Introduction
conducción nerviosa eficiente en el sistema nervioso central de los mamíferos (CNS) requiere la mielinización de los axones por oligodendrocitos. Durante el desarrollo, surgen los oligodendrocitos a partir de un conjunto de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que se cree que la migración de las zonas ventriculares del cerebro anterior en desarrollo y el tubo neural 1. Después de los OPC de migración se diferencian en oligodendrocitos maduros, myelinating que no sólo facilitar la propagación del impulso eficiente, sino que también proporcionan los axones con soporte trófico 2. El sistema nervioso central adulto mantiene una abundante población de los OPC que están dispersos en toda la sustancia gris y blanco que comprende aproximadamente el 5-8% de todas las células 3. Luego de una lesión desmielinizante, los OPC migran al sitio de la lesión, proliferan y se diferencian para sustituir a las vainas de mielina perdidos o dañados en los axones expuestos. Sin embargo, en algunos lugares la enfermedad / lesión, este proceso se encuentra para ser ineficaz o puede fallar por completo 4. Mientrasdesmielinización crónica se cree que añadir a la carga de morbilidad, la remielinización oligodendrogenesis y eficiente puede aliviar los síntomas 5. Por ello, ha sido de interés para estudiar los OPC in vitro para determinar el efecto de los factores experimentales sobre oligodendrogenesis.
La comprensión de las diferentes fases de la diferenciación de oligodendrocitos ha sido posible gracias a la identificación de marcadores específicos de células de la etapa. Auto-renovación de células progenitoras tempranas se definen por su expresión de alfa derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento (PDGFR), el antígeno neuronal / glía 2 (NG2) y A2B5 6 - 8. Como OPCs inician su programa de diferenciación y se retiran del ciclo celular, que regulan negativamente la expresión de estos marcadores y comienzan a expresar proteínas indicativas de premielinizantes oligodendrocitos incluyendo cíclico de nucleótidos 3'-fosfodiesterasa (CNPase) y O4. Por último, su diferenciación en oligodendroc más maduroytes se caracteriza por la expresión de proteínas asociados a la mielina, incluyendo la glicoproteína asociada a la mielina (MAG), proteína proteolipídica (PLP), y la proteína básica de la mielina (MBP). MBP es una proteína de membrana periférica intracelular y un componente principal de la vaina de mielina. Los ratones que carecen MBP desarrollan un fenotipo grave en el que la mielinización del SNC está disminuida significativamente dando lugar a temblores, convulsiones y muerte temprana 9,10. Este importante papel de la MBP en la mielinización ha llevado a su uso como un marcador de la diferenciación de oligodendrocitos in vitro e in vivo 11.
La cuantificación de MBP se puede lograr usando varias metodologías diferentes. RT-PCR y análisis de transferencia Western permiten la cuantificación de los niveles de MBP bajo diferentes regímenes de tratamiento. La inmunocitoquímica es un enfoque cualitativo común que también puede ser cuantitativa cuando se usan enfoques de microscopía basados en cámaras. Aunque estos sistemas son fiables y fundamental parael estudio de la diferenciación de oligodendrocitos, cada uno de ellos tiene sus propias desventajas que limitan su uso en la detección de drogas. En primer lugar, la cantidad de OPCs principales que se necesitan para RT-PCR y análisis de transferencia Western reduce el número de variables que se pueden examinar simultáneamente. Mientras que el requisito para inmunocitoquímica de células es mucho más bajo, un tiempo considerable se debe dedicar a cada experimento si la cuantificación es la meta. Numerosas imágenes deben ser capturados y luego cuantificados para facilitar el análisis experimental. Estas advertencias se convierten en obstáculos importantes a tener en cuenta para los estudios que requieren una evaluación de alto rendimiento. Aquí se describe un método que utiliza aspectos fundamentales tanto de la inmunocitoquímica y metodologías de Western blot para la cuantificación de la mielina, mientras que reduce significativamente tanto el número de células requeridas y el tiempo para completar el análisis cuantitativo.
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Protocol
Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) y Johns Hopkins School of Medicine.
1. Preparación de placas de ensayo, solución madre, y OPC base para medios
Nota: La base de rata (OPC) Sato medios descritos aquí viene de los estudios previamente publicados 12,13. formulaciones de medios alternativos también pueden ser compatibles con este procedimiento.
- Resuspender poli-L-lisina (PLL) a una concentración de 10 mg / ml en agua desionizada estéril. Pipetear 400 l de la PLL diluido en cada pocillo de un 24 pocillos de fondo en el tejido plato negro de paredes, claro gradiente de cultivo.
- placas de cultivo de tejidos de la capa durante 2 horas en una incubadora de 37 ° C o cultivo de tejidos durante la noche en un refrigerador de 4 ° C.
- Aspirar PLL de platos recubiertos al menos 20 min antes de chapado. Permitir que el PLL restante se seque del pozo mediante la colocación de placas de 24 pocillos con la tapa parcialmente abierta en un cultivo de tejidocapucha. Compruebe que los pozos estén completamente secas antes de chapado OPC aisladas. Las células no se adhieren al plástico que tiene líquido PLL presente.
- Preparar N-acetil-L-cisteína (NAC) solución madre (1,000x): Disolver 100 mg de N-acetil-L-cisteína (NAC) en 20 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Alícuota y almacenar a -20 ° C.
- Preparar la solución madre de hidrocortisona (1,000x): Añadir 1 ml de etanol a 1 mg de hidrocortisona y agitar para disolver. Añadir 19 ml de DMEM, mezclar la solución, alícuota y se almacena a -20 ° C. La adición de hidrocortisona a los medios de base se ha mostrado para mejorar la supervivencia de las células gliales 14.
