Introduction
condução do nervo eficiente no sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) requer a mielinização dos axónios por oligodendrócitos. Durante o desenvolvimento, oligodendrócitos surgem a partir de um conjunto de células progenitoras de oligodendrócito (OPCs) que estão pensados para migrar das zonas do ventrículo do cérebro anterior e do tubo neural em desenvolvimento 1. Depois de OPCs migração diferenciar em oligodendrócitos, maduros myelinating que não só facilitar a propagação do impulso eficiente, mas também fornecer axônios com suporte trófico 2. O adulto CNS mantém uma população abundante de OPCs que estão dispersos em toda a matéria cinzenta e branca que compreende cerca de 5-8% de todas as células 3. Após um insulto desmielinizante, OPCs migram para o local da lesão, proliferar, diferenciar e para substituir as bainhas de mielina perdidas ou danificadas em axónios expostas. No entanto, em algumas configurações de doença / lesão, este processo é encontrado para ser ineficiente ou pode falhar completamente 4. Enquantodesmielinização crónica é pensado para aumentar a carga de doença, oligodendrogenesis eficiente e remielinização pode aliviar os sintomas 5. Tem sido, portanto, de interesse para o estudo OPCs in vitro para determinar o efeito dos factores experimentais sobre oligodendrogenesis.
Visão sobre as diferentes fases de diferenciação de oligodendrócitos tem sido possível pela identificação de marcadores de células específicas do estágio. A auto-renovação de células progenitoras iniciais são definidas pela sua expressão de plaquetas derivadas de receptores de factor de crescimento alfa (PDGFRα), antigénio neuronal / glia 2 (NG2) e A2B5 6-8. Como OPCs iniciar o seu programa de diferenciação e retirar-se do ciclo celular, eles regular negativamente a expressão destes marcadores e começam a expressar proteínas indicativas de premyelinating incluindo oligodendrócitos cíclica-fosfodiesterase de nucleótidos 3'-(CNPase) e O4. Finalmente, a sua diferenciação em oligodendroc mais maduroytes é caracterizada pela expressão de proteínas associadas à mielina, incluindo a glicoproteína associada à mielina (MAG), proteína proteolipidica (PLP), e proteína básica de mielina (MBP). MBP é uma proteína de membrana periférica intracelular e um grande componente da bainha de mielina. Camundongos sem MBP desenvolver um fenótipo grave em que a mielinização do SNC é significativamente diminuir, levando a tremores, convulsões e morte precoce 9,10. Este papel importante de MBP na mielinização tem levado ao seu uso como um marcador de diferenciação de oligodendrócitos in vitro e in vivo 11.
Quantificação da MBP pode ser conseguido usando várias metodologias diferentes. A análise de Western blot e RT-PCR para permitir que a quantificação dos níveis de MBP sob diferentes regimes de tratamento. Imunocitoquímica é uma abordagem qualitativa comum que também pode ser quantitativa, quando são usados métodos de microscopia baseado em câmera. Embora estes sistemas sejam fiáveis e fundamentalo estudo da diferenciação de oligodendrócitos, cada um tem as suas próprias desvantagens que limitam a sua utilização na triagem de drogas. Em primeiro lugar, a quantidade de OPCs primárias que são necessários para RT-PCR e análise por Western blot reduz o número de variáveis que podem ser examinados simultaneamente. Embora a exigência celular para imunocitoquímica é muito menor, um tempo considerável deve ser dedicado a cada experiência, se a quantificação é o objetivo. Numerosos imagens devem ser capturados e, em seguida quantificado para facilitar a análise experimental. Estas advertências tornam-se obstáculos importantes a considerar para estudos que requerem avaliação de alto rendimento. Descrevemos aqui um método que utiliza os aspectos fundamentais de tanto a imunocitoquímica e metodologias de Western blot para quantificação de mielina, enquanto reduz significativamente tanto o número de células necessário para completar o tempo e a análise quantitativa.
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Protocol
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e Johns Hopkins School of Medicine.
1. Preparação de placas de ensaio, Soluções de ações e OPC Base de mídia
Nota: A base de OPC rato media (Sato) descritos aqui foi derivada de estudos publicados anteriormente 12,13. formulações de meios alternativos também podem ser compatíveis com este procedimento.
- Ressuspender poli-L-lisina (PLL) a uma concentração de 10 ug / ml em água desionizada estéril. Pipete 400 pi da PLL diluída para cada poço de uma parte inferior 24 do tecido bem prato preto de parede, claro grau de cultura.
- Brasão placas de cultura de tecidos para 2 horas em um tecido C 37 ° incubadora de cultura ou durante a noite em um 4 ° C geladeira.
- Aspirar PLL de pratos revestidos, pelo menos, 20 min antes do plaqueamento. Permitir que o restante PLL para secar a partir do poço, colocando placas de 24 poços, com a tampa parcialmente aberta numa cultura de tecidoscapuz. Verifique se os poços estão completamente secos antes do plaqueamento OPCs isoladas. As células não irá aderir ao plástico que tenha PLL líquido presente.
- Preparar solução de N-acetil-L-cisteína (NAC) (1.000X): Dissolve-se 100 mg de N-acetil-L-cisteína (NAC) em 20 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- Prepare solução de hidrocortisona (1.000 vezes): Adicionar 1 ml de etanol para 1 mg de hidrocortisona e agite para dissolver. Adicionar 19 ml de DMEM, misturar a solução, alíquota e armazenar a -20 ° C. A adição de hidrocortisona aos meios de comunicação de base foi mostrado para melhorar a sobrevivência de células da glia 14.
