Summary
本文介绍了通过插管直接施用博莱到小鼠气管一种快速,简便的方法。这种方法的主要优点是,它是高度可再现的,容易掌握,并且不需要专门的设备或冗长的恢复时间。
Introduction
尽管某些解剖和生理差异,1鼠模型继续是无价建模人类生物学和疾病的发病机制。2从饲养的角度来看,小鼠是容易处理,具有低的繁殖时间,加速寿命,并且是相对便宜的去家。用不同遗传品系和策略(例如,条件敲奏,记者小鼠谱系追踪方法等),以及在宽范围内可用的试剂(例如,抗体,重组蛋白,抑制剂的开发,等),老鼠已经成为一个重要的脊椎动物模型生物体揭示人类的稳态和疾病过程。3
小鼠已经特别有价值用于研究肺部疾病,包括急性肺损伤(ALI)和肺纤维化。4 ALI在人类可以通过创伤,损伤或败血症引起,其特征是上皮和内皮泄漏(即,水肿),炎症,和新生的纤维化。在许多患者中,急性肺损伤前进到它的严重的形式,急性呼吸窘迫综合征(ARDS),这经常导致纤维化和死亡因呼吸衰竭。5,6-肺纤维化是一个渐进的,致命的病理学特征在于细胞外基质的过量沉积,最显着的I型胶原,导致肺功能受损。-7,8-管理博莱霉素(BLM)是最广泛使用和最佳表征模型实验动物诱导ALI和纤维化。9虽然博莱霉素诱导的肺纤维化啮齿动物确实不概括完全人类纤维化表型,与该模型10小鼠研究已导致的影响的发生和疾病的进展许多重要因素的发现。11
虽然确切机制(S)的后面博莱霉素诱导的纤维化是未知的,则发起伤被认为是从在上皮细胞接触依赖性的DNA链断裂衬传导气道和肺泡,并且特别地,1型肺泡产生。12的必要性BLM和肺上皮之间的直接接触突出一个健壮的递送途径的重要性和这些问题也有密切关系广泛的治疗靶向远端气道,包括重组蛋白,抗体,siRNA的,病毒,细菌,微粒,等等。口咽抽吸(OPA)已被广泛地用于此目的13,但OPA的一个主要缺点是,递送剂的某些部分可以被吞咽到胃肠道,从而导致不精确的给药剂量。另一广泛使用的方法是经气管滴注,涉及强麻醉下气管到代理的气管和滴注暴露直接进入呼吸道。14然而,不仅可以这样一个过程是不希望的,由于它的invasivity,但它也是耗时的,需要的培训公平位,同时产生强效伤到呼吸道15,16若干协议已被开发涉及的试剂的直接施用进而不需要手术干预气管,引起强大麻醉药16,17,18,19,20-但这些方法包括延长的恢复时间,使用昂贵的设备(即,耳镜/喉镜,市售程序板,光纤线等),在口腔中的过量操纵,和不确定性有关的剂量。
本文描述的给药通过插管相对容易的方法,其允许研究者快速,廉价和可靠地灌输试剂进鼠肺与对周围组织的残余破坏的风险有限。
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Protocol
机构的动物护理和使用委员会(IACUC)在华盛顿和雪松 - 西奈医学中心大学的必要批准这些研究动物的工作。
1.准备
- 既消毒钝端钳和降压通过高压灭菌。
- 使用生物安全柜,从冻干粉末制备BLM的工作原液在PBS中。超声处理10分钟,该溶液在35千赫到保证均匀混合。
注:建议的30和45微升之间的总体积,以防止与较大体积在低端移液变异,和窒息。 - 准备一个干净的工作区,其包括用于该过程本身约1米2,以及两个前和后的程序笼指定地点。
- 通过在底座和underl铺设2或3条实验室胶带固定的程序董事会立即在研究者面前的板凳基地颖替补。 图 1所示为创造一个板进一步规范。
- 领带的过程板的两个定位螺丝之间尺寸4.0缝合线的单根长度。
- 产生通过拆卸和从三个1毫升注射器丢弃柱塞,以及沉积60微升PBS中到每个筒的顶部上以形成气密密封的一个临时的肺活量计。固定导管的枢纽松散到注射器之一,它放置在电路板的一侧。
- 吸300微升空气进入1毫升的注射器,并将其放置在电路板的一侧。
- 切割胶带在长度和地点约6英寸的附加片一侧。这将被用于动物固定在板步骤2.4。
- 设置一个异氟醚室。附加O 2,异氟醚,真空到相应的端口上都曝光室和真空间隙。另外,施用麻醉剂在异氟醚兼容的生物安全柜。
2.插管
- 麻醉异氟烷鼠标在室内,直到它失去意识,呼吸减慢,以适当的速度。典型的曝光包括3至4分钟的4%的异氟醚和2%O 2,和理想的结果是2〜2.5分钟的镇静。这对应于1呼吸每2秒的呼吸速率。
- 在等待镇静设置在,吸BLM的30和45微升之间成移液器和地点到一侧。
- 当准备好后,从连接于程序平台的定位螺钉的螺纹暂停其上门牙的镇静鼠标。确保动物的背部靠在台表面平坦。
- 小心不要限制通风,放置一块胶布松散整个胸腔下部(尾)部分,只是隔膜上方。位置应足够紧PROC过程中保持正确对准edure,但不是那么紧,它限制呼吸。
- 打开照明灯%和100%的强度80之间和定向鹅颈,以便它是从皮肤的表面1至2厘米,靠近太阳穴。定期检查鹅颈管的尖端热,以确保它不伤害老鼠。
- 站在平台背后,用无菌,钝端钳定位舌头。小心,以避免下切牙,轻轻夹住并绘制舌头口腔。
- 使用剩余的手,插入抑制剂并用它来压平舌针对口腔的楼层。松开钳,但留下的降压到位接下来的两个步骤。
- 定向光使气管是由从太阳穴的水平向近侧引导鹅颈管,直到它到达主支气管的水平可见的。
注意:气管可通过呼吸的作用而容易地分开,WHICH导致发出的光的强度波动。当正确定位时,该结构将在轴向平面内的光的一个位于中心的销与在口腔中本身最小环境光可辨别。 - 角的注射器,使得它跟随气管的自然路径,并降低22-G的导管末端,与含有微滴,直入管腔所附注射器。 PBS的泡沫将开始上升,并在成功安置每次呼吸下降。
注意:此动作可通过几秒钟作为深度镇静的结果被延迟。 - 喂导管在额外的5毫米。取出压舌板。
- 移注射器相反的手,抓住中心,轻轻取下注射器。
- BLM的30和45微升之间存到导管毂的内部的中心,连接第二注射器和分配300μl的空气进入中心。
- 更换第二与第一含PBS的气泡注射器。泡沫将继续上升,如果程序已经成功地进行下降。
3.后护理程序
- 取下导管和胶带,然后将动物在干燥温暖的地方,直到它恢复意识 - 通常在一两分钟。
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Representative Results
如别处所述21插管小鼠每天监测体重减轻和窘迫,处死4,10或17天后通过2.5%2,2,2- 三溴腹腔注射。 支气管肺泡灌洗 (BAL)收集在PBS中洗涤三次和右肺固定在10%福尔马林,石蜡包埋,并用Masson三色由华盛顿组织学和成像核心22的大学染色。
在既定的数据一致,博莱霉素处理的小鼠经历7和10天暴露后23(图2A)之间的峰的重量损失。此外,在BAL IgM的水平升高从处死博莱霉素处理的小鼠表现出显著,时间依赖性增加在肺通透性,指示上皮细胞和/或内皮屏障功能障碍( 图2B)的。
=“jove_content”FO:保together.within页=“1”>使用马松染色测量纤维化反应-总胶原蛋白含量24的行之有效的标记。右边肺部进行染色,并且每右肺部分三色染色的平均总面积进行定量(图3A)。代表性的部分显示在纤维化病变 ( 图3B)的肺间质和增加的所得治疗依赖性增厚 。
图1.生产工序的板常规参数,给出的长度表明有必要创建工序设备的大致尺寸。在这些实验中,标准铝金属片切成适当的尺寸,然后用“T”型支架加强。ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图下面的博来霉素的施用2.体重减轻和屏障功能障碍。小鼠施用2.0单位/ kg的BLM或PBS的等量的。 (A)减肥表示为0天的重量百分比(BLM:N = 21; PBS:5)。 (B)的小鼠在第4天或10天暴露后处死,从收获的肺中BAL IgM的蛋白通过ELISA测量。 (PBS:N = 5;第4天:N = 3;第10天:N = 5)。数据表示为平均值±SEM表示。 * P <0.05相比,PBS的控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
以下博莱霉素管理图3.肺纤维化。(A)总胶原蛋白,量化为从WT控制总倍数变化马松染色。 (B)以 5倍放大倍数下拍摄三色染色的肺切片的代表性图像。 PBS控制包括5至14天之间采取后PBS对待动物(PBS:N = 5;第10天:N = 5 17天:N = 3)。数据表示为平均值±SEM表示。 * P <0.05相比,PBS的控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在雾化是不切实际由于有限的试剂可用性,安全性或成本的情况下,直接气管施用是用于递送外源剂的进入肺部优良的方法16经气管滴注已被广泛用于完成此。然而,与所有的外科手术,它也与它携带用于引起该过程本身并发症的可能性,并且不一定剂被灌输。13 由于这些原因,已经变得越来越普遍,直接经由插管16,17,18,19,20-服用一种物质进入气管。然而,这些方法也遭受限制,包括关于该导管的位置,由于利用强大的镇静剂像氯胺酮/赛拉嗪延长的恢复时间,不确定性(即,进入食道而不是气管),在组织中的不必要的操作口腔,和相关的成本与购买专用仪器,如耳镜/喉镜。
一旦建立,这里列出的方法提供了比其他插管协议的几个有意义的好处。一方面,使用异氟醚的允许在每只小鼠花费的总时间的减少。这主要是由于以恢复知觉以下相比像氯胺酮受控物质的异氟烷镇静所需动物的减少时间(约5分钟与有时大于3小时)14另外,临时肺活量计通过允许研究者保证成功的信心以可视化的振荡PBS泡沫,这表明之前和之后滴注给药物质的正确位置。最后,通过利用外部光源,而不是一个笨重耳镜或喉镜和导丝,研究者能够减少他们手中设备的数量,同时提高其查看OF中的口腔和减少其损伤周围气管软组织的可能性。
与此协议相关的具体问题不多,但严重。例如,虽然使用异氟醚的减少与从镇静诱导和恢复相关联的时间,它也需要在动物的镇静状态的严格观察。未能从异氟醚室取出的动物及时可导致死亡,尤其是在动物已经在上一次干预复苏。相反,异氟醚不足剂量和延长程序时间可以导致动物的过程本身,这也可能导致人身伤害中恢复意识。因此,当务之急是为动物两者的安全性和使动物在意识的第一个迹象返回到异氟烷室实验的完整性。自学习这种方法时这可以是通用的,所以建议在经验丰富的研究证实麻醉下一个之前每个动物的成功管理。此外,有困难的研究人员还可以选择延长异氟醚曝光率以增加可用的过程时,只要他们密切监视动物濒死。
这种方法的另一个问题是,与处理相关的损害。这是在三个步骤尤其可能:从口中取出时舌头,插入导管时,并撞出从轮毂治疗后的注射器时。该导管的放置是迄今为止最危险的这些步骤。重要的是,直到气管的观点是理想的导管不应进入口腔。如果气管不能通过任一光源或降压的操作被带入视图中,研究者应松开舌和重新尝试的过程。围绕气管i上的软组织的操纵不是必需的或推荐。然而,一旦导管已被正确地放置,应注意也可采取保持毂从太远进入气管前进和射孔主茎支气管。这通常可以通过确保导管仅松散地附着到注射器筒体被避免,并且通过支撑含有对程序板的导管的手使之保持静止。这些细微之处,在需要的及时性和精准在一起,突出完善这一过程的准备和实践的重要性。然而,随着训练它应该有可能对于一个新手研究者超过一个小时的过程中处理20个或更多的动物,和有经验的研究人员来完成两倍多或更多。
通过直接气管沉积传授的一致性使得它的管理是近年来最佳途径。事实上,类似的方法已经报道了完全不同的队友众多里亚尔这种方式19,25。与这样的协议相一致,在这里所概述的方式博莱霉素的递送导致两肺强效纤维化反应,并在所有波瓣,这表明深度和均匀性分布的类似水平。在此基础上,很可能,这个协议提供了可比的实验优势的范围内,依赖于接触来介导其作用的其它材料(例如,药品,抗体,细菌剂, 和体内蛋白质修饰系统,诸如慢病毒载体)和,像博莱霉素,它将允许这样的试验也可与信心,小的费用,和最小的术后护理进行。
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Acknowledgments
作者感谢组织学的布赖恩·约翰逊和影像核心在华盛顿大学与三色染色和分析的帮助。这项工作是由美国国立卫生研究院资助HL098067和HL089455支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
Blunt End Forceps | |||
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
Intubation Board | See Diagram 1. | ||
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
Oxygen | |||
Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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