- Preparar d-biotina solución madre (5.000x): Disolver 2,5 mg de d-biotina en 50 ml de PBS. Añadir 1-2 x 5 gotas mu l de NaOH 0,1 N para ayudar a la disolución. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
- Preparar la solución madre de insulina (100x): Disolver 25 mg de insulina en 50 ml de agua de calidad para el cultivo de tejidos. Añadir 250 l Of 1 N de HCl y se mezcla hasta que la solución es clara. Esterilizar con un filtro de 0,22 micras y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 semanas.
- Preparar Sato solución madre (100x):
- Preparar la solución de progesterona de valores (25 g / l): Se disuelven 2,5 mg de progesterona en 100 l de etanol.
- Preparar una solución de sodio selenito de valores (400 ng / l): Disolver selenita de sodio 4 mg en 100 l de NaOH 0,1 N. Añadir 10 ml de DMEM y mezclar.
- A 100 ml de DMEM, añadir 1 g de humano de la apo-transferrina, 1 g de albúmina de suero bovino, y 160 mg de putrescina y mezclar para disolver completamente. Añadir 25 l de solución de stock de progesterona, 1.000 l de solución de selenita de sodio de valores, y mezclar. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
- Preparar OPC Medios Base: por 100 ml de DMEM (con 4,5 g / L de D-glucosa, L-glutamina, y 110 mg / L piruvato de sodio), añadir 100 l NAC, 100 hidrocortisona l, 20 l d-biotina, 1 ml insulina, 1 ml Sato acción, 100 l oligoelementos B,2 ml B-27 suplemento (50x), y 1 ml de penicilina / estreptomicina (100x). Esterilizar con un filtro de 0,22 micras y almacenar a 4 ° C.
- Preparar PDGF-AA solución madre (1,000x): Disolver 250 g en 12,5 ml de PBS con 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) para hacer una solución 20 mg / ml. Alícuota y almacenar a -80 ° C.
- Preparar medios proliferación OPC: OPC medios de base suplementado con 20 ng / ml de PDGF-AA.
- Preparar medio de diferenciación OPC: OPC medios de base suplementado con 45 nM de triyodotironina.
- Preparar la columna Buffer: Para 500 ml de PBS, añadir 2,5 g de BSA y 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético 0,5 M (EDTA) y ajustar el pH a 7,2. Esterilizar con un filtro de 0,22 micras y almacenar a 4 ° C.
2. cerebro de rata La disección
Nota: Las crías de rata P5-P7 se usan en este protocolo. Cada corteza cría de rata rinde aproximadamente 1,5-2,0 x 10 6 células positivas A2B5.
- Esterilizar todo el equipo de disección usando un 2506; C grano climatizada esterilizador.
- Añadir 15-20 ml de PBS (sin Ca 2 + y Mg2 +) para tubos de 50 ml cónicos. Un 50 ml tubo cónico es suficiente para 3-4 cortezas de las crías de rata. Introducir 50 ml tubos cónicos en hielo. Utilice tubos de 50 ml cónicos para sostener tejido de la corteza en dados durante la disección.
- Añadir PBS frío a una placa de Petri de 10 cm. Este plato se utilizará para la disección en el microscopio de luz.
- Sacrificar las crías de ratas por decapitación con grandes tijeras quirúrgicas. Cabeza de pulverización con etanol al 70%.
- Se extrae el cerebro entero
- Utilizando pequeñas tijeras cortan la piel hacia abajo de la línea media y detrás de las orejas y los colgajos de piel de cáscara de espalda. Cortar el cráneo por la línea media a partir del tronco cerebral y terminando en los ojos. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente con el fin de preservar la estructura de la corteza subyacente.
- Hacer dos cortes laterales inferiores al cerebelo mediante la inserción de pequeñas tijeras quirúrgicas en el foramen magnum. Haga un corte adicional entre los ojos, la hormigaerior a los bulbos olfatorios.
- Retire con cuidado cada mitad del cráneo hacia atrás. Retire todo el cerebro y en el lugar 10 cm placa de Petri llena de PBS frío.
- Bajo el microscopio de luz disección, quitar los bulbos olfatorios y el cerebelo con pinzas quirúrgicas finas.
- Da la vuelta al cerebro de manera que la superficie ventral es visible bajo el microscopio óptico.
- Utilizando unas pinzas rectas finas realizan una disección roma mediante la colocación de puntas de las pinzas cerradas entre la corteza y el hipotálamo a una profundidad de 2/3 del cerebro. Una vez que los fórceps están en su lugar permitir que los extremos se abran. Repita para el otro hemisferio.
- Se burlan de la corteza del hipotálamo y regiones del cerebro medio.
- Retire el hipotálamo, tálamo, mesencéfalo y sosteniendo el cerebro medio en su superficie posterior y pelado hacia el extremo anterior del cerebro. Cortar las conexiones anteriores.
- Retire el hipocampo por despegando hacia afuera y luego cortar su conexión con elcórtex utilizando pinzas de disección finas dobladas.
- Retire el cuerpo estriado restante por el desguace de la corteza subyacente en un movimiento hacia afuera en diagonal con unas pinzas de disección finas dobladas.
- Borre los vasos sanguíneos y las meninges de la superficie ventral de la corteza.
- Da la vuelta al cerebro de manera que la superficie dorsal es visible. Meninges y los vasos sanguíneos deben ser evidentes. Pelar las meninges de la corteza subyacente utilizando pinza de disección finas. Iniciar la peladura de la posición de unión bulbo olfatorio.
