Summary
この記事では、挿管を経由して、マウスの気管に直接ブレオマイシンを投与するための迅速かつ簡単な方法を提示します。この方法の主な利点は、習得が容易で、それは非常に再現可能であることであり、特殊な装置または長い回復時間を必要としません。
Introduction
畜産観点からいくつかの解剖学的および生理学的な違いにもかかわらず、1マウスモデルは、ヒトの生物学と疾患の病因をモデル化するための非常に貴重であり続ける。2、マウスは、取り扱いが容易で低繁殖時間を持って、加速寿命、かつ比較的安価です家へ。多様な遺伝的系統と戦略（ 例えば 、条件付きノックアウト、レポーターマウス、系統追跡手法など）、ならびに入手可能な試薬の広い範囲（ 例えば 、抗体、組換えタンパク質、阻害剤の開発と、等）、マウスは、ヒト恒常性と疾患過程を明らかにするために不可欠なモデル脊椎動物の生物となっている。3
マウスはヒトで4 ALIは、外傷、傷害、または敗血症によって引き起こされ得る。急性肺損傷（ALI）および肺線維症などの肺の状態を研究するために特に有益であったと上皮を特徴とし内皮リーク（ すなわち、浮腫）、炎症、および新生線維症。多くの患者では、ALIは、その重篤な形態、しばしば線維症、呼吸不全のために死をもたらす急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、へと進行する。5,6肺線維症は、細胞外マトリックスの過剰沈着を特徴とする進行、致命的な病態であります、最も顕著に私が損なわ肺機能につながる、型コラーゲン。ブレオマイシンの7,8管理局（BLM）は、実験動物でALIおよび線維症を誘導するための最も広く使用されていると最もよく特徴付けられたモデルである。9げっ歯類におけるBLM誘発肺線維症はありませんが、完全にヒトの線維性の表現型を再現ではない、このモデルと10マウス研究は、疾患の発症と進行に影響を与える多くの重要な要因の発見につながっている。11
BLM誘発性線維形成の背後にある正確なメカニズム（s）は不明であるが、開始けが誘導気道および肺胞、特に、1型肺の内側を覆う上皮細胞における接触依存性DNA鎖切断に起因すると考えられる。12 BLMおよび肺上皮との間の直接接触の必要性は、頑強な送達経路の重要性を強調、およびこれらの懸念はまた、組換えタンパク質、抗体、siRNAを、ウイルス、細菌、微粒子、および多くを含む遠位気道を標的とする治療法の広い範囲に密接な関係がある。口腔咽頭吸引（OPA）が広く、この目的の13のために使用されてきたが、OPAの主な欠点は、送達される薬剤の一部がそれによって投与量に不正確さをもたらす、胃腸管に飲み込むことができることです。もう一つの広く使用されているアプローチは、直接気道への薬剤の気管や点滴を露出するために強力な麻酔下で気管切開を伴う経気管点滴、である。14しかし、だけでなく、そのようなよいです手順、その浸 潤性に望ましくないこと、それはまた、時間がかかり、訓練の公平なビットを必要とし、気道に対して強力な障害を引き起こします。15,16、いくつかのプロトコルが開発されているに薬剤の直接投与を含みます外科的介入を必要とせずに気管、16,17,18,19,20が、これらの方法は、強力な麻酔薬によって引き起こされる長期の回復時間、高価な装置（ すなわち 、耳鏡/喉頭鏡、市販の手順ボード、光ファイバの使用を含みます投与量に関しては、ワイヤなど）、口腔内での操作の過剰、および不確実性。
本論文では、研究者が迅速、安価に、かつ確実に周囲の組織への残留損傷の限定されたリスクとマウスの肺に試薬を植え付けることができます挿管による投与の比較的容易な方法を記載しています。
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Protocol
ワシントンとシーダーズ・サイナイ医療センターの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、これらの研究のために必要な動物の作業を承認しました。
1.準備
- 平滑末端鉗子と降圧介してオートクレーブの両方を滅菌します。
- 生物学的安全キャビネットを使用して、凍結乾燥粉末からPBSでBLMの作業ストックを準備します。偶数混合を確実にするために35 kHzで10分間この溶液を超音波処理します。