- Preparar a solução da d-Biotina (5,000x): Dissolve-se 2,5 mg de d-biotina em 50 ml de PBS. Adicionar 1-2 x 5 gotas uL de NaOH 0,1 N para ajudar na dissolução. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- Preparar a solução da insulina (100x): Dissolver 25 mg de insulina em 50 mL de água de grau de cultura de tecidos. Adicionar 250 ul OF 1 N de HCl e misturar até que a solução é límpida. Esterilizar com um filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C durante até 6 semanas.
- Preparar a solução estoque Sato (100x):
- Preparar a solução da progesterona (25 ug / ul): Dissolve-se 2,5 mg de progesterona em 100 ul de etanol.
- Preparar a solução de estoque de selenito de sódio (400 ng / ul): Dissolve-se 4 mg de selenito de sódio em 100 mL de 0,1 N NaOH. Adicionar 10 ml de DMEM e misturar.
- A 100 ml de DMEM, adicionar 1 g de apo-transf errina, 1 g de albumina de soro de bovino, e 160 mg de putrescina e misturar até dissolver completamente. Adicionar 25 ml de solução de estoque de progesterona, 1.000 ml de solução de estoque selenito de sódio, e misture. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- Prepare OPC base de mídia: por 100 ml de DMEM (com 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamina, e 110 mg / l de piruvato de sódio), adiciona-se 100 ul de NAC, 100 ul de hidrocortisona, 20 ul d-Biotina, 1 ml insulina, 1 ml estoque Sato, 100 ul oligoelementos B,2 mL de B-27, suplemento (50x), e 1 ml de penicilina / estreptomicina (100x). Esterilizar com um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
- Preparar a solução de estoque de PDGF-AA (1.000X): Dissolve-se 250 ug em 12,5 ml de PBS com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) para perfazer uma solução de 20 ug / ml. Alíquotas e armazenar a -80 ° C.
- Prepare OPC proliferação meios: meios de base OPC suplementado com 20 ng / mL de PDGF-AA.
- Prepare a mídia de diferenciação OPC: media de base OPC suplementadas com 45 Nm triiodotironina.
- Preparar tampão de coluna: a 500 ml de PBS, adicionar 2,5 g de BSA e 2 ml de ácido etilenodiaminotetra-acético 0,5 M (EDTA) e ajustar o pH para 7,2. Esterilizar com um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
2. Rat Dissection Cérebro
Nota: filhotes P5-P7 ratos são usados neste protocolo. Cada córtex filhote de rato produz cerca de 1,5-2,0 x 10 células positivas 6 A2B5.
- Esterilizar todo o equipamento de dissecção usando um 2506; C talão aquecida esterilizador.
- Adicionar 15-20 mL de PBS (sem Ca 2+ e Mg 2+) para tubos de 50 mL cónicos. Um tubo de 50 ml é suficiente para 3-4 córtices filhote de rato. Coloque 50 ml tubos cônicos no gelo. Use 50 ml tubos cônicos para segurar tecido do córtex cortado durante a dissecção.
- Adicionar frio PBS a um 10 centímetros placa de Petri. Este prato vai ser utilizada para dissecação sob a luz do microscópio.
- Sacrificar filhotes de ratos por decapitação com grandes tesouras cirúrgicas. Spray de cabeça com 70% de etanol.
- Extrai-se a Whole Brain
- Com uma tesoura pequena cortar a pele abaixo da linha média e atrás das orelhas e retalhos de pele casca de volta. Cortar o crânio para baixo da linha média a partir do tronco cerebral e terminando no olhos. Ter cuidado para não cortar muito profundamente, a fim de preservar a estrutura do córtex subjacente.
- Faça dois cortes laterais inferior ao cerebelo através da inserção de pequenas tesouras cirúrgicas no forame magno. Faça um corte adicional entre os olhos, formigaerior para os bulbos olfatórios.
- Retire cuidadosamente cada metade do crânio de volta. Remover todo o cérebro e lugar no 10 centímetros placa de Petri com PBS frio.
- Sob o microscópio de luz dissecção, remover os bulbos olfatórios e cerebelo com pinça cirúrgica finas.
- Virar o cérebro de modo que a superfície ventral é visível ao microscópio óptico.
- Usando fórceps finos rectas executar uma dissecção romba através da colocação dicas pinças fechadas entre o córtex e hipotálamo a uma profundidade de cerca de 2/3 do cérebro. Uma vez que uma pinça estão no lugar permitir que as extremidades para abrir. Repita para o outro hemisfério.
- Provoque o córtex do hipotálamo e regiões do mesencéfalo.
- Remover o hipotálamo, tálamo e mesencéfalo, segurando o mesencéfalo, na sua superfície posterior e de raspagem em direcção a extremidade anterior do cérebro. Cortar as ligações anteriores.
- Remover o hipocampo por repicante-o para fora e, em seguida, cortando a sua ligação aocórtex usando pinça fina dissecação dobrados.
- Remover striatum restante, a demolição-lo a partir do córtex subjacente num movimento exterior diagonal usando pinça fina dissecação dobrados.
- Limpar qualquer vasos sanguíneos e meninges da superfície ventral do córtex.
- Virar o cérebro de modo que a superfície dorsal é visível. Meninges e vasos sanguíneos deve ser aparente. meninges casca do córtex subjacente usando uma pinça de dissecção fina. Começar a descascar a partir do local de fixação bulbo olfativo.