- Complete los pasos 2.4 a 2.14 para un total de 3-4 crías de rata.
- Coloque 3-4 disecados cortezas cría de rata en una placa Petri seco y cortar con una cuchilla de afeitar esterilizada hasta que se alcancen 1 mm x 1 mm trozos. Recoger el tejido de un enjuague con PBS plato de un tubo cónico de 50 ml (paso 2) a continuación, colocar de nuevo en hielo.
3. enzimática y disociación mecánica Tissue
Nota: Para este paso, se recomienda un kit de disociación neuronal basada en la papaína. con NeKit de disociación ural (P), se describen los pasos especiales que son óptimas para el aislamiento OPC.
- Preparar la primera enzima de disociación mediante la dilución de la enzima P con el tampón apropiado. El contenido de cada cónica 50 ml (1 muestra) se resuspendieron con un total de 1.950 l de mezcla de enzimas. Lugar en la mezcla de enzimas en un baño María a 37 ° C durante 10 minutos.
1 muestra: 1.900 l de tampón + 50 l de la enzima papaína - Girar todos los tubos de 50 ml cónicos que contengan cortezas 3-4 crías de rata en cubitos a 300 xg durante 3 min.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 1.950 l de solución de enzima a cada tubo de muestra y separar el sedimento invirtiendo el tubo y agitando suavemente.
- Incubar en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos de 15 min con rotación del tubo continuo.
- Durante los últimos 5 minutos de la incubación, preparar la segunda mezcla de enzimas A. Diluir la enzima en su tampón apropiado. Se añadirá un total de 30 la cada tubo de muestra cónico de 50 ml.
1 Muestra: 20 l de tampón + 10 l de enzima - Una vez se completa la incubación añadir 30 l de la segunda mezcla de enzima a cada tubo y se invierte para mezclar.
- Usando una pipeta Pasteur de vidrio unido a un controlador de pipeta, disociar mecánicamente el tejido pipeteando 10-15 veces o hasta que las piezas de tejido se reducen de tamaño y la solución se ha convertido en nublado. De nuevo la muestra a la 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 15 minutos con rotación continua.
- Pipetear cada muestra de tejido homogeneizado 10-15 veces usando una pipeta de 1 ml.
- Pipetear cada muestra de tejido homogeneizado 15-20 veces usando una pipeta de 200 l
- Volver todas las muestras a la 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 10 minutos con rotación continua.
- Añadir 10 ml de PBS (con Ca y Mg 2+ 2 +) a cada muestra y filtrar el homogeneizado a través de un filtro de 40 micras de poro se coloca sobre un 50 ml tubo. Enjuague el filtro con un adicional de 1-2 ml de PBS.
- Piscina todo de las muestras de homogeneizado en un tubo cónico de 50 ml y adquirir un recuento de células en general.
- Después de realizar el recuento de células, dividir el homogeneizado uniformemente en tubos de 15 ml cónicos (1 tubo para cada muestra). Centrifugar durante 10-12 min a 300 x g.
4. Anti-A2B5 Aplicación del grano, la purificación en columna, y Chapado
- Realizar cálculos de tampón de columna y microperlas anti-A2B5. Añadir 7 l Tampón de Columna células por cada 1 x 10 6. Añadir 2 l microperlas anti-A2B5 células por cada 1 x 10 6.
- Combinar todas las muestras resuspendiendo las células en un volumen total de 10 ml de tampón de columna y centrifugar a 300 xg durante 10 a 12 min.
- Resuspender el sedimento celular en la cantidad apropiada de tampón de columna tal como se calcula en el paso 4.1. Si la pastilla es grande y suelto, solamente añadir aproximadamente la mitad del volumen de tampón de columna para mantener la lucha contracuerpo a la concentración apropiada en la resuspensión celular.
- Incubar la suspensión de células durante 10 min a 4 ° C.
- Añadir microperlas anti-A2B5 (calculado en el paso 4.1), invertir varias veces y se incuba a 4 ° C durante 30-60 min. Invertir suavemente el tubo varias veces cada 10 min. tiempos de incubación más largos pueden aumentar los rendimientos celulares pero pueden aumentar la unión no específica.
- Añadir 5 volúmenes de tampón de columna. Si las células se resuspenden en un volumen de 1 ml, añadir 5 ml de tampón de columna, mientras que si las células se resuspendieron en 2 ml, añadir 10 ml de tampón de columna.
- Centrifugar durante 10 min a 300 x g.
- Determinar el número de columnas LS será necesario para la purificación. Una columna LS es suficiente para 15-20 x 10 6 células totales.
- Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de tampón de columna por columna LS que se utiliza.
- Primer cada columna LS mediante la adición de 5 ml de tampón de columna. Recoger el flujo a través de un tubo cónico de 50 ml. Una vez que los bu columnaffer ha pasado completamente a través de la cámara superior, aplicar 1.000 l de la suspensión celular a cada columna y permitir que las células se ejecutan a través de por la gravedad.
Nota: Si la densidad de células es demasiado alta, la columna puede funcionar lento. - Inmediatamente después de la suspensión de células se ha pasado a través de la columna, añadir lentamente 3 ml de tampón de columna para cada columna para lavar las células no unidas. Si el lavado se ejecuta con facilidad a través de la columna (1 gota por cada 30-45 segundos), se lava dos veces más con 3 ml de tampón de columna.
