C ומדולל ישירות לתוך התקשורת SATO כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1% DMSO. ראינו שום שינוי או OPC התפשטות או בידול באמצעות ריכוז זה של DMSO (מידע לא מוצג).

  1. התקשורת טרום חמים OPC בסיס ל -37 מעלות צלזיוס, להפשיר מניות טיפול תרופתי לטמפרטורת החדר. בעת ביצוע טיפולים בשני עותקים, להכין כ 1.25 מ"ל של התקשורת לכל קבוצת טיפול צינור 1.5 מ"ל. לקבלת דוגמיות בשלושה עותקים, השתמש צינורות צנטריפוגה קיבולת 2 מ"ל לתת דין וחשבון על רפוי.
  2. הכן את תערובות מאסטר טיפול בארות לשכפל ידי דילול מניות טיפול ישירות לתוך בסיס מדיה OPC. מערבולת בקצרה או לערבב בעדינות כל mastermix כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של הטיפול.
  3. כן 45 ננומטר triiodothyronine (T 3) כמו שליטה החיובית הרכב המתאים כמו שליטה השלילית. לדלל 10 מ"מ T 3 מניות1: 1,000 ב 1 מ"ל של בסיס מדיה OPC ולאחר מכן להמשיך לדלל בתמהיל מאסטר טיפול להפחתת הריכוז הסופי של DMSO במידת הצורך.
  4. לשאוב את התקשורת מן בקבוצת טיפול אחת בארות התרבות בכל פעם כדי למנוע התייבשות תאים. השתמש טיפ pipet 200 μl על סוף pipet פסטר זכוכית כדי למנוע גירוד חומר שחור מן הצדדים של הבאר לתוך התרבות.
  5. לאט לאט להוסיף 500 μl של mastermix טיפול לאורך דופן הבאר באמצעות pipet 1 מ"ל.
  6. דגירת התרבויות עבור מסגרת הזמן הרצויה, ביצוע חילוף תקשורת מלאה עם תקשורת טיפול טריה כל 2-3 ימים. אנו שגרתי להתבונן MBP + תרבות 30-40% לאחר 4 ימים בתקשורת בידול.
  7. בסוף תקופת הטיפול הרצוי, להכין paraformaldehyde 4% טרי (PFA) או להפשיר מלאי קפוא לטמפרטורת החדר. זהירות: PFA מאוד רעיל צריך להיות מוכן במנדף.
  8. לשאוב התקשורת ולאט לאט מוסיפים 4001; l של PFA לצד הבאר כדי לתקן את התאים. הדגירה הצליח במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  9. לשאוב PFA ולאט לאט להוסיף 500 μl של D-PBS סטרילי (עם Ca 2 + ו Mg 2+) לצד הבאר כדי לשטוף את התאים. חזור על לשטוף סך של פי שניים יותר. אין לשאוב לשטוף סופי.
  10. לעטוף את הצלחת parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עיבוד מאוחר יותר או להמשיך ישירות לשלב הבא. צלחות יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות.

6. Immunocytochemistry וכימות של חלבון המיאלין הבסיסי

הערה: בעת ביצוע נהלי טיפול נוזל ב 24 הצלחות היטב, מומלץ לעבוד מהר כדי למנוע התייבשות התאים. כאן, שימוש aspirator ואקום רב ערוצית pipet רב ערוצית מומלץ.