- Completar os passos 2,4-2,14 para um total de 3-4 filhotes de ratos.
- Coloque 3-4 dissecados córtices filhote de rato em uma placa de Petri seca e cortar com uma lâmina de barbear esterilizada até 1 mm pedaços x 1 mm sejam alcançados. Recolha de tecido por lavagem prato com PBS de um tubo de 50 ml (passo 2), em seguida, colocar de volta no gelo.
3. enzimática e dissociação mecânica tecidual
Nota: Para esta etapa, um kit de dissociação neural baseada em papaína é recomendado. usando NeKit de dissociação ural (P), passos especiais que são óptimas para o isolamento de OPC são descritos.
- Prepara-se o primeiro enzima de dissociação por diluição de enzima P com o tampão apropriado. O conteúdo de cada cónico de 50 ml (1 amostra) será ressuspensas com um total de 1.950 ul de mistura de enzimas. Coloque a mistura em um banho de enzima em 37 ° C durante 10 min.
1 Amostra: 1.900 ul de tampão + 50 ul de enzima papaína - Girar todos os 50 ml tubos cônicos contendo 3-4 cubos córtices filhote de rato a 300 xg por 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 1,950 ml de solução de enzima a cada tubo de amostra e separar o sedimento por inversão do tubo e agitação suave.
- Incubar num tecido 37 ° C incubadora de cultura durante 15 minutos com rotação do tubo contínuo.
- Durante os últimos 5 minutos da incubação, a preparação da segunda mistura de enzima A. Diluiu-se a enzima no seu tampão apropriado. vai ser adicionado um total de 30 ulpara cada 50 ml de tubos de amostra cónica.
Amostra 1: 20 ul de tampão + 10 ul de enzima - Uma vez completada a incubação é adicionar 30 ul da segunda mistura de enzima a cada tubo e inverta para misturar.
- Usando uma pipeta de Pasteur de vidro ligada a um controlador de pipeta, dissociar o tecido mecanicamente por pipetagem de 10-15 vezes ou até que os pedaços de tecido são reduzidos em tamanho e a solução tornou-se turva. Devolver a amostra de tecido a 37 ° C incubadora de cultura durante 15 minutos com rotação contínua.
- Pipetar cada amostra de homogenato de tecido 10-15 vezes utilizando uma pipeta de 1 ml.
- Pipetar cada amostra de homogenato de tecido 15-20 vezes utilizando uma pipeta de 200 uL
- Retornar todas as amostras para o tecido C 37 ° incubadora de cultura durante 10 minutos com rotação contínua.
- Adicionar 10 ml de PBS (com Ca 2+ e Mg 2+) a cada amostra e filtrar o homogenato através de um filtro de poro de 40 colocado ao longo de um m 50l tubo. Lavar o filtro com um adicional de 1-2 ml de PBS.
- Pool Todas as amostras de homogenato para um tubo cónico de 50 ml e adquirir uma contagem de células total.
- Depois de realizar a contagem de células, dividir uniformemente o homogenato em tubos de 15 mL cónicos (um tubo para cada amostra). Centrifugar durante 10-12 min a 300 x g.
4. Anti-A2B5 Bead Aplicação, purificação em coluna e Galvanização
- Efectuar cálculos para tampão de coluna e microesferas anti-A2B5. Adicionar tampão de 7 ul coluna para cada células 1 x 10 6. Adicionar 2 mL microesferas anti-A2B5 células por cada 1 x 10 6.
- Combinar todas as amostras por ressuspensão das células num volume total de 10 ml de tampão de coluna e centrifugar a 300 xg durante 10-12 min.
- Ressuspender o sedimento de células em uma quantidade apropriada de tampão de coluna, como calculado no passo 4.1. Se o sedimento é grande e solto, só adicionar aproximadamente metade do volume de tampão de coluna para manter o anticorpo a uma concentração adequada na resuspensão de células.
- Incubar a suspensão de células durante 10 min a 4 ° C.
- Adicionar microesferas anti-A2B5 (calculado no passo 4.1), inverter várias vezes e incuba-se a 4 ° C durante 30-60 min. Inverta suavemente o tubo várias vezes a cada 10 min. tempos de incubação mais longos podem aumentar os rendimentos de células, mas pode aumentar a ligação não específica.
- Adicionam-se 5 volumes de tampão de coluna. Se as células são ressuspensas num volume de 1 ml, adicionam-se 5 ml de tampão de coluna, enquanto que, se as células são ressuspensas em 2 ml, adicionar 10 ml de tampão de coluna.
- Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.
- Determinar quantas colunas LS serão necessários para a purificação. Uma coluna LS é suficiente para 15-20 x 10 6 células totais.
- Ressuspender o sedimento de células em 1,000 mL de tampão de coluna por coluna LS a ser utilizado.
- Primeiro cada coluna LS por adição de 5 ml de tampão de coluna. Recolhe-se o fluxo através de um tubo de 50 ml. Uma vez que os bu colunaffer tenha passado completamente através da câmara superior, aplicam-se 1.000 mL da suspensão celular a cada coluna e permitir que as células a ser executado por meio de, por gravidade.
Nota: Se a densidade de células é demasiado elevada, a coluna pode executar lenta. - Imediatamente após a suspensão de células foi passada através da coluna, adiciona-se lentamente 3 ml de tampão de coluna para cada coluna para lavar as células não ligadas. Se a lavagem se facilmente que atravessa a coluna (1 gota em cada 30-45 seg), lavar duas vezes com 3 ml de tampão de coluna.