- Retire cada columna y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 5 ml de tampón de columna y hundir el tampón a través de la columna a una velocidad rápida mediante el émbolo de plástico que se empaqueta con la columna. Hundimiento será desalojar las células unidas liberándolos de la columna.
- Aumentar la pureza mediante la ejecución de la muestra a través de una segunda ronda de LS columnas. Utilice un tercio del número de columnas que se utilizan durante la primera pasada. Primer las columnas con 5 ml de tampón de columna.Dejar que el tampón de la columna pase a través de la cámara superior.
- Dado que el volumen de suspensión celular será mucho mayor, aplicar uniformemente 1.000 l de suspensión celular a cada columna y permitir que la suspensión pase a través de la cámara superior de la columna antes de la reposición con un 1.000 l adicionales.
- Una vez que la suspensión celular ha sido completamente aplicado a la segunda ronda de columnas, se lava 2-3 veces con 3 ml de tampón de columna.
- Retire cada columna y se coloca sobre un tubo cónico estéril de 15 ml. Añadir 5 ml de tampón de columna y hundir el tampón utilizando el émbolo de plástico que se empaqueta con la columna. Hundimiento será desalojar las células unidas liberándolos de la columna.
- Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 12 a 15 min. El sedimento debería aparecer compacto.
- Resuspender el sedimento celular en 5 a 10 ml de medio de proliferación OPC pre-calentado (medios de comunicación de base OPC suplementado con PDGF-AA 20 ng / ml).
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Placa de las células. Diluir las células a 60.000 células / ml con medios proliferación OPC. En cada negro, fondo claro de 24 pocillos, de pipeta 500 l de células a lo largo del lado del pozo para obtener 30.000 células por pocillo. Mezclar las células agitando la placa horizontalmente usando una figura de ocho movimientos. Si la realización del ensayo en 48, 96, o 384 pocillos, añadir 15.000, 7.500, o 1.500 células por pocillo, respectivamente. Estos números se pueden ajustar dependiendo de las especificaciones de la placa individuales.
- Preparar una placa separada para el día 0 cultivos de control de línea de base. Esta placa de control debe ser fijado con paraformaldehído al 4% como se describe en la sección 5.7, cuando la diferenciación se inicia el día 0.
- Cultivar las células en medios de proliferación OPC a 37 ° C durante 3 días sin cambio de medio.
5. La inducción de la diferenciación OPC y fijación con 4% de paraformaldehído
Nota: Cuando se prueba el efecto de las moléculas pequeñas en oligodendrogenesis, de manera rutinaria dissolve fármacos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para preparar stocks 1,000x que luego pueden ser almacenadas a -80 ° C y se diluye directamente en los medios de comunicación SATO para obtener una concentración final de 0,1% DMSO. Hemos observado ningún cambio en cualquiera de proliferación o diferenciación OPC usando esta concentración de DMSO (datos no mostrados).
- Pre-calentar el medio de base de OPC a 37 ° C y descongelar las existencias de tratamiento de drogas a temperatura ambiente. Cuando la realización de tratamientos por duplicado, preparar aproximadamente 1,25 ml de medio por grupo de tratamiento en un tubo de 1,5 ml. Para muestras por triplicado, utilizar 2 tubos de centrífuga ml de capacidad para dar cuenta de holgura.
- Preparar las mezclas de reacción de tratamiento para los pocillos replicados mediante la dilución de las existencias de tratamiento directamente en los medios de comunicación de base OPC. vórtice brevemente o mezclar suavemente cada mezcla maestra para asegurar la distribución homogénea del tratamiento.
- Preparar 45 nM de triyodotironina (T 3) como el control positivo y el vehículo apropiado como control negativo. Diluir T 10 mM 3 stock1: 1000 en 1 ml de medio de base de OPC y luego se diluye adicionalmente en la mezcla maestra tratamiento para reducir la concentración final de DMSO si fuera necesario.
- Aspirar los medios de comunicación del grupo de un tratamiento pocillos de cultivo a la vez a fin de evitar el secado de las células. Utilice una punta de pipeta de 200 l en el extremo de la pipeta Pasteur de vidrio para evitar el raspado de material de negro de las paredes del pozo y en la cultura.
- Añadir lentamente 500 l de mezcla maestra de tratamiento a lo largo del lado del pozo utilizando una pipeta de 1 ml.
- Se incuban los cultivos durante el período de tiempo deseado, realizando un intercambio de medios completa con medios de tratamiento frescos cada 2-3 días. Nosotros habitualmente observamos un 30-40% MBP + después de 4 días de cultivo en medio de diferenciación.
- Al final del período de tratamiento deseado, preparar fresco 4% de paraformaldehído (PFA) o descongelar una madre congelada a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: PFA es extremadamente tóxico y debe ser preparado en una campana de humos.
- Aspirar los medios de comunicación y se añade lentamente 4001; l de PFA al lado del pozo para fijar las células. Incubar la placa durante 20 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el PFA y se añade lentamente a 500 l de D-PBS estéril (con Ca2 + y Mg2 +) al lado del pozo para lavar las células. Repetir el lavado de un total de dos veces más. No aspirar el lavado final.
- Envolver la placa en parafilm y se almacena a 4 ° C para su posterior procesamiento o pasar directamente a la siguiente etapa. Las placas pueden almacenarse durante varias semanas.
6. La inmunocitoquímica y cuantificación de proteína básica de mielina
Nota: Al realizar los procedimientos de manipulación de líquidos en las placas de 24 pocillos, se recomienda trabajar con rapidez para evitar el secado de las células. En este caso, se recomienda el uso de un aspirador de vacío multicanal y una pipeta multicanal.