  1. תביאו את הצלחת בטמפרטורת החדר, לשאוב את הבארות, ולהוסיף 250 μl של D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) המכיל 0.1% Triton X-100 ו -5%עז בסרום נורמלי (NGS). דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד מסלולית עדין.
  2. הכן את פתרון הדגירה העיקרית על ידי דילול חד שבטי עכבר אנטי MBP נוגדן 1: 1,000 ו הארנב polyclonal אנטי יקטין נוגדן 1: 200 ב D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) המכיל 5% NGS. לחלופין, הארנב polyclonal אנטי Olig2 ב 1: 1,000 ניתן להשתמש לנורמליזצית oligodendrocyte ספציפית בתרבויות גליה מעורבות. הכן מספיק פתרון עיקרי להכיל 250 μl לכל טוב.
  3. דגירת נוגדנים עיקריים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במשך 16-18 שעות עם רעד מסלולית עדין.
  4. לשאוב את הפתרון הדגירה העיקרי לשטוף את התאים 3 x 10 דקות עם 500 μl של D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) בטמפרטורת החדר עם רעד מסלולית עדין.
  5. בעוד שטיפת הצלחת, להכין את פתרון דגירה משני על ידי דילול אנטי עכבר 680 ו-ארנב נגד 800 נוגדנים 1: 500 ב D-PBS (עם Ca 2 + 2+) המכיל 5% NGS. מזעור החשיפה אור הסביבה בעת הכנת פתרון זה.
  6. לשאוב לשטוף סופי ולהוסיף 250 μl של פתרון דגירה משתיים. הגנו על צלחת מפני אור דגירה אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד מסלולית עדין.
  7. לשאוב את הפתרון הדגירה משני ולשטוף בארות 3 x 10 דקות עם 500 μl של D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) בטמפרטורת החדר עם רעד מסלולית עדין.
  8. סרוק את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה מסוגלת לאתר 700 ננומטר ו 800 פליטת קרינת ננומטר. כנקודת מוצא, לקבוע את מוקדי לקזז 3 ורגישויות 1.5 עבור MBP, 5.0 עבור אקטין, ו -3.5 עבור Olig2. התאם את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי להימנע מחשיפת יתר אות.
  9. לכמת את מידת oligodendrogenesis בשיטות אוטומטיות למחצה מבוססי תוכנה.
    1. השימוש בתוכנה, להגדיר את מצב ניתוח הצלחת "24 ובכן" וליישר במעגלים סביב tהוא ההיקף החיצוני של בארות סרק. הגדר את ערוץ נורמליזציה "800" ולייצא את עוצמות הקרינה מוחלטת ביחס עבור 700 ננומטר (MBP) ו -800 ננומטר (Olig2 / אקטין) ערוצים.
    2. מחלקים את עוצמת ב 700 ננומטר מעוצמת ב 800 ננומטר כדי לתת ביטוי MBP מנורמל ביחידות הקרינה היחסית. החישוב ממוצע של המדידות לשכפל ולהרחיב את הביטוי אל יום 0 + שולט PDGF לפי הצורך לניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OPCs A2B5 החיובי מבודדים באמצעות בחירת תא חיובית באמצעות מערכת הפרדת עמודה מגנטית. לפני תחילת ההליך בבידוד, המוח כולו יוסר גורי חולדה כי הם בין P5 ו P7. ברגע שהמוח כולו מנותק בהצלחה מהגולגולת, נורות המוח קטנת ההרחה מוסרות באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס (איור 1 א). על מנת לבודד רקמת קליפת מוח מוחות ההיפותלמוס, התלמוס המוח התיכון הם נכרתו על ידי דיסקציה זהירה (האיור 1B). לאחר מכן, ההיפוקמפוס בסטריאטום מוסר באמצעות מלקחיים כירורגיים מכופפים (איור 1 ג - ד). תהליך הבידוד ביעילות מבטל תאי קרום מוח פיברובלסטים, אבל עיכול אנזימטי משופר בעת קרומי מוח ואת כלי דם מוסרים (1E איור). לבסוף, גושי רקמה של 1 מ"מ x 1 מ"מ הם מוכנים לצעדים דיסוציאציה רקמות שלאחר מכן (איור1F יור).

בידוד OPC טוב צריך לגרום תא הגלול קומפקטי לאחר שלב הסיבוב האחרון (איור 2 א). לאחר מצופה תרבויות אלה תהיינה חופשיות יחסית של פסולת הסלולר כאשר מתחת למיקרוסקופ (איור 2 ב). בידוד הכי מוצלח עלול לגרום גלולה גדולה ורכה בשל נוכחותם של כמויות גדולות של פסולת הסלולר. פסולת זו תדבק בחריפות את כלי-מצופה PLL ועלול להפריע התרבות (איור 2 ג). אם גלולה גדולה ורכה תתממש, זה עשוי לעזור כדי resuspend תאי 10 מיליליטר של PBS וחזור הסיבוב האחרון במשך 10 דקות ב <300 x גרם. לאחר הבידוד יושלם, את הטוהר של התרבויות יכולה להיות מוערך על ידי cytometry זרימה לזהות באחוז תאי A2B5 החיובי. בידוד מוצלח צריך לגרום בתוך שלולית של התאים הנמצאים> 95% חיוביים עבור A2B5 (2D איור - F). לעומת תאים מוכתם נוגדן אנטי A2B5 צבען מצומדות ניאון, תאים בלא כתם אמורים להופיע כאוכלוסייה שלילית וניתן להשתמש בו כנקודת התייחסות בסיס gating. יתר על כן, יש לנו בעבר הראו כי הבחירה של OPCs באמצעות תרבויות תשואות אנטיגן A2B5 כי להכתים חיובית עבור PDGFRα ידי immunocytochemistry 11.