- Remover cada coluna e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml. Adicionar 5 ml de tampão de coluna e mergulhar o tampão através da coluna a uma taxa rápida utilizando o êmbolo de plástico que é fornecido com a coluna. Mergulhando vai desalojar as células ligadas liberando-os da coluna.
- Aumentar a pureza executando a amostra através de uma segunda rodada de colunas LS. Use de um terço do número de colunas utilizadas durante a primeira passagem. Primeiro as colunas com 5 ml de tampão de coluna.Permitir que o tampão de coluna para passar através da câmara superior.
- Uma vez que o volume de suspensão de células será muito maior, aplicar uniformemente 1.000 ul de suspensão celular a cada coluna e permitir que a suspensão passe através da câmara superior da coluna antes de reabastecer com um adicional de 1.000 mL.
- Uma vez que a suspensão de células foi completamente aplicada à segunda volta das colunas, lavar 2-3 vezes com 3 ml de tampão de coluna.
- Remover cada coluna e colocá-lo ao longo de um tubo de 15 ml estéril. Adicionar 5 ml de tampão de coluna e mergulhar o tampão usando o êmbolo de plástico que é fornecido com a coluna. Mergulhando vai desalojar as células ligadas liberando-os da coluna.
- Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 12-15 min. O sedimento compacto deve aparecer.
- Ressuspender o sedimento celular em 5-10 ml de meio de proliferação OPC pré-aquecido (OPC meio básico suplementado com FCDP-AA 20 ng / ml).
- Contar as células usando um hemocitômetro. Placa as células. Dilui-se as células a 60.000 células / ml com meios proliferação OPC. Em cada preto, claro inferior 24 bem, pipeta 500 uL de células ao longo do lado do poço para se obter 30.000 células por poço. Misture as células agitando a placa horizontalmente usando uma figura oito movimento. Se realizar o ensaio em 48, 96, ou 384-se placas, adicionar 15.000, 7.500, ou 1.500 células por poço, respectivamente. Estes números podem ser ajustadas dependendo das especificações da placa individuais.
- Prepare um prato separado para o dia 0 culturas de controlo da linha de base. Esta placa deve ser fixada com paraformaldeído a 4%, conforme descrito no capítulo 5.7, quando a diferenciação é iniciada no Dia 0.
- Cultura das células em meios OPC proliferação a 37 ° C durante 3 dias, sem mudança de meio.
5. Indução de OPC Diferenciação e fixação com paraformaldeído a 4%
Nota: Ao testar o efeito de pequenas moléculas em oligodendrogenesis, nós rotineiramente dissolve drogas em dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar stocks 1000X, que podem então ser armazenadas a -80 ° C e diluídas directamente para o meio de SATO para obter uma concentração final de 0,1% de DMSO. Temos observado nenhuma alteração em ambos os OPC proliferação ou diferenciação utilizando esta concentração de DMSO (dados não mostrados).
- Pré-aquecer media base de OPC para 37 ° C e descongelar os estoques de tratamento de drogas à temperatura ambiente. Ao realizar tratamentos em duplicata, prepare aproximadamente 1,25 ml de meio por grupo de tratamento em um tubo de 1,5 ml. Para amostras em triplicado, use 2 tubos capacidade ml de centrífuga para explicar folga.
- Prepare as misturas principais de tratamento para poços replicados por diluição de stocks de tratamento diretamente em media base de OPC. Resumidamente vórtice ou misturar suavemente cada mastermix para assegurar uma distribuição homogénea do tratamento.
- Preparar 45 nM de tri-iodotironina (T3), como controlo positivo e do veículo adequado, como controlo negativo. Diluir T 10 mM stock 31: 1.000 em 1 ml de meio de base e OPC depois dilui-se ainda mais na mistura principal tratamento para reduzir a concentração final de DMSO, se necessário.
- Aspirar a mídia do poços de cultura de um grupo de tratamento de cada vez, de modo a evitar a secagem das células. Usar uma pipeta de 200 uL ponta na extremidade da pipeta de Pasteur de vidro para evitar raspar material preto a partir dos lados do poço e para a cultura.
- Adiciona-se lentamente 500 ul de mastermix tratamento ao longo do lado do poço utilizando uma pipeta de 1 ml.
- Incubar as culturas durante o período de tempo desejado, realizando uma troca de mídia completa com media de tratamento fresco a cada 2-3 dias. Rotineiramente observar um MBP 30-40% + cultura após 4 dias em media diferenciação.
- No final do período de tratamento desejado, preparar fresco paraformaldeído a 4% (PFA) ou um lote congelado descongelar até à temperatura ambiente. CUIDADO: PFA é extremamente tóxico e tem de ser preparado de um exaustor de fumos.
- Aspirar a mídia e adicionar lentamente 4001; L de PFA ao lado do poço para fixar as células. Incubar a placa durante 20 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar o PFA e adiciona-se lentamente 500 ul de D-PBS estéril (com Ca 2+ e Mg 2+) para o lado do poço para lavar as células. Repetir a lavagem um total de mais duas vezes. Não aspirar a lavagem final.
- Envolva a placa em parafilme e armazenar a 4 ° C para posterior processamento ou para proceder directamente o próximo passo. As placas podem ser armazenadas durante várias semanas.
6. Imunocitoqu�ica e Quantificação da Proteína Básica de Mielina
Nota: Quando a execução de procedimentos de manuseamento de líquidos nas placas de 24 cavidades, recomenda-se trabalhar rapidamente, para evitar a secagem das células. Aqui, a utilização de um aspirador de vácuo multi-canal e pipeta de multi-canal são recomendados.
- Traga a placa à temperatura ambiente, aspirar os poços, e adicionar 250 ul de D-PBS (com Ca 2+ e Mg 2+) contendo 0,1% de Triton X-100 e 5%soro de cabra normal (NGS). Incubar a placa a temperatura ambiente durante 1 h com agitação suave orbital.
- Preparar a solução de incubação por diluição primário monoclonal de ratinho anti-MBP de anticorpo de 1: 1000 e o anticorpo policlonal de coelho anti-Actina 1: 200 em D-PBS (com Ca 2+ e Mg 2+) contendo 5% de NGS. Alternativamente, policlonal de coelho anti-Olig2 a 1: 1000 pode ser utilizado para normalização específica de oligodendrócitos em culturas gliais mistas. Preparar a solução primária suficiente para acomodar a 250 ul por poço.
- Incubar anticorpos primários a 4 ° C durante a noite para 16-18 horas com agitação orbital suave.
- Aspirar a solução de incubação primária e lavar as células 3 x 10 min com 500 ul de D-PBS (com Ca 2+ e Mg 2+) à temperatura ambiente com agitação suave orbital.
- Enquanto lavagem da placa, preparar a solução de incubação por diluição secundário anti-ratinho de 680 e anticorpos de coelho anti-800 1: 500 em D-PBS (com Ca 2+ 2+) contendo 5% de NGS. Minimizar a exposição de luz ambiente ao preparar esta solução.
- Aspirar a lavagem final e adicione 250 ml de solução de incubação secundário. Proteger a placa de luz e incubar-la à temperatura ambiente durante 1 h com agitação suave orbital.
- Aspirar a solução de incubação secundária e lavar os poços 3 x 10 min com 500 ul de D-PBS (com Ca 2+ e Mg 2+) à temperatura ambiente com agitação suave orbital.
- Digitalizar a placa usando um sistema de imagem capaz de detectar 700 nm e 800 nm emissões de fluorescência. Como ponto de partida, defina o deslocamento para 3 e sensibilidades a 1,5 para MBP, 5.0 para a actina, e 3,5 para Olig2 focal. Ajuste os valores de sensibilidade, conforme necessário, para evitar a exposição excessiva do sinal.
- Quantificar a extensão da oligodendrogenesis usando métodos baseados em software semi-automatizados.
- Usando o software, defina o modo de análise de placa para "24 Bem" e alinhar círculos em torno de tele perímetro exterior dos poços digitalizados. Ajuste o canal de normalização para "800" e exportar as intensidades totais e relativas de fluorescência para a 700 nm (MBP) e 800 nm canais (Olig2 / actina).
- Dividir a intensidade a 700 nm, por a intensidade a 800 nm para dar a expressão de MBP normalizada em unidades de fluorescência relativa. Calcule a média de medições repetidas e dimensionar a expressão para o Dia 0 controles + PDGF conforme necessário para a análise.
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Representative Results
OPCs A2B5-positivas são isoladas através de selecção celular positiva usando um sistema de separação coluna magnética. Antes do procedimento de isolamento, o cérebro inteiro é removido filhotes de ratos que estão entre P5 e P7. Uma vez que todo o cérebro é separado com sucesso a partir do crânio, as lâmpadas olfactivo e no cerebelo são removidos com pinças cirúrgicas finas (Figura 1A). A fim de isolar o tecido cortical cerebral do hipotálamo, tálamo e mesencéfalo são excisados por dissecação cuidadosa (Figura 1B). Em seguida, o hipocampo e corpo estriado são removidos com pinças cirúrgicas dobrado (Figura 1C - D). O processo de isolamento eficiente elimina as células das meninges e fibroblastos, mas digestão enzimática é melhorada quando meninges e vasculatura são removidos (Figura 1E). Finalmente, os blocos de tecido de 1 mM x 1 mm, são preparadas para os passos subsequentes de dissociação de tecidos (Fig1F URE).
Um bom isolamento OPC deve resultar numa pelete de células compacto após o passo de centrifugação final (Figura 2A). Uma vez que estas culturas plaqueadas estará relativamente livre de detritos celulares quando visto sob um microscópio (Figura 2B). Um isolamento subóptima pode resultar numa pelete grandes e macias devido à presença de grandes quantidades de resíduos celulares. Essas partículas vão aderir fortemente ao vaso de PLL-revestido e pode interferir com a cultura (Figura 2C). Se uma pastilha de grandes e macias materializa, ele pode ajudar a voltar a suspender as células em 10 ml de PBS e repetir a centrifugação final durante 10 min a <300 x g. Uma vez que o isolamento é completa, a pureza das culturas pode ser avaliada por citometria de fluxo para identificar a percentagem de células A2B5-positiva. Um isolamento com sucesso deve resultar em uma associação de células que são> 95% positiva para A2B5 (Figura 2D - F). Em comparação com células coradas com um anticorpo anti-A2B5 conjugado com corante fluorescente, as células não coradas deve aparecer como uma população negativa e pode ser usado como uma referência de base para gating. Além disso, temos mostrado anteriormente que a seleção de OPCs usando os rendimentos de antígenos A2B5 culturas que se coram positivo para PDGFRα por imunocitoquímica 11.