注：μlの30〜45の総容量は、より大容量で、ピペットローエンドのバリエーション、および窒息を防ぐために推奨されます。 - 手順自体は約1メートル2を備えてクリーンなワークスペースを準備し、同様の手順の前と後の両方のケージの場所を指定。
- ベースとunderl渡って実験用テープの2または3のストリップを置くことによって、直ちに研究者の前でベンチに手続きボードのベースを修正しました。英ベンチ。ボードの作成 に関する更なる仕様については、図1を参照してください。
- 手順ボードの2つの位置決めねじのサイズ4.0縫合糸の単一の長さを接続します。
- 削除し、3 1ミリリットルのシリンジからプランジャーを破棄し、気密シールを形成するために、各バレルの上部にPBSを60μlを堆積させることにより、その場しのぎの肺活量計を生成します。シリンジの1に緩くカテーテルのハブを固定し、基板の一方の側に配置します。
- 1mlシリンジ内への空気の吸引し、300μlのとは、基板の一方の側に配置します。
- 一辺までの長さと場所で約6インチテープの追加部分をカット。これは、ステップ2.4でボードに動物を保護するために使用されます。
- イソフルラン室を設定します。露光室とクリアランス真空の両方で適切なポートに、O 2、イソフルラン、真空を取り付けます。また、イソフルラン互換生物学的に麻酔薬を投与します安全キャビネット。
2.挿管
- それは意識を失い、呼吸が適切な速度に減速するまで、チャンバ内でイソフルランでマウスを麻酔。典型的な曝露は、3〜4分間、4％イソフルランおよび2％O 2を含み、理想的な結果は、鎮静の2〜2.5分です。これは、すべての2秒1呼吸の呼吸速度に対応しています。
- 片側にピペッター、所定の位置にBLMの30と45μlの間に設定するには、鎮静、吸引を待っている間。
- 準備ができたら、手順プラットフォームの位置決めネジに取り付けられたスレッドからその上顎切歯によって鎮静させたマウスを一時停止します。動物の背側は、プラットフォーム表面に対して平らにすることを確認してください。
- 換気を制限しないように注意しながら、ちょうど横隔膜の上、緩く胸腔の下（尾）部分を横切ってテープ片を配置します。配置は、procの中に適切な位置合わせを維持するのに十分タイトであるべきですedureが、それは呼吸を制限することは非常にタイトではありません。
- 80％の間と100％の強度に照明をオンにして、それは太陽神経叢の近くに、皮膚の表面から1〜2cm程度になるように、グースネックを向けます。定期的にマウスを傷つけることがないように、熱のためのグースネックの先端を確認してください。
- プラットフォームの後ろに立ち、舌を見つけるために、滅菌、平滑末端の鉗子を使用しています。下の切歯、軽くグリップを回避し、口腔外に舌を描くように注意しながら。
- 残りの手を使用して、圧子を挿入し、口腔内の床面に対して舌を平らにするためにそれを使用。鉗子を解放しますが、次の2つの手順のための場所で圧子を残します。
- オリエント光気管は、それがmainstem気管支のレベルに達するまで太陽神経叢のレベルから近位グースネックを案内することにより、表示されるように。
注：気管を簡単に呼吸の作用によって区別することができ、WHIchが放出された光は強度が変動する原因となります。正しく配置すると、この構造体は、口腔自体に最小限の環境光の光の中心に位置するピンとして軸平面に識別可能になります。 - 角度シリンジそれは気管の自然な経路をたどる、とストレート内腔に、液滴を含む添付のシリンジを用いて、22-Gのカテーテル先端を下げるようにします。 PBSバブルが成功した配置時に各呼吸と共に上昇し、秋に開始されます。
注：このアクションは、深い鎮静の結果として数秒遅れで表示することができます。 - 追加の5ミリメートルにカテーテルを養います。舌を取り外し圧子。
- 反対側の手に注射器をシフトし、ハブを把持し、静かに注射器を取り外します。
- カテーテルハブの内部の中心部へのBLMの30と45μlの間の預金は、第2のシリンジを接続し、ハブへの空気の300μLを分注します。
- 第二を交換しますPBSの気泡を含有する第一と注射器。バブルが上昇し、プロシージャが正常に実行された場合に落下していきます。
3.ポスト手続きケア
- カテーテルとテープを取り外し、それが意識を取り戻すまで、乾燥した暖かい場所に動物を置く - 通常、数分以内に。