כפי שהוכח על ידי immunocytochemistry, OPCs בתחילת הטיפול (יום 0) הם Olig2 + / MBP - ואילו התאים Olig2 + / MBP + על ידי יום 4 (איור 3). Confluency האופטימלי של OPCs ו oligodendrocytes ביום 0 וביום 4 מוצגים תמונות שדה בהירות נציג (איור 4 א). העדר ביטוי MBP ביום 0 משמש כבסיס לכימות oligodendrogenesis. התמיינות ספונטנית כתוצאה הנסיגה PDGF-AA משמש כביקורת שלילית, בעוד הורמון בלוטת התריס 45 ננומטר (triiodothyronine; T3) יכול לשמש כביקורת חיובית 11,15. Quetiapine, הידוע גם בשם Seroquel, ו clemastine, הידוע גם בשם Tavist, הם תרופות ה- FDA כי הוכחו להאיץ במבחנה oligodendrogenesis ויכול לשמש שולטת חיובית נוספת 16,17. איור 4B מראה דו ערוצי נציג אינפרא אדום סריקת פלורסנט הוכיחה את התוצאות צפויות אם אחד מהמצבים הללו בשלושה עותקים. אותות תקטינו MBP היו pseudocolored ירוקים ואדום בהתאמה כך תרבויות מובחנות מאוד להופיע צהובות בתמונות ממוזגות. התוצאות הראו כי הביטוי MBP ב יום 4 במצב נסיגה PDGF היה 4.5 ± 1.4 גבוה פי לעומת יום 0, ואילו שינויים לקפל MBP עקב טיפול עם הורמון בלוטת התריס, quetiapine, ו clemastine היו 33.9 ± 4.1, 33.4 ± 1.0 , ו -32.8 ± 0.5 בהתאמה (4C איור). החוסן ודיוק של assay הם הפגינו על ידי SMכל סטיות התקן בין הדגימות בשלוש עותקים וחלון הפעלת הטיפול הגדול כי הוא כ -20 סטיות תקן מעל מלאת נסיגת PDGF.

בעוד תקטין משמש גן התייחסות אמינה לנורמליזציה בתרבויות oligodendrocyte, גני התייחסות חלופיות יכולים לשמש גם. Olig2 הוא גורם שעתוק גרעיני אשר באו לידי ביטוי constitutively בתאים של שושלת oligodendrocyte. דפוס הביטוי הספציפי מכונן שלה ובכך עשוי לספק אסטרטגית נורמליזציה עדיפה יותר במצבי תרבות הטרוגנית. איור 5 מראים כי בתרבויות OPC בדיל עם 10 הורמון בלוטת תריס ננומטר, שינוי לקפל המחושב ביחס ביטוי MBP לנסיגת PDGF זהה בעת השימוש משני Olig2 או תקטין לנורמליזציה. יש להניח, מאז תרבויות OPC בניסוי הזה היו מאוד טהורות, שני חלבונים יכולים לשמש באופן מהימן לנורמליזציה. עם זאת, אנו often להתבונן אוכלוסייה קטנה של תאי-שלילי Olig2 ידי יום 4, אבל היחס של אוכלוסייה זו לאוכלוסייה Olig2 חיובי לא נראה שונה באופן משמעותי בין הנסיגה PDGF ו- בקבוצה שטופלה T3. לפיכך, שינויי לקפל אינם מושפעים. בהינתן תרחיש שבו טיפול עשוי לגרום תרבות של תאים מסוגים שליליים-Olig2, בחירה של נוגדן נורמליזציה יש לשקול בזהירות.

