Introduction
哺乳動物の中枢神経系（CNS）における効率的な神経伝導がオリゴデンドロサイトによって軸索の髄鞘形成を必要とします。開発中に、オリゴデンドロサイトは、開発前脳と神経管1の心室ゾーンから移行すると考えられているオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）のプールから生じます。移行後のOPCは、効率的なインパルスの伝播を促進するだけでなく、栄養サポート2と軸索を提供するだけでなく、オリゴデンドロサイトをミエリン形成、成熟へと分化します。成体CNSは、すべてのセル3の約百分の5から8までを含む、グレーと白質全体に分散されているOPCの豊富な人口を維持します。脱髄傷害後、OPCが、損傷部位に遊走増殖し、露出した軸索上の紛失または破損したミエリン鞘を置き換えるために分化します。しかし、いくつかの疾患/損傷の設定では、このプロセスは非効率的であることが見出されたまたは完全に4失敗することができます。同時に慢性脱髄は、症状5を軽減することができる疾患、効率的oligodendrogenesisおよび再ミエリン化の負担に追加すると考えられています。したがって、oligodendrogenesisに関する実験要因の影響を決定するために、in vitroでのOPCを研究するために注目されています。
乏突起膠細胞の分化の異なる段階への洞察は、ステージ特異的な細胞マーカーを同定することによって可能となりました。 8 -自己再生初期前駆細胞は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRα）、神経/グリア抗原2（NG2）とA2B5 6の発現によって定義されます。 OPCには、それらの分化プログラムを開始し、細胞周期から撤退したように、彼らは、これらのマーカーの発現をダウンレギュレートし、環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ（CNPアーゼ）とO4を含むオリゴデンドロサイトをpremyelinatingを示すタンパク質を発現し始めます。最後に、より成熟したoligodendrocへの分化ytesは、ミエリン関連糖タンパク質（MAG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）などのミエリン関連タンパク質の発現によって特徴付けられます。 MBPは、細胞内の末梢膜タンパク質およびミエリン鞘の主要な成分です。 MBP欠損したマウスは、CNSミエリン形成が大幅に震え、痙攣、早期死亡9,10につながる減少している深刻な表現型を開発。髄鞘形成におけるMBPのこの重要な役割は、in vitroおよびin vivo 11 の両方のオリゴデンドロサイト分化のマーカーとしての使用につながっています。
MBPの定量化は、いくつかの異なる方法を用いて達成することができます。 RT-PCRおよびウェスタンブロット分析は、異なる治療計画の下MBPレベルの定量化を可能にします。免疫細胞化学は、カメラベースの顕微鏡手法が使用される場合にも、定量的であることができる共通の定性的なアプローチです。これらのシステムは、信頼性との基本であるが、オリゴデンドロサイト分化の研究では、それぞれが薬物スクリーニングにおけるそれらの使用を制限し、自分の欠点を有しています。まず、RT-PCRおよびウェスタンブロット分析のために必要とされる主要なOPCの量を同時に検査することができる変数の数を減少させます。免疫細胞化学のための細胞要件がはるかに低いですが定量化が目標である場合には、かなりの時間が各実験に専念しなければなりません。多数の画像が取り込まれ、その後、実験的な分析を容易にするために、定量化する必要があります。これらの注意事項は、高スループットの評価を必要とする研究のために考慮すべき重要な障害となります。ここでは、大幅に必要な細胞の数および定量分析が完了するまでの時間の両方を削減しながら、免疫細胞化学およびミエリン定量化のためのウェスタンブロット方法論の両方から基本的な側面を利用する方法について説明します。
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Protocol
動物を対象とする手順は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）と医学のジョンズ・ホプキンス大学によって承認されています。
1.アッセイプレートの調製、ストックソリューション、およびOPCベースメディア
注：ここで説明したラットOPCベース（佐藤）メディアは、以前に公開された研究12,13から導出されています。代替的な培地処方は、この手順と適合性であってもよいです。
- 滅菌脱イオン水で10μg/ mlの濃度に再懸濁し、ポリ-L-リジン（PLL）。ピペット黒壁、透明底24ウェル組織培養グレード皿の各ウェルに希釈されたPLL400μlの。
- 37℃の組織培養インキュベーター中または一晩、4℃の冷蔵庫中で2時間コート組織培養皿。
- メッキに少なくとも20分前にコーティングされた皿から吸引除去するPLL。組織培養で蓋を部分的に半開き24ウェルプレートを配置することによって、残りのPLLは井戸から乾燥することができますフード。ウェルが孤立するOPCをめっきする前に完全に乾燥していることを確認します。細胞は液体PLLの存在を持っているプラスチックに付着しません。