- Llevar la placa a temperatura ambiente, aspirar los pocillos y añadir 250 l de D-PBS (con Ca y Mg 2+ 2+) que contienen 0,1% de Triton X-100 y 5%suero de cabra normal (NGS). Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación orbital suave.
- Preparar la solución de incubación primaria mediante la dilución de anticuerpo monoclonal de ratón anti-MBP anticuerpo 1: 1000 y el anticuerpo policlonal de conejo anti-actina 1: 200 en D-PBS (con Ca y Mg 2+ 2+) que contiene 5% NGS. Alternativamente, policlonal de conejo anti-Olig2 a 1: 1000 se puede utilizar para los oligodendrocitos normalización específico en cultivos gliales mixtos. Preparar suficiente solución primaria para dar cabida a 250 l por pocillo.
- Incubar anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche para 16-18 horas con agitación orbital suave.
- Aspirar la solución de incubación primaria y se lavan las células 3 x 10 min con 500 l de D-PBS (con Ca y Mg 2+ 2+) a temperatura ambiente con agitación orbital suave.
- Mientras se lava la placa, preparar la solución de incubación secundaria diluyendo anti-ratón 680 y anti-anticuerpos de conejo 800 1: 500 en D-PBS (con Ca 2+ 2+) que contiene 5% de NGS. Minimizar la exposición de luz ambiental en la preparación de esta solución.
- Aspirar el lavado final y añadir 250 l de solución de incubación secundaria. Proteger a la placa de la luz y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación orbital suave.
- Aspirar la solución de incubación secundaria y lavar los pocillos 3 x 10 min con 500 l de D-PBS (con Ca y Mg 2+ 2+) a temperatura ambiente con agitación orbital suave.
- Analiza la placa utilizando un sistema de imagen capaz de detectar 700 nm y 800 nm emisiones de fluorescencia. Como punto de partida, establecer el desplazamiento a 3 y sensibilidades a 1,5 para MBP, 5.0 para la actina, y 3.5 para Olig2 focal. Ajustar los valores de sensibilidad, según sea necesario para evitar la sobreexposición de la señal.
- Cuantificar el grado de oligodendrogenesis usando métodos basados en software semi-automatizados.
- Usando el software, configurar el modo de análisis de la placa de "24 Bueno" y alinear círculos alrededor de tél perímetro exterior de los pozos escaneados. Ajuste el canal de normalización a "800" y exportar las intensidades totales y relativas de fluorescencia de los 700 nm (MBP) y 800 nm (Olig2 / actina) canales.
- Dividir la intensidad a 700 nm por la intensidad a 800 nm para dar la expresión de MBP normalizada en unidades relativas de fluorescencia. Calcular el promedio de las mediciones de replicar y aumentar la expresión del Día 0 + PDGF controles según sea necesario para el análisis.
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Representative Results
OPC A2B5-positivas se aislaron mediante selección celular positiva utilizando un sistema de separación magnética de columna. Antes del procedimiento de aislamiento, todo el cerebro se elimina de crías de rata que se encuentran entre P5 y P7. Una vez que todo el cerebro se separa con éxito desde el cráneo, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante unas pinzas quirúrgicas finas (Figura 1A). Con el fin de aislar el tejido cortical cerebral el hipotálamo, tálamo y mesencéfalo se escinden mediante una cuidadosa disección (Figura 1B). A continuación, el hipocampo y el cuerpo estriado se eliminan mediante unas pinzas quirúrgicas dobladas (Figura 1 C - D). El proceso de aislamiento elimina eficazmente las células meníngeas y fibroblastos, pero la digestión enzimática se mejora cuando las meninges y la vasculatura se eliminan (Figura 1E). Por último, los bloques de tejido de 1 mm x 1 mm se preparan para las etapas posteriores de disociación de tejidos (Fig1F URE).
Un buen aislamiento OPC debe resultar en un sedimento celular compacto después de la última etapa de centrifugado (Figura 2A). Una vez que sembraron estos cultivos serán relativamente libre de restos celulares cuando se observa bajo un microscopio (Figura 2B). Un aislamiento subóptima puede dar lugar a un pellet grande y esponjoso debido a la presencia de grandes cantidades de desechos celulares. Estos desechos se adherirá fuertemente al recipiente recubierto con PLL y puede interferir con el cultivo (Figura 2C). Si un pellet grande y mullido materializa, puede ayudar para volver a suspender las células en 10 ml de PBS y repetir el centrifugado final de 10 min a <300 x g. Una vez que el aislamiento es completa, la pureza de los cultivos se puede evaluar mediante citometría de flujo para identificar el porcentaje de células A2B5-positivo. Un éxito en el aislamiento debe dar lugar a un grupo de células que son> 95% positivo para A2B5 (Figura 2D - F). En comparación con las células teñidas con un anticuerpo fluorescente colorante conjugado anti-A2B5, las células no teñidas deben aparecer como un negativo de la población y se puede utilizar como una referencia de línea de base para gating. Por otra parte, hemos demostrado anteriormente que la selección de los OPC utilizando las culturas rendimientos de antígeno A2B5 que tiñen positivo para el PDGFRa por inmunohisto 11.