איור 1
איור 1:.. הליך המוח לנתיחה חולדה תיאור צעדיים של ההליך לנתיחה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: Cytometry זרימת ניתוח של מבודדיםOPCs. (א) לאחר טיהור מגנטי טור, אוכלוסיית תא הכבול הוא צלל מתוך הטור centrifuged כדי ליצור גלולה קומפקטית. כמות פסולת מותווה על ידי גודל של גלולה. (ב) אם הגלולה היא קומפקטית, אז הפסולת תהיה מינימאלית בתרבות. (ג) גלולה גדולה ורכה בדרך כלל תוצאות תרבות בפסולת כבדה. טוהר התרבות נקבע על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדן A2B5 אנטי עכבר עכברוש כי הוא מצומדות כדי APC. (ד) תאים ופסולת מלח הם נכללים בניתוח כמוצג מגרשי פיזור פיזור וצד קדימה. (E) האוכלוסייה החיובית A2B5 ניתן לקבוע באמצעות בלא כתם שנדגמו כהפנית בסיס gating. (F) מבודדים בהצלחה OPCs צריך להיות> 95% חיובי עבור A2B5. נא ללחוץ כאן vieווה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. תרבות OPC ונוהל הבדלה בין כפול אינפרא אדום הקרינה-סורק (DIFS) assay מתחיל עם OPCs עכברוש isolatedA2B5 חיובי טרי מצופה על כלי תרבות מצופה PLL (יום 3). תרבויות אלה התרבו במשך 3 ימים בנוכחות של 20 ng / ml PDGF-AA, ולאחר מכן טופלו גורמים הניסיונות בתקשורת טריה PDGF-חינם על תקשורת טיפול יום 0. הוא מתחדשת באופן מלא על יום 2, והתאים הם קבועים עם 4% paraformaldehyde על Immunocytochemistry יום 4. עבור Olig2 (ירוק) ו MBP (אדום) בוצע על תרבויות מייצגות ביום 0 וביום 4 באמצעות DAPI (כחול) ככתם מונה גרעיני. תרבויות אלה מפגינים מכתים מכונן עבור Olig2 סמן תא שושלת oligodendrocyte פאן בבית הימים 0 ו -4, ואילו מכתים עבור סמן oligodendrocyte הבוגרת MBP הוא ev רקזיהוי כבר יום 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: כימות MBP באמצעות סריקת קרינה כפולה אינפרא אדום (DIFS) assay (א) הצפיפות של תרבויות OPC ביום 0 וביום 4 הנדרש לביצוע assay אופטימלי.. (ב) סריקות נציג קרינה כפולות אינפרא אדומה. OPCs הובדלו ב 24 צלחות היטב במשך 4 ימים בנוכחות T3 45 ננומטר, 1 מיקרומטר quetiapine, 1 מיקרומטר clemastine, או 0.1% DMSO בשלושה עותקים. צלחת נפרדת המכילה OPCs שתוקנו ביום 0 (+ PDGF) היה מעובד במקביל. תקטין (pseudocolored ירוק) ו MBP (pseudocolored אדום) כומתו זמנית באמצעות סורק אודיסיאה Licor מוגדר כך שיזהה 700 ננומטר ו 800 ננומטר פליטה. ( אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: Olig2 הוא חלבון הפניה אמין לנרמול ביטוי MBP ב oligodendrocytes OPCs הובדלו בשלושה עותקים בנוכחות T3 10 ננומטר או 0.1% שליטה ברכב DMSO ב 24 צלחות היטב במשך 4 ימים.. את assay הכפול אינפרא אדום קרינת הסריקה בוצע באמצעות נוגדנים ראשוניים אנטי Olig2 או אנטי יקטינו לנורמליזציה. Olig2 / אקטין MBP כומתו זמנית באמצעות סורק אודיסיאה Licor מוגדר כך שיזהה 700 ננומטר ו 800 ננומטר פליטה. MBP הביטוי לא היהrmalized משני Olig2 או ביטוי יקטין, והתוצאות היו מדורגות לשליטת 0.1% DMSO. יחידות הקרינה היחסיות הממוצעות ± סטיית התקן היו זממו באמצעות GraphPad פריזמה 6. התוצאות מראה כי מתקפל השינוי המחושב זהה כאשר נרמול לכל אחד משני חלבוני ההתייחסות.