- N -アセチル-L-システイン（NAC）原液（1,000倍）を準備しますダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）20ml中100mgのN -アセチル-L-システイン（NAC）を溶解します。 -20℃で小分けし、店舗。
- ヒドロコルチゾンストック溶液（1,000倍）を準備：1mgのヒドロコルチゾンと溶解するスワールにエタノール1mlを追加します。 、DMEMの19ミリリットルを加え、-20℃で溶液、アリコートとストアを混ぜます。基本培地へのヒドロコルチゾンの添加は、グリア細胞14の生存を増強することが示されています。
- D-ビオチン原液（5,000x）を準備します。PBSの50mlにd-ビオチン2.5mgのを溶かします。溶解を助けるために、0.1 N NaOHを1〜2×5μlの滴を追加します。 -20℃で小分けし、店舗。
- インスリンストック溶液（100倍）を準備します。組織培養グレードの水50mlに25mgのインスリンを溶解します。 250μlのOを追加します。F 1 N HClを、溶液が透明になるまで混ぜます。 6週間まで4℃で0.22μmフィルターとストアで滅菌します。
- 佐藤ストック溶液（100倍）を準備します。
- プロゲステロンストック溶液（25μgの/μl）を準備します。エタノール100μlの2.5 mgのプロゲステロンを溶かします。
- 亜セレン酸ナトリウム原液（400 ngの/μl）を準備します。100μlの0.1N NaOHで4 mgの亜セレン酸ナトリウムを溶解します。 DMEMの10ミリリットルを加え、混合します。
- DMEMの100ミリリットルに、人間のアポトランスフェリンの1グラム、ウシ血清アルブミンの1グラム、及びプトレッシンの160ミリグラムを追加し、完全に溶解するように混ぜます。プロゲステロンストック溶液25μl、亜セレン酸ナトリウム原液を1000μLを、加えて混合します。 -20℃で小分けし、店舗。
- （4.5グラム/ LのD-グルコース、L-グルタミン、および110 mg / Lのピルビン酸ナトリウム）DMEMの100ミリリットルあたり、100μlのNACを追加し、100μlのヒドロコルチゾン、20μlのD-ビオチン、1ミリリットル：OPCベースメディアを準備しますインスリン、1ミリリットル佐藤ストック、100μlの微量元素B、2 mLのB-27サプリメント（50倍）、およびペニシリン/ストレプトマイシン（100倍）の1ミリリットル。 4℃で0.22μmフィルターとストアで滅菌します。
- PDGF-AAストック溶液（1,000倍）を調製する：20 / mlの溶液を作製するために、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS 12.5mlの250μgのを溶かします。 -80℃で小分けし、店舗。
- OPC増殖メディアを準備します。OPCベースのメディアは20 ngの/ mlのPDGF-AAを補いました。
- OPCの分化培地を準備します。OPCベースのメディアは、45 nMのトリヨードサイロニンを補いました。
- PBSの500ミリリットルに、BSAの2.5グラムを追加し、0.5 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の2ミリリットルと7.2にpHを調整する：列のバッファを準備します。 4℃で0.22μmフィルターとストアで滅菌します。
2.ラット脳解剖
注：P5、P7の仔ラットは、このプロトコルで使用されています。各ラットの仔の皮質は、約1.5〜2.0×10 6 A2B5陽性細胞が得られます。
- 250を使用して、すべての解剖器具を滅菌します6; C加熱ビーズ滅菌器。
- 50ミリリットルコニカルチューブにPBSの（のCa 2+およびMg 2+なし）15〜20ミリリットルを追加します。 One 50ミリリットルコニカルチューブ3-4ラット仔の皮質のために十分です。氷上で50ミリリットルコニカルチューブを置きます。解剖時にダイスカット皮質組織を保持するために50ミリリットルにコニカルチューブを使用してください。
- 10センチメートルペトリ皿に冷PBSを追加します。この皿は、光学顕微鏡下で切開するために使用されます。
- 大きな手術用ハサミで断頭によりラットの子を生け贄に捧げます。 70％エタノールでヘッドをスプレーします。
- 全脳を抽出
- 小さなはさみを使用すると、正中線の下や背中耳と皮皮膚フラップの後ろの皮膚を切りました。正中線脳幹から始まり、目で終わるの頭蓋を削減。根底にある皮質の構造を維持するためにあまりにも深く切らないように注意してください。
- 大後頭孔の中に小さな手術用はさみを挿入することにより、小脳に劣っ2の横方向のカットを行います。目の間の追加のカットを行い、アリ嗅球にerior。
- 慎重に戻って頭蓋の各半分の皮をむきます。冷PBSで満たされた10センチメートルペトリ皿に全脳と場所を削除してください。
- 解剖光顕微鏡下では、細かい手術用鉗子で嗅球および小脳を削除します。
- 腹面は光学顕微鏡で見えるように脳を反転します。
- 細かいストレートピンセットを使用すると、脳の2/3程度の深さに皮質と視床下部の間、閉じた鉗子先端を配置することによって、鈍的切開を行います。鉗子の場所に入ると端が開くことができます。他の半球のために繰り返します。
- 視床下部と中脳の領域からの皮質をいじめます。
- その後面で中脳を保持し、脳の前方端部に向かってそれを剥がすことにより、視床下部、視床、および中脳を削除します。前方の接続を断ちます。
- 外側にそれをピーリングした後にその接続を切断することによって海馬を削除します細かい曲がった解剖ピンセットを用いて皮質。