Como se demuestra mediante inmunocitoquímica, los OPC al inicio del tratamiento (día 0) son Olig2 + / MBP - mientras que las células son Olig2 + / MBP + 4 por día (Figura 3). La confluencia óptima de los OPC y oligodendrocitos en el día 0 y el día 4, se muestran en las imágenes de campo claro representativos (Figura 4A). La ausencia de expresión de MBP en el día 0 como línea de referencia para cuantificar oligodendrogenesis. diferenciación espontánea como resultado de la retirada PDGF-AA sirve como control negativo, mientras que 45 nM de hormona tiroidea (triiodothyronine; T3) se puede utilizar como un control positivo 11,15. Quetiapina, también conocido como Seroquel, y clemastina, también conocido como Tavist, son fármacos que han demostrado para acelerar oligodendrogenesis in vitro y pueden ser utilizadas como controles positivos adicionales 16,17 aprobado por la FDA. La figura 4B muestra una de infrarrojos de dos canales representante escaneo fluorescente que demuestra los resultados esperados para cada una de estas condiciones, por triplicado. señales de actina y MBP se pseudocoloreada verde y rojo respectivamente, de manera que las culturas altamente diferenciadas presentan un color amarillo en las imágenes fusionadas. Los resultados muestran que la expresión de MBP en el día 4 en la condición retirada PDGF era 4,5 ± 1,4 veces mayor en comparación con el día 0, mientras que los cambios veces en MBP debido al tratamiento con la hormona tiroidea, quetiapina, y clemastina fueron 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 y 32.8 ± 0.5, respectivamente (Figura 4C). La robustez y exactitud del ensayo se demuestran por el smtodas las desviaciones estándar entre las muestras por triplicado y la gran ventana de activación del tratamiento que está a unos 20 desviaciones estándar por encima del control de la retirada de PDGF.
Mientras actina sirve como un gen de referencia fiable para la normalización en cultivos de oligodendrocitos, los genes de referencia alternativos también pueden ser utilizados. Olig2 es un factor de transcripción nuclear que se expresa constitutivamente en las células del linaje de oligodendrocitos. Su patrón de expresión específico y constitutiva de este modo puede proporcionar una estrategia de normalización más preferible en situaciones de cultivo heterogéneos. Figura 5 muestra que en los cultivos de OPC diferenciadas con 10 nM de la hormona tiroidea, el pliegue del cambio calculado de MBP expresión relativa a la retirada PDGF es el mismo cuando se utiliza Olig2 o actina para la normalización. Es de suponer que, dado que los cultivos de OPC en este experimento fueron muy puro, ambas proteínas se pueden utilizar de forma fiable para la normalización. Sin embargo, nos often observar una pequeña población de células OLIG2 negativo por el día 4, pero no parece que la proporción de esta población a la población Olig2-positivas que difieren significativamente entre la retirada PDGF y grupo tratado T3. Por lo tanto, los factores de cambio no se ven afectados. Dado un escenario en el que un tratamiento puede provocar la proliferación de tipos celulares OLIG2-negativas, la elección de anticuerpo normalización debe ser considerado cuidadosamente.
Figura 1:.. Rata procedimiento de disección del cerebro descripción paso a paso del procedimiento de disección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La citometría de flujo análisis de aisladosOPC. (A) Después de la purificación en columna magnética, la población de células unido se cayeron fuera de la columna y se centrifugaron para formar un sedimento compacto. La cantidad de desechos se indica por el tamaño de la pastilla. (B) Si la pastilla es compacto, entonces los desechos será mínimo en el cultivo. (C) Una pastilla grandes y mullidas típicamente resulta en una cultura con residuos pesados. La pureza del cultivo se determina por citometría de flujo utilizando un anticuerpo A2B5 anti-ratón de rata que está conjugado con APC. (D) Las células muertas y los desechos se excluyen del análisis como se muestra en la dispersión y de la dispersión lateral parcelas hacia adelante. (E) La población A2B5 positivo se puede determinar mediante el uso de una mancha en la muestra como una referencia de línea de base para gating. (F) OPCs aislados con éxito debe ser> 95% positivo para A2B5. Por favor, haga clic aquí para competirwa versión más grande de esta figura.
Figura 3:. OPC cultura y el procedimiento de diferenciación La fluorescencia de barrido (DIFS) ensayo de doble infrarrojo comienza con los OPC de rata isolatedA2B5 positivos recién sembraron en recipientes de cultivo revestidos con PLL (día 3). Estos cultivos se proliferaron durante 3 días en presencia de 20 PDGF-AA ng / ml, y luego tratados con factores experimentales en fresco medios PDGF-libre en el día 0. medio de tratamiento está totalmente rellenado en el Día 2, y las células se fijan con 4% de paraformaldehído en el día 4. la inmunocitoquímica para Olig2 (verde) y MBP (rojo) se realizó en cultivos representativos en el día 0 y el día 4 con DAPI (azul) como una tinción de contraste nuclear. Estos cultivos exhiben tinción constitutivo para el pan de oligodendrocitos linaje Olig2 marcador de células en los días 0 y 4, mientras que la tinción para el marcador de oligodendrocitos maduros MBP sólo es evident por el día 4. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: cuantificación MBP usando el ensayo de doble fluorescencia de infrarrojo de barrido (DIFS) (A) La densidad de las culturas OPC en el día 0 y el día 4 necesario para el rendimiento óptimo del ensayo.. (B) las exploraciones de fluorescencia de doble infrarrojos representativos. OPCs se diferenciaron en placas de 24 pocillos durante 4 días en presencia de 45 nM de T3, 1 M quetiapina, 1 clemastina mu M, o 0,1% de DMSO, por triplicado. Una placa separada que contiene los OPC que fueron fijados en el día 0 (+ PDGF) fue procesado en paralelo. Actina (pseudocoloreada verde) y MBP (pseudocoloreada rojo) se cuantificaron simultáneamente usando un escáner Odyssey Licor configurar para detectar 700 nm y 800 nm emisiones. (
Figura 5: Olig2 es una proteína de referencia fiable para la normalización de la expresión de MBP en oligodendrocitos OPCs se diferenciaron por triplicado en presencia de 10 nM de T3 o control de vehículo de DMSO 0,1% en placas de 24 pocillos durante 4 días.. El ensayo de doble infrarrojo de fluorescencia de exploración se realizó con anti-Olig2 o anticuerpos primarios anti-actina para la normalización. Olig2 / actina y MBP se cuantificaron simultáneamente usando un escáner Odyssey Licor configurar para detectar 700 nm y 800 nm emisiones. expresión MBP hubormalized a cualquiera Olig2 o expresión de actina, y los resultados se escalan para el control de DMSO 0,1%. Las unidades de fluorescencia media relativa ± SD se representaron usando GraphPad Prism 6. Los resultados muestran que el calculado veces de cambio es la misma cuando la normalización a cualquiera de las dos proteínas de referencia.