איור 6
איור 6:. אפקט של טריטון X-100 על מכתים MBP OPCs הובדלו ב 24 צלחות היטב במשך 4 ימים בנוכחות T3 45 ננומטר או 0.1% DMSO. תרבויות קובעו אז עם 4% PFA ומוכתמת עבור Olig2 ו MBP באמצעות שני פרוטוקולים immunocytochemistry שונים. למדגם טריטון X-100 הגבוה, תאים היו permeabilized עבור שעה 1 עם 0.4% טריטון X -100 ואת כל שלבי דגירת הנוגדן בוצעו בנוכחות 0.1% Triton X-100. למדגם טריטון X-100 הנמוך, תאים היה permeabilized עבור שעה 1 עם 0.1% Triton X-100, בעוד antiboincubations dy בוצעו ללא טריטון X-100. Olig2 ו MBP היו דמיינו עם משניות ותמונות צבען מצומדות פלורסנט נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס מצלמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה מהירה ואמינה לבידוד OPCs עכברוש וכימות ב oligodendrogenesis במבחנה בתגובה לגורמים הניסיונות. באמצעות סלקציה חיובית, תשואות גבוהות של OPCs קיימא וטהור משמשים במישרין למטרות ניסויים. שיטה זו מייעלת את הבידוד, culturing, וצעדי הבידול לתוך מסגרת 1 בשבוע זמן, תאים קבועים ניתן לאחסן בנוחות על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות בלי לפגוע רגישות assay.

יתרון עיקרי עם מבחני קרינה מבוסס סורק הוא כי נתוני רכישה וניתוח היא מזורז מאוד לעומת שיטות מיקרוסקופיה מבוססת מצלמה מסורתית. למרות מיקרוסקופיה שימש בהצלחה מסכי תפוקה גבוהה לזהות מעוררים של בידול OPC, רכישת נתונים הוא איטי מטבעו, מכיוון שהיא דורשת תכנות של רצפים לכידת תמונה, כמה שעות של איסוף נתונים, ניתוח של מאות עד thousands של קבצים תמונה, ואלגוריתמים המוגדרים על ידי המשתמש להבחין גופי תא פרט לנורמליזציה או ניתוח 18,19. יתר על כן, עם מערכות מיקרוסקופיה מבוססי מצלמה זה לא ריאלי להשיג נתונים מפני השטח כולו של כלי התרבות. במקום זאת, חייבות להיות בשבי תמונות מייצגות מאזורים שונים בתוך באר יחיד, אשר עשויה להוביל להטיות מיקומית ולהיטים חיוביים שגויים. לשם השוואה, assay זה מזהה ביטוי MBP מכל התאים בתוך נתון היטב, צלחות מרובות ניתן לסרוק בו זמנית. אמנם שיטה זו ניתן להתאים לשימוש 96-היטב או 384 גם בפורמטים, הצלחת 24 גם עשויה להיות מועדף כאשר פחות טיפולים נבדקים. ראינו כי אובדן תא בצלחת 24 גם עקב טיפול נוזל ממוזער, שהוא סיבוך כי צריך לקחת בחשבון בעת ​​תכנון ניסויי תפוקה גבוהה יותר.

פרמטר קריטי של assay הוא צפיפות של התאים כאשר differentiation היא יזמה ב יום 0. תרבויות עם תאים מעט מדי להופיע להבדיל יותר לאט למות, בעוד תרבויות צפיפות גבוהה להפגין התמיינות ספונטנית. שני המצבים עלולים לצמצם את טווח ואמינות הדינמי של assay. כדי להשיג איזון מיטבי בין בריאות התא צפיפות התאים, אנחנו בתרבות OPCs במשך 3 ימים ללא חילופי התקשורת או בתוספים של PDGF-AA טריים. החוקרים שיערו כי מאז ריכוז של PDGF-AA ב הירידות התקשורת ידי יום 3 במבחנה (יום 0) כתוצאה פירוק הסלולר, שיעור שגשוג של תאים תאט כגון התפשטות כי מופחת תוך היום הראשון של PDGF- נסיגת AA. טכניקה זו פועלת בצורה הטובה ביותר כאשר התאים מופצים באופן שווה במהלך ציפוי. Pipetting התאים לאורך הצד של הבאר ומערבב אותם בתנועות הספרה שמונה צריך לקדם חלוקה שווה. Pipetting למרכז הבאר נוטה לייצר אשכולות של תאים מסביב לקצוות של באר עם כמהתאים אה דבקים במרכז. תופעה זו עשויה לנבוע הפרעה של שכבת PLL היבש זה עתה על ידי כוחות pipetting נוזליים. הצטברות של תאים מסביב עשויה להפחית את רגישות assay בגלל בידול צפיפות תלויה. חשוב לציין כי הבדלים משמעותיים בעוצמת האות תקטין / Olig2 יכולים להתרחש בין מטופלים בתרופה ובקרה, תרבויות נסיגת PDGF. ירד באופן משמעותי יקטין / אות Olig2 עשוי להצביע על רעילויות תרופה, ואילו אות תקטין / Olig2 גדל באופן משמעותי עשויה להצביע על התפשטות סמים. בדרך כלל אנחנו שומרים אות תקטין / Olig2 גבוהה במעט מתאים שטופלו בתרופות פרו-בידול בהשוואה לקבוצת ביקורת נסיגת PDGF. אנו מייחסים את ההבדל הזה כדי שיעור גבוה יותר של אפופטוזיס ספונטנית בקבוצת נסיגת PDGF על הליך בידול 4 יום. בהערכת oligodendrogenesis, נורמליזציה של MBP כדי תקטין / Olig2 צריך לתקן להבדלי מספר סלולריים. כדי להעריך toxiעיר ושגשוגם באמצעות assay, הנוגדן אנטי MBP ניתן להחליף נוגדנים ראשוניים המכוונים נגד הסמנים המתאימים.