- 細かい曲がった解剖鉗子を使用して、外向きの斜めの動きで、基礎となる皮質からそれを廃棄することにより、残りの線条体を削除します。
- 皮質の腹面から任意の血管と髄膜をクリアします。
- 背面が見えるように脳を反転します。髄膜と血管が明らかであるべきです。細かい解剖ピンセットを用いて、基礎となる皮質からはがし髄膜。嗅球の取付け位置からの剥離を開始します。
- 完全には3-4仔ラットの合計2.4から2.14を繰り返します。
- 乾燥ペトリ皿に3-4解剖ラット仔の皮質を配置し、1ミリメートル×1ミリメートルのチャンクが達成されるまで滅菌カミソリの刃で切ります。 1 50mlコニカルチューブ（ステップ2）次に、氷上に戻って置きますから、PBSで皿を洗浄することによって、組織を収集します。
3.酵素と機械的組織解離
注：このステップでは、パパインベースの神経解離キットが推奨されます。数Neを使用しましたウラル解離キット（P）は、OPCの単離のために最適な特別な手順が記載されています。
- 適切な緩衝液で酵素Pを希釈することにより、第1解離酵素を準備します。各50ミリリットルコニカル（1サンプル）の内容は、酵素ミックスの1950μlの合計で再懸濁されます。 10分間、37℃の浴中の酵素ミックスの場所。
1サンプル：パパイン酵素のバッファー+50μlのの1900μlの - すべての50ミリリットルを3分間、300×gで3-4さいの目に切ったラット仔の皮質を含むコニカルチューブをスピン。
- 上清を吸引除去し、各サンプルチューブに酵素液1950μlを添加し、チューブを反転して穏やかに振とうすることによってペレットをばらばら。
- 連続チューブの回転で15分間、37℃の組織培養インキュベーター中でインキュベートします。
- インキュベーションの最後の5分の間に、第二の酵素ミックスA.は、その適当な緩衝液中の酵素を希釈用意。 30μlの合計が追加されます各50mlコニカルサンプルチューブに。
1サンプル：酵素の緩衝液20μl+10μlの - インキュベーションが完了したら、各チューブに第二の酵素ミックスの30μlを添加し、混合するために反転。
- ピペットコントローラに接続されているガラスパスツールピペットを用いて、機械的に10〜15回ピペッティングすることによって、または組織片のサイズが縮小され、溶液が濁るまで、組織を解離します。連続回転で15分間、37℃の組織培養インキュベーターにサンプルを返します。
- 1ミリリットルピペットを用いて各組織ホモジネート試料を10〜15回ピペット。
- 200μlのピペットを用いて各組織ホモジネート試料を15~20回ピペット
- 連続回転で10分間、37℃の組織培養インキュベーターにすべてのサンプルを返します。
- 各サンプルに（2+ の Ca 2+およびMgを）10mlのPBSを加え、50メートル上に配置された40ミクロンの細孔のフィルターを通してホモジネートをフィルタリングリットルチューブ。 PBSのさらに1〜2 mlのフィルターを洗浄します。
- プール1 50ミリリットルにホモジネート試料のすべての円錐管と全体の細胞数を取得します。
- 細胞計数を行った後、（各サンプルについて1管）15とmlのコニカルチューブに均等にホモジネートを分割します。 300×gで10-12分間遠心分離します。
4.アンチA2B5ビーズアプリケーション、カラム精製、及びめっき
- カラム緩衝液および抗A2B5マイクロビーズの計算を実行します。毎1×10 6個の細胞のために7μlの列バッファを追加します。 2μlのすべての1×10 6個の細胞のためのアンチA2B5マイクロビーズを追加します。
- 10-12分間、300×gでカラム緩衝液および遠心分離の10ミリリットルの全容量中に細胞を再懸濁することにより、サンプルのすべてを兼ね備えています。
- 工程4.1で計算された列バッファの適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。ペレットが大きいと緩んでいる場合、唯一の抗を維持するために、列バッファの容量の約半分を追加細胞の再懸濁に適切な濃度で体。
- 4℃で10分間細胞懸濁液をインキュベートします。
- 追加（ステップ4.1で計算された）抗A2B5マイクロビーズ、数回転倒し、30〜60分間、4℃でインキュベートします。静かにチューブを10分ごとに数回転倒。より長いインキュベーション時間は、細胞収量を増加させることができるが、非特異的結合を増大させることができます。
- カラム緩衝液の5倍容量を追加します。細胞を1mlの容量に再懸濁されている場合、カラム緩衝液5 mlを加え、細胞を2ml中に再懸濁されている場合、一方、カラム緩衝液10mlを加えます。
- 300×gで10分間遠心分離します。
- 精製のために必要とされるどのように多くのLSの列を決定します。 One LSカラムは15-20×10 6の全細胞のために十分です。
- 使用されているLSカラムごとにカラムバッファー1,000μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。
- プライム各カラム緩衝液5mlを添加することにより、カラムをLS。 50ミリリットルコニカルチューブのフロースルーを収集します。コラム府いったんfferは完全に、上部チャンバーを通過した各列に細胞懸濁液を1000μLを適用し、細胞が重力によってを通じて実行することができました。