Figura 6:. Efecto de Triton X-100 en la tinción MBP OPCs se diferenciaron en placas de 24 pocillos durante 4 días en presencia de 45 nM o T3 0,1% de DMSO. Después los cultivos se fijaron con PFA al 4% y se tiñeron para Olig2 y MBP utilizando dos protocolos diferentes de inmunocitoquímica. Para la alta muestra de Triton X-100, se permeabilizaron las células durante 1 h con 0,4% Triton X -100 y todas las etapas de incubación de anticuerpos se realizaron en presencia de 0,1% de Triton X-100. Para la muestra de bajo Triton X-100, se permeabilizaron las células durante 1 h con 0,1% Triton X-100, mientras que Antiboincubaciones dy se realizaron sin Triton X-100. Olig2 y MBP se visualizaron con secundarios y las imágenes fluorescentes de tinte conjugado fueron adquiridos utilizando un microscopio de fluorescencia basada en la cámara. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo que se presenta aquí describe un método rápido y fiable para el aislamiento de los OPC de rata y cuantificar en oligodendrogenesis vitro en respuesta a factores experimentales. Usando la selección positiva, altos rendimientos de los OPC viables y puros se utilizan directamente para fines experimentales. Este método simplifica el aislamiento, cultivo y etapas de diferenciación en un marco de tiempo 1 semana, y las células fijadas se puede almacenar convenientemente a 4 ° C durante varias semanas, sin ninguna pérdida en la sensibilidad del ensayo.
Una ventaja importante con los ensayos de fluorescencia basada en el escáner es que la adquisición y análisis de datos se acelera en gran medida en comparación con las técnicas tradicionales de microscopía basada en la cámara. Aunque la microscopía se ha utilizado con éxito en las pantallas de alto rendimiento para identificar inductores de la diferenciación de OPC, la adquisición de datos es inherentemente más lento, ya que requiere la programación de secuencias de captura de imagen, de varias horas de la recogida de datos, análisis de cientos a thousands de archivos de imágenes y algoritmos definidos por el usuario para distinguir los cuerpos celulares individuales para la normalización o el análisis 18,19. Además, con los sistemas de microscopía basados en cámaras que no es factible para adquirir datos de toda la superficie del recipiente de cultivo. En cambio, las imágenes representativas deben ser capturados de diferentes áreas dentro de un solo pozo, lo que puede dar lugar a un sesgo posicional y accesos falsos positivos. En comparación, este ensayo detecta expresión MBP de todas las células dentro de un bien determinado, y múltiples placas pueden ser escaneados al mismo tiempo. Si bien este método puede ser adaptado para el uso en formatos de 96 pocillos o 384 pocillos, la placa de 24 pocillos puede ser preferido cuando menos tratamientos están siendo probados. Hemos observado que la pérdida de células en la placa de 24 pocillos debido a la manipulación de líquido se reduce al mínimo, que es una complicación que debe ser considerado en el diseño de experimentos de mayor rendimiento.
Un parámetro crítico del ensayo es la densidad de las células cuando Differentiación se inicia en el día 0. Los cultivos con muy pocas células parecen diferenciar más lentamente y mueren, mientras que los cultivos de alta densidad exhiben diferenciación espontánea. Ambas situaciones pueden reducir el rango dinámico y la fiabilidad del ensayo. Para lograr un equilibrio óptimo entre la salud celular y la densidad de las células, que la cultura de los OPC de 3 días sin un intercambio de medios o de suplementos de PDGF-AA fresca. La hipótesis de que puesto que la concentración de PDGF-AA en los descensos medios de comunicación por el día 3 en vitro (Día 0), como resultado del catabolismo celular, la tasa de proliferación de las células se ralentizará que la proliferación de este tipo se reduce a través de la primera día de PDGF la retirada de AA. Esta técnica funciona mejor cuando las células se distribuyen de manera uniforme durante el chapado. Pipeteando las células a lo largo del lado del pozo y mezclándolos con un movimiento en forma de ocho deben promover una distribución uniforme. Pipeteo en el centro del pozo tiende a producir grupos de células alrededor de los bordes de la bien con pocoser células que se adhieren al centro. Este fenómeno puede ser debido a la interrupción de la capa PLL recién secado por fuerzas de pipeteado de líquidos. La acumulación de células en todo el perímetro puede reducir la sensibilidad del ensayo debido a la diferenciación dependiente de la densidad. Es importante tener en cuenta que las diferencias significativas en la intensidad de la señal / Olig2 actina pueden ocurrir entre, culturas de abstinencia de PDGF de control tratados con la droga y. De manera significativa disminución de la señal de actina / Olig2 puede indicar la toxicidad del fármaco, mientras que aumentó significativamente señal / Olig2 actina puede indicar la proliferación inducida por fármacos. normalmente Observamos una señal de actina / Olig2 ligeramente más alta de las células tratadas con fármacos pro-diferenciación en comparación con los controles de abstinencia de PDGF. Atribuimos esta diferencia a una mayor tasa de apoptosis espontánea en el grupo de retirada PDGF sobre el procedimiento de diferenciación 4 días. Al evaluar oligodendrogenesis, la normalización de MBP a la actina / Olig2 debe corregir las diferencias de número de células. Para evaluar toxiciudad y la proliferación usando este ensayo, el anticuerpo anti-MBP se puede cambiar por anticuerpos primarios dirigidos contra los marcadores apropiados.
Cuando experimentos requieren tanto la evaluación cuantitativa y cualitativa, es importante para limitar la exposición de los cultivos de oligodendrocitos de rata fijos a Triton X-100 al utilizar 4% PFA para fijar las células. Otros protocolos de inmunocitoquímica para cultivos de oligodendrocitos, que típicamente incluyen Triton X-100 durante las dos etapas de incubación de anticuerpos para mejorar la accesibilidad epítopo de anticuerpo, se pueden utilizar con éxito en función de las necesidades experimentales. Por otro lado, aunque MBP es una proteína intracelular puede ser posible excluir Triton X-100 en su totalidad si se emplean los métodos de fijación alternativos que permeabilizar adecuadamente las células. Usando las condiciones descritas aquí, se ha observado que Triton X-100 afecta a la morfología observada de los oligodendrocitos, así como la localización de la tinción de MBPcuando se utiliza en altas concentraciones. No vemos una disminución significativa en la tinción de anticuerpos cuando Triton X-100 se omite de las etapas de incubación de anticuerpos. Como se muestra en la Figura 6, que incluye 0,4% de Triton X-100 en la permeabilización y el bloqueo de paso, y 0,1% de Triton X-100 durante la incubación de anticuerpos, reduce la detección de procesos de mielina y los resultados en la tinción de MBP discontinua. Por lo tanto, para la evaluación cuantitativa y cualitativa puede ser suficiente utilizar una menor concentración de Triton X-100 como se describe aquí.
Aunque el uso de los OPC seleccionado A2B5-de ratas puede ser ventajoso, hemos observado resultados comparables en el ensayo de doble infrarrojo de fluorescencia de barrido (DIFS) utilizando los OPC seleccionado A2B5-de ratones C57BL / 6, aunque el rendimiento de células por ratón es típicamente mucho inferiores (datos no presentados). Otros protocolos para la purificación OPC también pueden ser compatibles con este ensayo. Por ejemplo, marcador de oligodendrocitos O4 se puede utilizar como un antígeno para purificar intermediate precursores de oligodendrocitos etapa utilizando perlas magnéticas 20. Como alternativa a los métodos basados en magnéticos, los OPC pueden ser enriquecidas a partir de antiguas culturas mixtas gliales 9 día que contienen los astrocitos y microglia por orbitales métodos de adhesión diferencial de agitación y de alta velocidad 21. Además, inmuno-panning procedimientos que incorporan tanto la selección celular negativa y positiva se puede utilizar si la pureza del cultivo es preferible a altos rendimientos de células 22. Además de examinar la forma en la terapéutica pueden mejorar directamente la diferenciación de los OPC en cultivos puros, a veces es necesario tener en cuenta los efectos indirectos de medicamentos a través de otros tipos de células en un sistema de co-cultivo. En la EM, se piensa que la infiltración de células T efectoras autorreactivas en el SNC para jugar un papel en la progresión de la enfermedad 23. las células T efectoras pueden secretar factores pro-inflamatorios que pueden inhibir la diferenciación de los OPC en los sitios de desmielinización. Por tanto, es de interés para identificar Therapeutics que pueden proteger a los OPC y bloquear estos factores proinflamatorios de exacerbar la lesión. El ensayo DIFS puede ser ideal para el modelado de esta actividad como células T crecen en suspensión y pueden ser lavados a partir del cultivo de oligodendrocitos antes de MBP cuantificación. Para los estudios de co-cultivo con células adherentes tales como neuronas, astrocitos y microglia, Olig2 normalización se puede emplear para recopilar datos de los oligodendrocitos en concreto. Por lo tanto, la flexibilidad del ensayo de DIFS puede facilitar una variedad de diseños experimentales.
En conclusión, este protocolo proporciona un método rápido y fiable para cuantificar la oligodendrogenesis de los OPC de rata A2B5-positivo in vitro. Este método de aislamiento constantemente ofrece altos rendimientos de los OPC viables que respondan a las señales de diferenciación establecidos. análisis sensible se puede realizar en recipientes de formato de múltiples pocillos usando una variedad de paradigmas experimentales, que se extiende la utilidad de este sistema para many diferentes aplicaciones. Además, el ensayo DIFS se puede adaptar para la detección de drogas de alto rendimiento, o se puede utilizar para verificar los resultados de los ensayos de bajo rendimiento, tales como la PCR cuantitativa y Western blot. Es importante destacar que este sistema puede ofrecer un medio simple pero eficaz para la identificación de OPC terapias dirigidas en enfermedades desmielinizantes, como la esclerosis múltiple.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Grant patrocinador: Instituto Nacional de Salud; Grant número: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
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