כאשר ניסויים דורשים גם הערכה כמותית ואיכותית, חשוב להגביל את החשיפה של תרבויות oligodendrocyte עכברוש הקבועות טריטון X-100 בעת שימוש 4% PFA כדי לתקן את התאים. פרוטוקולים immunocytochemistry אחרים עבור תרבויות oligodendrocyte, אשר בדרך כלל כוללים טריטון X-100 במהלך שני צעדים הדגירה נוגדנים כדי לשפר את הנגישות epitope נוגדנים, ניתן להשתמש בהתאם בהצלחה על דרישות הניסוי. מצד שני, למרות MBP הוא חלבון תאי יתכן שניתן יהיה להוציא טריטון X-100 לחלוטין אם שיטות קיבוע אלטרנטיבה מועסקות כי permeabilize התאים כראוי. שימוש בתנאים המתוארים כאן, יש לנו ציינו כי טריטון X-100 משפיעה על המורפולוגיה הנצפית של oligodendrocytes וכן הלוקליזציה של מכתים MBPכאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים. אנחנו לא רואים ירידה משמעותית מכתים נוגדן כאשר טריטון X-100 מושמט ממדרגות דגירת נוגדן. כפי שניתן לראות בתרשים 6, כולל 0.4% Triton X-100 ב permeabilization צעד חסימה, ו -0.1% טריטון X-100 במהלך דגירת נוגדן, מפחית זיהוי של תהליכי המיאלין והתוצאות מכתימות רציף MBP. לכן, עבור הערכה כמותית ואיכותית זה עשוי להיות מספיק כדי להשתמש בריכוז נמוך של טריטון X-100 כפי שמתואר כאן.