注：細胞の密度が高すぎる場合は、列が遅く実行することができます。 - 細胞懸濁液がカラムを通過した直後に、ゆっくりと未結合の細胞を洗浄し、各カラムにカラムバッファーを3mlを加えます。洗浄が容易に列（すべての30-45秒のための1滴）を介して実行されている場合は、カラム緩衝液3mlでさらに2回洗浄します。
- 各列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。カラム緩衝液の5ミリリットルを追加し、カラムに同梱されているプラスチック製のプランジャーを使用して速い速度でカラムを介してバッファを突入。急落は、カラムからそれらを解放結合した細胞を除去します。
- LSカラムの第二ラウンドを通じてサンプルを実行することにより、純度を高めます。最初のパスの間に使用される列の数の三分の一を使用してください。プライムカラム緩衝液の5ミリリットルの列。列バッファが上部チャンバーを通過することを許可します。
- 細胞懸濁液の体積が非常に大きくなるので、均一に各列に細胞懸濁液を1,000μLを適用し、懸濁液を追加の1,000μlので補充する前にカラムの上部チャンバーを通過することを可能にします。
- 細胞懸濁液を完全にカラムの第二ラウンドに適用された後、カラム緩衝液3mlで2〜3回洗浄します。
- 各列を削除し、滅菌15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。カラム緩衝液の5ミリリットルを追加し、カラムに同梱されているプラスチック製のプランジャーを使用してバッファを急落。急落は、カラムからそれらを解放結合した細胞を除去します。
- 12-15分間、300×gで細胞懸濁液を遠心します。ペレットをコンパクトに表示されます。
- 予熱したOPC増殖培地（PDGF-AAを20ng / mlのを補充したOPCベースメディア）5〜10 ml中に細胞ペレットを再懸濁します。
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。 細胞をプレー。 OPCの増殖培地で60,000細胞/ mlに細胞を希釈します。各黒に、透明な底の24ウェル、ウェルの側面に沿って細胞のピペット500μlをウェルあたり30,000細胞を得ることができます。 8の字運動を使用して水平方向にプレートを振とうすることにより細胞を混ぜます。 48、96、または384ウェルプレート中でアッセイを行う場合は、それぞれ、ウェルあたり15000、7500、または1500のセルを追加します。これらの番号は、個々のプレートの仕様に応じて調整することができます。
- 0日目のベースラインコントロール培養のために別々のプレートを準備します。セクション5.7で説明したように分化が0日目に開始されたとき、この制御板は、4％パラホルムアルデヒドで固定されるべきです。
- 文化のないメディアの変化との3日間、37℃でのOPC増殖培地中の細胞。
4％パラホルムアルデヒドでOPC分化および固定の5誘導
注：oligodendrogenesisに小分子の効果をテストするとき、私たちは日常的にdissolv次いで、-80℃で保存し、0.1％DMSOの最終濃度を得るために直接SATO培地中に希釈することができる1,000倍ストックを調製するためのジメチルスルホキシド（DMSO）の電子薬剤。我々は、（データは示していない）DMSOのこの濃度を用いてOPCの増殖または分化のいずれかに変化が認められませんでした。
- プリ暖かいOPCのベース媒体を37℃にし、室温に薬物治療ストックを解凍。重複して治療を行う場合は、1.5mlチューブに処置群あたりのメディアの約1.25ミリリットルを準備します。 3つの試料について、たるみを考慮するために、2ミリリットル容量の遠心管を使用しています。
- OPCベースのメディアに直接治療の株式を希釈することによって、レプリケート井戸の治療マスターミックスを準備します。簡単に言えば渦やそっと治療の均一な分布を確実にするために、各マスターミックスを混ぜます。
- 陽性対照および陰性対照として適切な車両として45 nmのトリヨードチロニン（T 3）を準備します。 10 mMのT 3の株式を希釈1：OPCベース培地1ml 1,000その後さらに必要に応じてDMSOの最終濃度を低下させる治療マスターミックスに希釈します。
- 細胞の乾燥を避けるように、時間に培養ウェル一つの処理グループからメディアを吸引除去します。ウェルの側面から、文化に黒色材料を掻き避けるためにガラスパスツールピペットの先端に200μlのピペットチップを使用してください。
- ゆっくりよく1ミリリットルピペットを使用しての側面に沿って処理マスターミックスの500μlを添加します。
- 2〜3日ごとに新鮮な処理媒体との完全な培地交換を行って、希望の時間枠のための文化をインキュベートします。私たちは日常的に分化培地で4日後に30％から40％MBP +文化を観察します。
- 所望の治療期間の終了時に、新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製または室温に凍結ストックを解凍。注意：PFAは非常に有毒であり、ドラフト内で調製しなければなりません。
- メディアを吸引し、ゆっくりと400を追加1;細胞を固定するための井戸の側にPFAのリットル。室温で20分間プレートをインキュベート。
- PFAを吸引し、ゆっくりと細胞を洗浄し、ウェルの側に無菌（のCa 2+およびMg 2+）のD-PBSを500μlを追加します。洗浄をさらに2回の合計を繰り返します。最終洗浄を吸引しないでください。