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Representative Results
挿管マウスは2.5％2,2,2- トリブロモエタノールの腹腔内注射を介して、10または17日後に、体重減少及び苦痛を毎日モニターし、4を屠殺した。他の場所21に記載のように気管支肺胞洗浄 （BAL）は、PBSの3回の洗浄で回収しました、および右肺は、10％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、ワシントン組織学とイメージングコア22の大学のマッソントリクロームで染色しました。
確立されたデータと一致して、BLM-処置マウスは日7,10ポストエクスポージャー23（図2A）との間のピーク体重減少を経験した。また、犠牲BLM処置マウスからのBAL中のIgMレベルの上昇は、有意な、時間依存性の増加を示しました肺透過性、上皮および/ または内皮バリア機能不全（図2B）を示します。
= "jove_contentは「FO： -総コラーゲン含有量24の十分に確立されたマーカーキープtogether.withinページ=" 1 ">線維形成応答がマッソン三色染色を用いて測定しました。右肺を染色し、右肺のセクションごとのトリクローム染色の平均総面積は、（図3A）を定量した。代表のセクションでは、線維性病変で肺間質および増加した（図3B）の結果として治療に依存肥厚を示しています。
作業手順ボードを製造するための図1.一般的なパラメータ。提示長さが作業手順装置を作成するために必要なおおよその寸法を示しています。これらの実験では、標準のアルミニウムシート金属は、次いで、適切な寸法に切断された「T」ブラケットで補強。ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2減量およびバリア機能不全ブレオマイシンの投与後。マウスは、BLMまたはPBSの等量の2.0 U / kgを投与しました。 （A）の重量損失は、0日目の重量の百分率として表さ（BLM：N = 21; PBS：5）。 （B）マウスに4または10日間曝露後に屠殺し、そして回収肺からのBAL中のIgMタンパク質をELISAによって測定しました。 （PBS：N = 5; 4日目：N = 3; 10日目：n = 5）でした。データは、平均±SEMとして提示されています。 * P <0.05、PBS対照と比較。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ブレオマイシンの投与後の図3.肺線維症。WT対照からの総変化倍率マッソンの三重染色として定量（A）の総コラーゲン、。 （B）5倍の倍率で撮影トリクローム染色した肺切片の代表的な画像。 PBS対照は、5〜14日後にPBS処置取ら動物で構成されています（PBSを：N = 5; 10日目：N = 5;日17：n = 3）でした。データは、平均±SEMとして提示されています。 * P <0.05、PBS対照と比較。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
エアロゾル化が原因で制限された試薬の利用可能性、安全性、またはコストに実用的ではない例において、直接気管内投与は、肺への外因性薬剤の送達のための優れた方法である16経気管点滴注入が広くこれを達成するために使用されています。しかしながら、すべての外科的介入と同様に、それはまた、それを使用して手順自体に起因する合併症の可能性を運び、そして必ずしも薬剤が点眼されている。13 これらの理由から、それは、挿管16,17,18,19,20を介して気管に直接物質を投与することがますます一般的になってきています。しかしながら、これらの方法はまた、長期の回復ケタミン/キシラジンのような強力な鎮静剤の使用に起因する時間、不確実性カテーテルの配置に関する（ すなわち 、食道へなく気管）内の組織の不必要な操作を含め、制限を受けます口腔、および関連するコストこのようなotoscopes /喉頭鏡などの特殊な機器を購入すると。
確立されたら、ここで説明するアプローチは、他の挿管プロトコルを介して、いくつかの意味のある利点を提供します。一つには、イソフルランの使用は、マウスごとに費やされた合計時間の短縮を可能にします。これは、ケタミンなどの規制物質に比べてイソフルラン鎮静次意識を取り戻すために、動物のために必要な時間短縮が主な要因である。14また（時には大きい時間3より対約5分）は、その場しのぎの肺活量計は、研究者を可能にすることにより、成功の自信を確実に点眼前と後の両方に投与される物質の正しい配置を示し、振動PBSバブルを、可視化しました。最後に、代わりにかさばる耳鏡または喉頭鏡及びガイドワイヤの外部光源を利用することにより、研究者は、同時に、それらのビューOを向上させながら、手で装置の量を低減することができます口腔fおよび気管の周囲の軟組織を損傷するチャンスを減少させます。
このプロトコルに関連した具体的な懸念は、いくつかの、しかし、深刻です。イソフルランの使用は誘導および鎮静からの回復に関連する時間を削減しながら、例えば、それはまた、動物の鎮静状態の厳密な観察が必要です。タイムリーにイソフルラン室から動物を削除に失敗すると、特に動物がすでに前の介入からの回復には、死をもたらすことができます。逆に、不十分なイソフルラン投与量と拡張手続き時間も傷害をもたらすことができます手順自体、中に意識を取り戻した動物をもたらすことができます。したがって、それは動物の安全性と動物が意識の最初の兆候でイソフルラン室に戻すことが実験の整合性の両方のために不可欠です。この方法を学習するときに、これは共通することができますので、中にすることをお勧めします経験豊富な研究者は、次の麻酔前に、各動物の成功した管理を確認します。また、難易度を持つ研究者はまた、彼らは密接に瀕死のために動物を監視することを提供し、利用可能な手続きの時間を増加させるためのイソフルラン暴露を拡張することができます。
この方法の追加の懸念は、取り扱いに関連した損傷のことです。これは、3つのステップの間、特にそうである：カテーテルを挿入する際に、口から舌を取り外すとき、および治療後のハブからシリンジを取り除くとき。カテーテル留置は、これまででこれらのステップの中で最も危険です。気管のビューが理想的であるまで重要なのは、カテーテルは、口腔内に入るべきではありません。気管は、光源や圧子のいずれかの操作を介してビューに持ち込むことができない場合は、研究者は舌を解放し、手順を再試行する必要があります。気管私の周囲の軟組織の操作必要または推奨されませんよ。カテーテルが正しく配置されているしかし、一度のケアも気管に遠く前進及びメイン幹気管支を穿孔からハブを維持するために注意すべきです。これは、一般に、それは静的なままであるように手続きボードに対してカテーテルを含む手を補強することにより、カテーテルのみ緩く注射筒に接続されていることを保証することによって回避することができます。これらのニュアンスは、一緒に適時かつ精度の必要性と、この手順を完璧に準備と練習の重要性を強調しています。それにもかかわらず、トレーニングでそれは時間の経過とともに20匹以上の動物を治療するために、初心者の研究者のために可能であるべきであり、経験豊富な研究者のために二倍の以上を完了すること。
直接気管蒸着によって付与される一貫性は近年の好ましい投与経路になりました。実際には、同様の方法は、既に異種の仲間多数報告されていますこのよう19,25にリアル。このようなプロトコルと一致して、ここで説明する方法で、ブレオマイシンの配信は、両方の肺の中の強力な線維化反応をもたらし、すべての葉に、分布の深さと均一性の同様のレベルを示唆しています。このことから、このプロトコルは、（例えば、レンチウイルスベクターのような生体内タンパク質修飾システムにおいて、例えば 、医薬品、抗体、抗菌剤など）、それらの効果を媒介する接触に依存する他の材料の範囲で同等の実験的利点を提供する可能性が高いです、およびブレオマイシンのように、それはそのような実験はまた、自信、少し費用、および最小限の術後ケアを用いて行うことができるようになる、という。
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Acknowledgments
著者らは、トリクローム染色および分析のヘルプのためにワシントン大学の組織学とイメージングコアのブライアン・ジョンソンに感謝します。この作品は、NIHの助成金HL098067とHL089455によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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