Como demonstrado por imunocitoquímica, OPCs no início do tratamento (Dia 0) são Olig2 + / MBP - enquanto que as células são Olig2 + / + MBP por Dia 4 (Figura 3). A confluência óptima dos OPCs e oligodendrócitos no Dia 0 e Dia 4 são mostrados nas imagens de campo claro representativos (Figura 4A). A ausência de expressão MBP no Dia 0 serve como uma base para quantificar oligodendrogenesis. diferenciação espontânea como um resultado da retirada de PDGF-AA serve como um controlo negativo, enquanto 45 nM de hormona da tiróide (triiodothyronine; T3) pode ser usado como um controlo positivo 11,15. A quetiapina, também conhecido como Seroquel, e clemastina, também conhecido como Tavist, são as drogas que têm sido mostrados para acelerar in vitro oligodendrogenesis e podem ser utilizadas como controlos positivos adicionais 16,17 aprovado pela FDA. A Figura 4B mostra um representante de dois canais de infravermelhos varrimento fluorescente demonstrando os resultados esperados para cada uma destas condições em triplicado. sinais de actina e MBP foram pseudocolored verde e vermelho, respectivamente, de modo que as culturas altamente diferenciados aparecem amarelo em imagens fundidas. Os resultados mostram que a expressão de MBP no dia 4 na condição de retirada de PDGF foi de 4,5 ± 1,4 vezes mais elevada em comparação com o Dia 0, ao passo que as alterações de dobragem em MBP devido ao tratamento com a hormona de tiróide, quetiapina, e clemastina foi de 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 , e 32,8 ± 0,5, respectivamente (Figura 4C). A robustez e precisão do ensaio são demonstradas pela SMtodos os desvios padrão entre as amostras em triplicado e a janela de activação de tratamento de grandes dimensões que é cerca de 20 desvios-padrão acima do controlo retirada de PDGF.
Enquanto Actina serve como um gene de referência fiável para normalização em culturas de oligodendrócitos, genes de referência alternativos também podem ser usados. Olig2 é um factor de transcrição nuclear que é constitutivamente expressa em células da linhagem de oligodendrócitos. O seu padrão de expressão específico e constitutiva, portanto, pode proporcionar uma estratégia de normalização mais preferível, em situações de cultura heterogéneos. A Figura 5 mostra que em culturas OPC diferenciadas com 10 da hormona da tiróide nM, a mudança de dobragem calculado em MBP expressão relativa a retirada de PDGF é a mesma quando se usa qualquer Olig2 ou Actin durante a normalização. Presumivelmente, uma vez que as culturas OPC nesta experiência foram muito pura, ambas as proteínas podem ser eficazmente utilizados para a normalização. No entanto, nós often observar uma pequena população de células Olig2-negativo em Dia 4, mas a proporção dessa população à população Olig2-positivo não parecem diferir significativamente entre a retirada PDGF e o grupo T3 tratada. Assim, a dobra-mudanças não são afetados. Dado um cenário em que um tratamento pode causar a proliferação de tipos de células Olig2-negativo, a escolha do anticorpo de normalização deve ser cuidadosamente considerada.
Figura 1:.. Rat procedimento de dissecção cérebro descrição passo a passo do procedimento de dissecção Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A citometria de fluxo análise do isoladoOPCs. (A) após a purificação em coluna magnética, a população de células é ligado mergulhou para fora da coluna e centrifugadas para formar um sedimento compacto. A quantidade de detritos está indicado pelo tamanho do sedimento. (B) se o sedimento compacto é, em seguida, os detritos serão mínimas na cultura. (C) Um sedimento grandes e macias normalmente resulta em uma cultura com detritos pesados. A pureza da cultura é determinada por citometria de fluxo utilizando um anticorpo A2B5 anti-ratinho de rato que é conjugado com APC. (D) As células mortas e detritos são excluídos da análise, como mostrado na dispersão e dispersão lateral parcelas para a frente. (E) A população positiva A2B5 pode ser determinada utilizando um amostrado não coradas como uma referência de base para gating. (F) isolados com sucesso OPCs deve ser> 95% positivo para A2B5. Por favor clique aqui para viewa versão maior desta figura.
Figura 3:. Cultura OPC e procedimento de diferenciação A fluorescência de varredura de ensaio dual-infravermelho (DIFS) começa com OPCs ratos isolatedA2B5 positivo recém semeadas em recipientes de cultura de PLL-revestidos (dia 3). Estas culturas são proliferaram durante 3 dias na presença de 20 ml de PDGF-AA / ng, e depois tratou-se com factores experimentais em meios de PDGF-livre fresco no dia 0. O tratamento mídia está totalmente reabastecido no dia 2, e as células são fixadas com paraformaldeído a 4% no dia 4. a imunocitoquímica para Olig2 (verde) e MBP (vermelho) foi realizada em culturas representativas no Dia 0 e Dia 4, utilizando DAPI (azul) como corante nuclear contador. Estas culturas exibem coloração constitutiva para a panela de oligodendrócitos linhagem marcador de células Olig2 nos dias 0 e 4, enquanto que a coloração para o marcador de oligodendrócitos madura MBP só é evident por dia 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação de MBP utilizando o ensaio de dupla fluorescência no infravermelho de varrimento (DIFS) (A) A densidade de culturas OPC no Dia 0 e Dia 4 necessária para um desempenho óptimo ensaio.. (B) representativos scans de fluorescência dual-infravermelhos. OPCs foram diferenciadas em placas de 24 poços, durante 4 dias na presença de 45 nM de T3, 1 uM de quetiapina, 1 uM de clemastina, ou 0,1% DMSO, em triplicado. Uma placa separada contendo OPCs que foram fixadas no dia 0 (+ PDGF) foi processada em paralelo. Actina (verde pseudocolored) e MBP (pseudocolored vermelho) foram simultaneamente quantificado utilizando um scanner Odyssey Licor definido para detectar 700 nm e 800 nm emissões. (
Figura 5: Olig2 é uma proteína de referência fiáveis para normalizar expressão de MBP em oligodendrócitos OPCs foram diferenciadas em triplicado na presença de 10 nM de T3 ou 0,1% de controlo de veículo de DMSO em placas de 24 poços, durante 4 dias.. O ensaio de fluorescência de varrimento de infravermelho dupla foi realizada utilizando anticorpos anti-Olig2 ou anticorpos primários anti-actina para normalização. Olig2 / Actina e PAM foram simultaneamente quantificado utilizando um scanner Odyssey Licor definido para detectar a 700 nm e 800 nm emissões. expressão MBP houvermalized a qualquer Olig2 ou expressão de actina, e os resultados foram dimensionadas para o controlo de DMSO de 0,1%. As unidades de fluorescência relativa média ± desvio padrão foram representadas usando o programa GraphPad Prism 6. Os resultados mostram que a calculada dobra-a mudança é o mesmo quando a normalização para qualquer uma das duas proteínas de referência.
Figura 6:. Efeito do Triton X-100 na coloração de MBP OPCs foram diferenciadas em placas de 24 poços, durante 4 dias na presença de 45 nM de T3 ou 0,1% de DMSO. As culturas foram então fixadas com PFA a 4% e coradas para MBP Olig2 e imunocitoquímica utilizando dois protocolos diferentes. Para o elevado número de amostras de Triton X-100, as células foram permeabilizadas durante 1 hora com 0,4% de Triton X -100 e todos os passos de incubação de anticorpo foram realizadas na presença de 0,1% de Triton X-100. Para a amostra de baixo Triton X-100, as células foram permeabilizadas durante 1 hora com 0,1% de Triton X-100, enquanto Antibody incubações foram realizadas sem Triton X-100. Olig2 e MBP foram visualizados com secundários e imagens conjugado com corante fluorescente foram adquiridos utilizando um microscópio de fluorescência baseada em câmera. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado descreve um método rápido e fiável para o isolamento e quantificação de rato OPCs no oligodendrogenesis vitro em resposta a factores experimentais. Usando selecção positiva, altos rendimentos de OPCs viáveis e puros são usados diretamente para fins experimentais. Este método simplifica o isolamento, cultivo, e passos de diferenciação em um quadro de tempo de 1 semana, e as células fixas pode ser convenientemente armazenada a 4 ° C, durante várias semanas, sem qualquer perda de sensibilidade do ensaio.
Uma grande vantagem com ensaios de fluorescência baseada em Scanner é que a aquisição e análise de dados é grandemente acelerada contra técnicas tradicionais de microscopia baseado em câmera. Embora a microscopia foi usado com sucesso em telas de alto rendimento para identificar indutores da diferenciação OPC, a aquisição de dados é inerentemente mais lento, porque exige programação de sequências de captura de imagem, de várias horas de recolha de dados, análise de centenas a thousands de arquivos de imagem e algoritmos definidos pelo usuário para distinguir corpos celulares individuais para a normalização ou a análise 18,19. Além disso, com sistemas de microscopia à base da câmara, não é viável para adquirir dados a partir de toda a superfície do recipiente de cultura. Em vez disso, imagens representativas devem ser capturados a partir de diferentes áreas dentro de um único poço, que podem levar ao viés de posição e visitas de falso-positivos. Por comparação, este ensaio detecta a expressão de MBP a partir de todas as células dentro de um bem determinado, e várias placas podem ser digitalizados simultaneamente. Enquanto este método pode ser adaptado para uso em 96 poços ou de 384 poços formatos, a placa de 24 poços pode ser preferido quando menos tratamentos estão a ser testados. Observou-se que a perda de células na placa de 24 poços devido ao manuseamento de líquidos é minimizado, o que é uma complicação que deve ser considerado ao conceber experiências de maior rendimento.
Um parâmetro crítico do ensaio é a densidade das células quando diferenciaramção é iniciada no dia 0. As culturas com muito poucas células aparecem para diferenciar mais lentamente e morrem, enquanto as culturas de alta densidade apresentam diferenciação espontânea. Ambas as situações podem reduzir a gama dinâmica e a fiabilidade do ensaio. Para alcançar um equilíbrio óptimo entre a saúde celular e densidade das células, que a cultura dos OPCs para 3 dias sem uma troca de mídia ou suplementação de fresco PDGF-AA. Colocámos a hipótese de que uma vez que a concentração de PDGF-AA nas quedas dos suportes por Dia 3 in vitro (Dia 0), como resultado do catabolismo celular, a taxa de proliferação das células irá diminuir tal que a proliferação é reduzida através do primeiro dia de PDGF- retirada AA. Esta técnica funciona melhor quando as células são distribuídos uniformemente durante o chapeamento. Pipetar as células ao longo do lado do bem e misturá-los usando um movimento figura oito deve promover uma distribuição uniforme. Pipetando para o centro do poço tende a produzir agregados de células em torno das bordas do poço com poucoscélulas er que aderiram ao centro. Este fenómeno pode ser devido ao rompimento da camada de PLL seco de fresco por forças de pipetagem líquidos. A acumulação de células em torno do perímetro pode reduzir a sensibilidade do ensaio devido a diferenciação dependente da densidade. É importante notar que as diferenças significativas na intensidade do sinal / Olig2 actina pode ocorrer entre tratamento com a droga e de controlo, PDGF culturas de abstinência. Diminuiu significativamente sinal de actina / Olig2 pode indicar toxicidade da droga, ao passo que significativamente aumentada sinal / Olig2 actina pode indicar a proliferação induzida por drogas. Nós normalmente observar um sinal de actina / Olig2 ligeiramente mais elevado a partir de células tratadas com fármacos pró-diferenciação em comparação com os controlos de retirada de PDGF. Atribuímos essa diferença a uma maior taxa de apoptose espontânea no grupo retirada PDGF sobre o processo de diferenciação de 4 dias. Ao avaliar oligodendrogenesis, normalização da MBP para actina / Olig2 deve corrigir as diferenças número de células. Para avaliar toxicidade e proliferação utilizando este ensaio, o anticorpo anti-MBP pode ser trocado por anticorpos primários dirigidos contra os marcadores apropriados.
Quando as experiências requerem tanto a avaliação qualitativa e quantitativa, é importante limitar a exposição das culturas de oligodendrócitos de rato imobilizado em Triton X-100 ao utilizar PFA a 4% para fixar as células. Outros protocolos de imunocitoquímica de culturas de oligodendrócitos, que tipicamente incluem Triton X-100 durante ambos os passos de incubação de anticorpo para melhorar a acessibilidade epitopo de anticorpo, podem ser utilizados com sucesso em função das necessidades experimentais. Por outro lado, embora a MBP é uma proteína intracelular, pode ser possível contar com Triton X-100 se inteiramente métodos de fixação alternativos que são utilizados adequadamente permeabilizar as células. Usando as condições descritas aqui, observou-se que o Triton X-100 afecta a morfologia observada dos oligodendrócitos, bem como a localização de coloração de MBPquando utilizado em altas concentrações. Nós não vemos um declínio significativo na coloração de anticorpos quando Triton X-100 é omitido as etapas anticorpo incubação. Como mostrado na Figura 6, incluindo a 0,4% de Triton X-100 na permeabilização e passo de bloqueio, e 0,1% de Triton X-100 durante a incubação do anticorpo, reduz a detecção de processos de mielina e resulta em coloração de MBP descontínua. Portanto, para a avaliação quantitativa e qualitativa, pode ser suficiente utilizar uma menor concentração de Triton X-100, como descrito aqui.
Enquanto o uso de OPCs seleccionada-A2B5 de ratos pode ser vantajoso, observou-se resultados comparáveis no ensaio duplo-infravermelha fluorescência de varrimento (DIFS) usando OPCs seleccionada-A2B5 de ratinhos C57BL / 6, embora o rendimento de células por ratinho é tipicamente muito mais mais baixos (dados não mostrados). Outros protocolos para a purificação OPC pode também ser compatível com este ensaio. Por exemplo, oligodendrócitos O4 marcador pode ser utilizada como um antigénio para purificar intprecursores fase ermediate oligodendrócitos usando esferas magnéticas 20. Como uma alternativa aos métodos magnéticos à base, OPCs pode ser enriquecida a partir de 9 dia culturas gliais mistas antigos contendo astrócitos e microglia pela velocidade oi agitação orbital e de adesão diferencial métodos 21. Além disso, imuno-panning procedimentos que incorporam tanto a selecção celular negativa e positiva pode ser utilizado se a pureza da cultura é preferido sobre os rendimentos celulares elevadas 22. Além de examinar a forma como as terapias podem melhorar diretamente a diferenciação de OPCs em culturas puras, às vezes é necessário considerar os efeitos indiretos das drogas através de outros tipos de células em um sistema de co-cultura. Na EM, a infiltração de células T efectoras auto-reactivas para o SNC é pensada para desempenhar um papel na progressão da doença 23. células T efectoras podem secretar factores pró-inflamatórias que podem inibir a diferenciação de OPCs em locais de desmielinização. É, portanto, de interesse para identificar Therapeutics que podem proteger os OPCs e bloquear esses fatores pró-inflamatórios de exacerbar lesão. O ensaio pode ser DIFS ideal para modelar esta actividade, como as células T a crescer em suspensão e pode ser lavada a partir da cultura de oligodendrócitos antes da quantificação MBP. Para estudos de co-cultura com células aderentes, tais como os neurónios, astrócitos, microglia e, Olig2 normalização podem ser empregues para recolher dados a partir dos oligodendrócitos especificamente. Assim, a flexibilidade do ensaio DIFS pode facilitar uma variedade de modelos experimentais.
Em conclusão, este protocolo fornece um método rápido e confiável para quantificar o oligodendrogenesis de OPCs rato A2B5-positivos in vitro. Este método de isolamento oferece consistentemente altos rendimentos de OPCs viáveis que respondam aos sinais de diferenciação estabelecidos. análise de sensibilidade pode ser realizado em vasos de formato de multi-poços utilizando uma variedade de paradigmas experimentais, que se estende a utilidade deste sistema para many diferentes aplicações. Além disso, o ensaio de DIFS pode ser adaptado para o rastreio de fármacos de alto rendimento, ou podem ser utilizados para verificar os resultados de ensaios de baixa taxa de transferência, tais como PCR quantitativa e Western blot. Importante, este sistema pode oferecer um meio simples mas eficaz para a identificação de terapias específicas OPC em doenças desmielinizantes tais como esclerose múltipla.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Grant patrocinador: Institutos Nacionais de Saúde; número de concessão: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
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