- 後の処理のために4℃でパラフィルムや店舗でプレートを包み、または次のステップに直接進みます。プレートを数週間保存することができます。
ミエリン塩基性タンパク質の6免疫細胞化学および定量化
注：24ウェルプレート中の液体取り扱い手順を実行する場合、細胞の乾燥を避けるために、高速に動作することをお勧めします。ここでは、マルチチャンネル真空吸引器とマルチチャンネルピペットの使用が推奨されています。
- 、室温にプレートを持参のウェルを吸引し、0.1％トリトンX-100および5％を含む（のCa 2+およびMg 2+を含む）のD-PBSを250μlを追加正常ヤギ血清（NGS）。穏やかな軌道に振とうしながら室温で1時間プレートをインキュベートします。
- 1000ウサギポリクローナル抗アクチン抗体を1：マウスモノクローナル抗MBP抗体1を希釈することによって一次インキュベーション溶液を調製し、5％NGSを含有するD-PBS中の200（のCa 2+およびMg 2+）。あるいは、ウサギポリクローナル抗OLIG2 1：1,000混合膠細胞培養におけるオリゴデンドロサイト特異的な正規化のために使用することができます。ウェルあたり250μLを収容するのに十分な第一の溶液を調製します。
- 穏やかな軌道に振とうしながら16から18時間、4℃で一晩一次抗体をインキュベートします。
- 一次インキュベーション溶液を吸引除去し、穏やかな軌道振盪しながら室温で（のCa 2+およびMg 2+）のD-PBSを500μlで細胞を3×10分を洗います。
- プレートを洗浄し、一方、抗マウス680及び抗ウサギ800抗体1を希釈することにより二次培養液を調製し、D-PBS中の500（のCa 2+ 2+）、5％NGSを含みます。この溶液を調製する際に周囲光の露出を最小限に抑えます。
- 最終洗浄を吸引し、二次インキュベーション溶液の250μlを添加します。光からプレートを保護し、穏やかな軌道に振とうしながら1時間室温で静置します。
- 二次インキュベーション溶液を吸引除去し、穏やかな軌道振盪しながら室温で（のCa 2+およびMg 2+）のD-PBSを500μlでウェルを3×10分を洗います。
- 700 nmおよび800 nmの蛍光発光を検出することができる画像形成システムを用いてプレートをスキャンします。出発点として、MBPのための1.5から3と感度、アクチンのための5.0、およびOLIG2 3.5にフォーカスオフセットを設定します。信号露出オーバーを避けるために、必要に応じて感度値を調整します。
- 半自動化されたソフトウェアベースの方法を使用してoligodendrogenesisの程度を定量化します。
- ソフトウェアを使用して、プレートの分析モードを「24ウェル」に設定し、Tの周りに円を揃えますスキャンされた井戸の彼外周。 「800」に正規化チャネルを設定し、700 nmの（MBP）と800 nmの（OLIG2 /アクチン）チャネルの合計と相対蛍光強度をエクスポートします。
- 相対蛍光単位で正規化されたMBP発現を与えるために800 nmでの強度で700 nmでの強度を分割します。反復測定の平均値を計算し、分析のために、必要に応じて日に0 + PDGFコントロールを表現するスケール。
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Representative Results
A2B5陽性のOPCは、磁気カラム分離システムを使用して陽性細胞の選択によって単離されます。単離手順の前に、全脳はP5とP7の間にあるラットの子から削除されます。全脳を正常頭蓋骨から取り外されると、嗅球および小脳微細手術用鉗子（ 図1A）を使用して除去されます。大脳皮質組織を単離するために視床下部、視床と中脳を慎重に解剖（ 図1B）によって切除されています。次に、海馬および線条体を折り曲げ手術用鉗子（ - D 図1C）を用いて除去されています。髄膜および血管系が除去されたときに分離工程を効率的に（ 図1E）髄膜および線維芽細胞を排除するが、酵素消化が改善されています。最後に、1ミリメートルのx 1mmの組織ブロックは、 図 （その後の組織解離工程のために用意されていますURE 1F）。
良いOPC分離は、最終的なスピンステップ（ 図2A）の後にコンパクトな細胞ペレットをもたらすべきです。いったん顕微鏡（ 図2B）の下で見たときに、これらの培養物は、細胞破片を比較的自由になりますメッキ。次善の分離は、細胞破片の大量の存在に起因する大規模なふわふわペレットになることがあります。この破片は、PLLでコーティングされた容器に強く接着し、文化（ 図2C）を妨げる可能性があります。大型ふわふわペレットを具体化した場合、それは、10mlのPBSで細胞を再懸濁し、<300×gで10分間の最終的な回転を繰り返すことを助けることができます。分離が完了すると、培養物の純度は、A2B5陽性細胞のパーセンテージを識別するために、フローサイトメトリーによって評価することができます。成功したアイソレーションがA2B5のための> 95％陽性である細胞のプールをもたらすはずである（ 図2D - F）。蛍光色素結合抗A2B5抗体で染色された細胞と比較して、未染色細胞が陰性集団として表示され、ゲートのベースライン基準として用いることができます。さらに、我々は以前に11を免疫細胞化学によりPDGFRαのために陽性に染色A2B5抗原利回り培養を用いて、OPCのその選択を示しています。
免疫細胞化学によって示されるように、治療の開始（0日）でのOPCがOLIG2 + / MBPある-細胞はOLIG2 + / MBP + 4日目により（ 図3）であるのに対し。 0日目と4日目でのOPCとオリゴデンドロサイトの最適な細胞集密度は、代表的な明視野像（ 図4A）に示されています。 0日目でのMBP発現の不在はoligodendrogenesisを定量化するためのベースラインとして機能します。 PDGF-AA離脱の結果としての自発的分化は、45 nmの甲状腺ホルモンのに対し（triio、ネガティブコントロールとして機能しますdothyronine; T3）はポジティブコントロール11,15として使用することができます。またTavistとして知られてもセロクエルとしても知られている、クエチアピン、およびクレマスチンは、 インビトロ oligodendrogenesis に加速することが示されており、16,17付加的な陽性対照として使用され得る、FDA承認薬である。 図4Bは、代表的な2チャンネルの赤外線を示します蛍光スキャンは、三連で、これらの条件の各々について期待される結果を示します。高度に差別文化がマージされた画像では黄色に見えるようにアクチンとMBP信号は、それぞれ緑と赤の疑似カラーました。結果は、PDGFの撤退条件で4日目でのMBPの発現があったことを示す4.5±1.4倍MBPの倍率変化のに対しによる甲状腺ホルモン、クエチアピン、およびクレマスチンでの治療に、0日目に比べて高かった33.9±4.1、33.4±1.0 、それぞれ32.8±0.5（ 図4C）。アッセイの堅牢性と精度は、SMによって実証されています三連のサンプルおよびPDGFの撤退コントロールより約20標準偏差が大きい治療活性化ウィンドウの中で、すべての標準偏差。
アクチンは、オリゴデンドロサイト培養物中の正常化のための信頼性のある参照遺伝子として機能するが、代替の参照遺伝子を使用することもできます。 OLIG2は、構成オリゴデンドロサイト系譜の細胞で発現される核転写因子です。その具体的かつ構成的発現パターンは、このように異種の培養状況で、より好ましいの正規化戦略を提供することができる。 図5のいずれか使用したときに10 nmの甲状腺ホルモンで微分OPC培養において、PDGFの撤退にMBP発現の相対で計算された倍数変化が同じであることを示しています正規化のためのOLIG2またはアクチン。この実験ではOPCの培養物は非常に純粋であったので、おそらく、両方のタンパク質は、正規化のために確実に使用することができます。しかし、我々oftenは4日目によってOLIG2陰性細胞の小集団を観察したが、OLIG2陽性人口にこの人口の比率が大幅にPDGFの撤退とT3処理群間で異なっていないようです。このように、折りたたみ式の変更は影響を受けません。治療はOLIG2陰性細胞型の増殖を引き起こす可能性があるシナリオを考えると、正規化抗体の選択は慎重に検討する必要があります。
図1：ラットの脳の解剖手順解剖手順の段階的な説明この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：孤立のフローサイトメトリー分析OPC（A）磁気カラム精製した後、結合した細胞集団は、カラムから急落し、コンパクトなペレットを形成するために遠心分離されます。破片の量は、ペレットの大きさによって示されます。 （B）ペレットがコンパクトである場合、破片は、培養中で最小となります。 （C）大とふわふわペレットは、一般的に重い破片と文化になります。培養物の純度は、APCとコンジュゲートされたラット抗マウスA2B5抗体を用いたフローサイトメトリーにより決定されます。前方散乱および側方散乱プロットに示すように（D）死細胞および残骸を分析から除外されています。 （E）A2B5陽性集団をゲーティングするためのベースライン基準としてサンプリング未染色を用いて決定することができます。 （F）正常に分離されたOPCが、A2B5のために> 95％陽性であるべきである。 争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
図3：OPCの文化と分化手順は、デュアル赤外蛍光スキャン（DIFS）アッセイは、たてisolatedA2B5陽性ラットのOPCは、PLLでコーティングされた培養容器（3日目）上にプレーティングから始まります。これらの培養物は、20 ngの/ mlのPDGF-AAの存在下で3日間増殖し、その後、完全に2日目に補充される0日目の治療のメディアに新鮮なPDGFを含まない培地中で実験的な要因で処理し、細胞が固定されているされていますOLIG2（緑）、MBP（赤）のために4日目免疫細胞化学上の4％パラホルムアルデヒドは、核対比染色としてDAPI（青）を使用して、0日目と4日目での代表的な文化で行われました。これらの培養物は、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーを染色するのに対し、MBPが唯一のEVで、日0と4でパンオリゴデンドロサイト系譜細胞マーカーOLIG2のための構成的染色を示します4日目によるidentが、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：デュアル赤外蛍光スキャン（DIFS）アッセイを使用して、MBPの定量化 （A）最適なアッセイ性能のために必要な0日目でのOPC培養物の密度と4日目。 （B）代表デュアル赤外蛍光をスキャンします。 OPCが45 nmのT3、1μMクエチアピン、1μMのクレマスチン、または三連で0.1％のDMSOの存在下で4日間、24ウェルプレート中で分化させました。 0日目（+ PDGF）上に固定されたのOPCを含む別のプレートを並行して処理しました。アクチン（緑疑似カラー）およびMBP（赤疑似カラー）を同時に700 nmおよび800 nmの放射を検出するように設定LICORオデッセイスキャナを用いて定量しました。 （
図5：OLIG2は、オリゴデンドロサイトにMBP発現を正規化するための信頼性のある参照タンパク質である OPCには、10 nmのT3または4日間、24ウェルプレート中で0.1％DMSO媒体対照の存在下で三重に分化させました。デュアル赤外線蛍光走査アッセイは正規化のために、抗OLIG2または抗アクチン一次抗体を用いて行きました。 OLIG2 /アクチンおよびMBPを同時に700 nmおよび800 nmの放射を検出するように設定LICORオデッセイスキャナを用いて定量しました。 MBPの発現はありませんでしたOLIG2またはアクチンの発現のいずれかにrmalized、その結果は、0.1％DMSO対照にスケーリングしました。 SD±平均相対蛍光単位は、グラフパッドプリズム6の結果を用いてプロットされた2つの基準のタンパク質のいずれかに正規化する際に計算された倍数変化が同じであることを示しています。
図6：トリトンX-100 MBP染色上の効果は、OPCが45 nmのT3または0.1％DMSOの存在下で4日間、24ウェルプレート中で分化させました。培養物を4％PFAで固定し、OLIG2及びMBPは、2つの異なる免疫細胞化学プロトコールを用いて染色しました。高トリトンX-100のサンプルのために、細胞を、0.4％トリトンX -100で1時間透過処理し、全ての抗体インキュベーション工程は、0.1％トリトンX-100の存在下で実施しました。 antiboながら低いトリトンX-100のサンプルのために、細胞を、0.1％トリトンX-100で1時間透過処理しました。DYインキュベーションは、トリトンX-100なしで実施しました。 OLIG2とMBPを蛍光色素コンジュゲート二次および画像は、カメラベースの蛍光顕微鏡を用いて得たで可視化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、ラットのOPCを単離し、実験的な要因に応じて、 試験管 oligodendrogenesis に定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を記載しています。正の選択を使用して、実行可能な、純粋なOPCの高い収率を実験目的のために直接使用されています。この方法は、1週間の時間枠に分離、培養、および分化工程を合理化し、固定された細胞は、好都合には、アッセイ感度を損なうことなく数週間4℃で保存することができます。
スキャナベースの蛍光アッセイの主な利点は、データの収集および分析が大きく、従来のカメラベースの顕微鏡技術に対して促進されることです。顕微鏡がOPC分化のインデューサーを同定するためのハイスループットスクリーニングにおいて首尾よく使用されてきたが、それは目に画像キャプチャシーケンスのプログラミング、データ収集の数時間、数百の分析を必要とするため、データ収集は本質的に遅いです正規化または解析18,19のための個々の細胞体を区別するための画像ファイル、およびユーザ定義のアルゴリズムousands。さらに、カメラベースの顕微鏡システムでは、培養容器の表面全体からデータを取得することは不可能です。その代わりに、代表的な画像は、位置バイアスと偽陽性のヒットにつながる可能性があり、単一のウェル内の異なる領域、からキャプチャする必要があります。比較すると、このアッセイは、よく与えられた内のすべてのセルからのMBP発現を検出し、複数のプレートを同時に走査することができます。この方法は、96ウェルまたは384ウェルフォーマットで使用するために適合することができるが、より少ない治療が試験されているときに、24ウェルプレートが好ましい場合があります。我々は、より高いスループット実験を設計する際に考慮されるべき合併症である、液体ハンドリングによる24ウェルプレート中の細胞の損失が最小化されることを観察しました。
アッセイの重要なパラメータは、differenti細胞の密度であり、ationが少なすぎる細胞と0培養物は、高密度培養が自発的分化を示しながら、よりゆっくりと分化し、死滅するように見える日で開始されます。両方の状況では、アッセイのダイナミックレンジと信頼性を低下させることができます。細胞の健康と細胞密度との間の最適なバランスを達成するために、我々培養新鮮なPDGF-AAの培地交換または補充することなく3日間のOPC。我々は、細胞の異化作用の結果として、3日目のin vitro（0日目）によるメディアの下落でPDGF-AAの濃度は、細胞の増殖速度は、その増殖がPDGF-の最初の日を通して減少さ鈍化するという仮説を立てましたAA撤退。細胞が均等にめっき中に分散している場合、この手法が最適です。ウェルの側面に沿って細胞をピペットで均一な分布を促進すべきである8の字運動を使用してそれらを混合します。ウェルの中央にピペッティングは、数とウェルのエッジの周りの細胞のクラスターを生成する傾向があります中心部に付着した小胞体細胞。この現象は、液体分注力により新たに乾燥したPLL層の破壊に起因し得ます。周囲細胞の蓄積が原因密度依存分化のアッセイ感度を低下させることができます。アクチン/ OLIG2信号の強度における有意差は、薬物処置およびコントロール、PDGF離脱培養の間に発生する可能性があることに留意することが重要です。大幅に大幅に増加したアクチン/ OLIG2信号が薬物誘発性増殖を示している可能性があり、一方、薬物毒性を示す可能性アクチン/ OLIG2信号を減少させました。私たちは通常、PDGF離脱対照と比較して、プロ分化薬で処理した細胞からわずかに高いアクチン/ OLIG2信号を観察します。私たちは4日間の分化過程の上にPDGFの撤退群における自発的アポトーシスのより高いレートにこの違いを属性。 oligodendrogenesisを評価する際、アクチン/ OLIG2にMBPの正規化は、細胞数の差を補正する必要があります。 toxiを評価するために、このアッセイを使用して都市および増殖は、抗MBP抗体は、適切なマーカーに対して向けられた一次抗体と交換することができます。
実験は両方の定量的および定性的な評価を必要とする場合には、細胞を固定するために、4％PFAを使用した場合のTriton X-100に固定されたラットのオリゴデンドロサイト培養物の露出を制限することが重要です。典型的には、抗体エピトープのアクセシビリティを向上させるために、抗体インキュベーションステップの両方の中にトリトンX-100を含むオリゴデンドロサイト培養物のための他の免疫細胞化学プロトコルは、実験の要件に応じて正常に使用することができます。 MBPは細胞内タンパク質であるが、一方、代替の固定方法は十分に細胞を透過性が採用されている場合、完全にトリトンX-100を除外することも可能です。ここに記載した条件を用いて、我々は、トリトンX-100は、オリゴデンドロサイトの観察された形態、ならびにMBP染色の局在に影響を与えることを観察しました高濃度で使用した場合。トリトンX-100は、抗体のインキュベーションステップから省略されたときに我々は、抗体染色の大幅な下落が表示されません。抗体のインキュベーション中0.4％トリトンX-100で透過処理し、ブロッキング工程において、0.1％トリトンX-100を含む、 図6に示すように、不連続なMBP染色におけるミエリンプロセスおよび結果の検出を低減します。したがって、定量的および定性的評価のために、ここで説明したように、トリトンX-100のより低い濃度を使用するのに十分であり得ます。
ラットからA2B5-選択OPCの使用が有利になることができますが、我々は、マウス当たりの細胞収率は、典型的には、多くのですが、C57BL / 6マウスからA2B5-選択するOPCを用いたデュアル赤外蛍光スキャン（DIFS）アッセイに匹敵する結果を観察しています低い（データ示さず）。 OPCの精製のための他のプロトコルもまた、このアッセイと適合性であってもよいです。例えば、オリゴデンドロサイトマーカーO4は整数を精製するための抗原として使用することができます磁気ビーズ20を使用してermediateステージオリゴデンドロサイト前駆体。磁気ベースの方法に代わるものとして、OPCには、Hi-Speed 軌道振とうおよび差動接着方法21によって、アストロサイトとミクログリアを含む9日齢の混合グリア培養物から濃縮することができます。培養の純度は高い細胞収率22よりも好ましい場合さらに、両方の陰性および陽性細胞の選択を組み込む免疫パニング手順を使用してもよいです。治療薬は直接純粋培養におけるOPCの分化を促進することができる方法を検討することに加えて、共培養系における他の細胞型を介して薬剤の間接的な影響を考慮することが必要な場合があります。 MSは、CNSへの自己反応性Tエフェクター細胞の浸潤は、疾患の進行23において役割を果たしていると考えられています。エフェクターT細胞は、脱髄の部位でのOPCの分化を阻害することができる炎症誘発性因子を分泌することができます。これは、ティラを識別することは興味深いことですOPCを保護し、怪我を悪化させるから、これらのプロ炎症因子をブロックすることがありpeutics。 DIFSアッセイは、T細胞が懸濁液中で成長し、離れて、オリゴデンドロサイト培養物から前にMBPの定量化に洗浄することができるように、この活動をモデル化するための理想的な場合があります。例えば、ニューロン、アストロサイト、およびミクログリアのような接着細胞を含む共培養研究のために、OLIG2の正規化は、具体的には、オリゴデンドロサイトからデータを収集するために使用することができます。従って、DIFSアッセイの柔軟性は、実験デザインの多様を容易にすることができます。
結論として、このプロトコルは、in vitroで A2B5陽性ラットOPCのoligodendrogenesisを定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を提供する。この分離法は、一貫して確立された分化の合図に応答する実行可能なOPCの高収量を実現します。感度分析は、MAにこのシステムの有用性を拡張する実験パラダイムの多様を用いたマルチウェル形式の容器で行うことができますNY異なるアプリケーション。また、DIFSアッセイは、ハイスループット薬物スクリーニングに適合させることができる、またはそのような定量的PCRおよびウェスタンブロットなどの低スループットアッセイの結果を検証するために使用することができます。重要なことは、このシステムは、多発性硬化症などの脱髄疾患におけるOPC標的療法を同定するためのシンプルで効果的な手段を提供することがあります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
グラントスポンサー：国立衛生研究所。グラント番号：R37 NS041435。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