בעוד שימוש OPCs שנבחר A2B5 חולדות יכולים להיות יתרון, ראיתי תוצאות דומות ב לסריקת קרינה כפולה אינפרא אדום (DIFS) assay באמצעות OPCs שנבחר A2B5 מ C57BL / 6 עכברים, למרות תשואת תא לכל עכבר היא בדרך כלל הרבה נמוך (מידע לא מוצג). פרוטוקולים אחרים לטיהור OPC עשויים גם להיות תואמים עם assay זה. לדוגמה, סמן oligodendrocyte O4 עשוי לשמש אנטיגן לטהר intמבשרי oligodendrocyte הבמה ermediate באמצעות חרוזים מגנטיים 20. כחלופת שיטות מגנטיות מבוסס, OPCs ניתן להעשיר מ -9 תרבויות גליה מעורבות יממה המכיל האסטרוציטים ו microglia על ידי שיטות הדבקה Hi-Speed ​​מסלולית רועד ההפרש 21. יתר על כן, חיסוני פנורמי נהלים אשר משלבים הוא בחירת התא שלילית וחיובית ניתן להשתמש אם טוהר התרבות עדיפה על פני תשואות גבוהות תא 22. בנוסף בוחנת כיצד הרפוי יכול ישירות לשפר את הבידול של OPCs בתרבויות טהור, זה לפעמים צורך לשקול את ההשפעות העקיפות של תרופות באמצעות סוגי תאים אחרים במערכת שיתוף תרבות. בטרשת נפוצה, חדירת תאים מפעיל T אוטוריאקטיבים לתוך מערכת העצבים המרכזית הוא חשב לשחק תפקיד התקדמות המחלה 23. תאי מפעיל T עשוי להפריש גורמים פרו-דלקתיים שעלולות לעכב את הבידול של OPCs באתרים של demyelination. לכן עניין לזהות therapeutics שעשויים להגן על OPCs ולחסום גורמים פרו-דלקתיים אלה תוך העצמת פציעה. את assay DIFS עשוי להיות אידיאלי עבור דוגמנות פעילות זו כתאי T לגדול ההשעיה ועשויים יישטפו מתרבות oligodendrocyte לפני כימות MBP. עבור מחקרים שיתוף תרבות שמקורם בתאי דם חסיד כגון נוירונים, האסטרוציטים, ו microglia, נורמליזציה Olig2 עשוי להיות מועסק על מנת לאסוף נתונים מן oligodendrocytes במיוחד. לפיכך, את הגמישות של assay DIFS עשוי להקל מגוון של עיצובים ניסיוניים.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה לכמת את oligodendrogenesis של OPCs עכברוש A2B5 חיובי במבחנה. שיטת בידוד זה בעקביות מספקת תשואות גבוהות של OPCs קיימא כי הם מגיבים לרמזים בידול הוקמה. ניתן לבצע ניתוח רגיש בכלי בפורמט רב גם באמצעות מגוון של פרדיגמות ניסוי, אשר מרחיב את השירות של מערכת זו מאיישומים שונים NY. יתר על כן, assay DIFS ניתן להתאים להקרנת תרופת תפוקה גבוהה, או ניתן להשתמש כדי לאמת את התוצאות של מבחנים נמוך תפוקה כגון PCR כמוני כתם מערבי. חשוב לציין, מערכת זו עשויה להציע אמצעי פשוט אך יעיל לזיהוי טיפולים ממוקדים OPC ב demyelinating מחלות כמו טרשת נפוצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

גרנט חסות: מכוני הבריאות הלאומיים; מספר גרנט: R37 NS041435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+ Mediatech 21-040-CV 1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes Fisherbrand 0857512
Light Dissection Microscope Motic SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
40 μm Cell Strainer Corning 352340
A2B5 Column Purification 
Anti-A2B5 Microbeads Miltenyi Biotec 130-097-864 Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Magnetic Selection Columns
EDTA Corning 46-034-Cl 2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9647 0.50%
Culture Materials
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  Sigma-Aldrich T6397 45 nM
Clemastine fumarate salt Sigma-Aldrich SML0445-100MG 1 μM
Quetiapine hemifumarate salt Sigma-Aldrich Q3638-10MG 1 μM
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165 5 μg/ml
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 60 ng/ml
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524 10 μg/ml
Putrecine Sigma-Aldrich P7505 16 μg/ml
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 40 ng/ml
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135 50 ng/ml
d-Biotin Sigma-Aldrich B4639 10 ng/ml
Insulin Sigma-Aldrich I6634 5 μg/ml
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1147 100 μg/ml
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4161 100 μg/ml
Trace Elements B Corning 25-022-Cl 1x 
B-27 Supplement Life Technologies 17504044 1x 
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122 1x 
DMEM Life Technologies 11995-065 1x 
24-well Black Visiplate with lid Perkin Elmer 1450-605 Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA Sigma-Aldrich 100-13A 4%
Triton X-100 Sigma-Aldrich 78787 0.10%
Normal Goat Serum Jackson Immuno Research 005-000-121 5%
mouse monoclonal anti-MBP Biolegend SMI-99P 1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin Santa Cruz Biotecnology SC-7210 1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2 Millipore AB9610 1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD Licor 926-68070 1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW Licor 926-32211 1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse Life Technologies A11032 1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit Life Technologies A11008 1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI Life Technologies P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System Licor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
  2. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
  3. Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
  4. Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
  5. Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
  6. Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
  7. Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
  8. Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
  9. Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
  10. Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
  11. Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
  12. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  13. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  14. Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
  15. Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
  16. Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
  17. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
  18. Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
  19. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
  20. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  21. O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
  22. Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
  23. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 108 תא אב Oligodendrocyte oligodendrogenesis A2B5 cytoblot חלבון המיאלין הבסיסי
הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schott, J. T., Kirby, L. A.,… More

Schott, J. T., Kirby, L. A., Calabresi, P. A., Baxi, E. G. Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (108), e53764, doi:10.3791/53764 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter