Summary
Данная статья представляет собой быстрый и простой способ введения блеомицин непосредственно в трахею мыши с помощью интубации. Основные преимущества этого метода является то, что это очень воспроизводимые, легко освоить, и не требует специального оборудования или длительных сроков восстановления.
Introduction
Несмотря на некоторые анатомо-физиологические различия, 1 модели мышиных оставаться бесценным для моделирования биологии человека и патогенеза заболевания. 2 С животноводства точки зрения, мышей легки в обращении, имеют низкое время размножения, ускоренный срок, и относительно недороги в дом. С развитием различных генетических штаммов и стратегий (например., Условные нокауты, корреспондент мышей, клона трассировки подходов и т.д.), а также широкий диапазон доступных реагентов (например., Антитела, рекомбинантные белки, ингибиторы, и т.д.), мышей стали неотъемлемой модель позвоночных организм раскрыть гомеостаза и болезненных процессов человека. 3
Мыши были особенно ценны для изучения легочных заболеваний, в том числе острого повреждения легких (ALI) и фиброза легких. 4 ALI у человека может быть вызвана травмой, травмы или сепсиса и характеризуется эпителиальной иэндотелиальных утечки (т.е.., отек), воспаление и фиброз возникающий. У многих пациентов, ALI прогрессирует до тяжелой форме, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), что часто приводит к фиброзу и смерти из-за дыхательной недостаточности. 5,6 Пневмосклероз является прогрессивным, фатальным патология характеризуется избыточным отложением внеклеточного матрикса , особенно типа коллагена, что приводит к нарушению функции легких. 7,8 администрацию блеомицин (BLM) является наиболее широко используемым и наиболее хорошо охарактеризованных модель для индукции ALI и фиброз у подопытных животных. 9 Хотя BLM-индуцированной легочный фиброз у грызунов делает не повторять полностью на фиброзные фенотипы человека, 10 исследований на мышах с этой моделью привели к открытию многих важных факторов, влияющих на возникновение и прогрессирование болезни. 11
Хотя точный механизм (ы) позади BLM-индуцированной фиброгенеза неизвестны, инициирующий травмыСчитается, что возникают из контакт-зависимые перерывов нитей ДНК в эпителиальных клетках, выстилающих проводящие дыхательные пути и альвеолы и, в частности, тип 1 пневмоцитами. 12 Необходимость прямого контакта между BLM и легочный эпителий подчеркивает важность надежной маршруту доставки , и эти проблемы также уместны в широком диапазоне процедур адресованный дистальных дыхательных путей, в том числе рекомбинантных белков, антител, миРНК, вирус, бактерии, частицы, и больше. Орофарингеального аспирации (ОРА) широко используются для этой цели 13, но основным недостатком ОРА является то, что часть поставленного агента может быть проглочена в желудочно-кишечном тракте, тем самым приводя к неточности в введенной дозы. Другой широко применяемый подход транстрахеальная закапывания, который включает в себя трахеостомии под сильным наркозом подвергать трахеи и инстилляцию агента непосредственно в дыхательные пути. 14 Тем не менее, не только может, напримерпроцедура нежелательно из-за его invasivity, но это также много времени, требует справедливый бит обучения, и вызывает мощную травмы дыхательных путей были разработаны. 15,16 Несколько протоколов, которые связаны с непосредственным управлением агентов в трахеи без необходимости хирургического вмешательства, 16,17,18,19,20, но эти способы включают расширенные сроки восстановления вызвано мощными анестетиками, использование дорогостоящего оборудования (т.е.., отоскоп / ларингоскопическая, коммерчески доступные процедура доски, волоконно-оптические провода и т.д.), избыток манипуляции в полости рта, а также неопределенность в отношении дозировки.
Эта статья описывает относительно простой метод введения через интубации, который позволяет исследователю быстро, недорого и надежно привить реагента в мышиной легкого с ограниченным риском остаточного повреждения окружающих тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животное уходу и использованию Институциональные комитеты (IACUC) из Университета штата Вашингтон и Cedars-Sinai Medical Center одобрили животных работу, необходимую для этих исследований.
1. Подготовка
- Стерилизовать обе тупым концом щипцов и депрессорные через автоклав.
- Использование биологической безопасности, подготовить рабочий запас BLM в PBS с лиофилизированного порошка. Разрушать ультразвуком решение в течение 10 мин при 35 кГц, чтобы обеспечить равномерное смешивание.
Примечание: Общий объем от 30 до 45 мкл рекомендуется для предотвращения изменения пипетки на нижнем конце, и удушье с большими объемами. - Подготовьте чистую рабочую среду, которая включает в себя около 1 м 2 для самой процедуры, а также отведенных мест для клеток до и после процедуры.
- Закрепить основание процедуры борту к скамейке сразу перед исследователем путем укладки 2 или 3 полоски лабораторного ленты через основание и underlин скамейки. На рисунке 1 дальнейших уточнений по созданию доска.
- Свяжите одну длину размер 4.0 шовная нить между двумя позиционирования винтов процедуры борту.
- Генерировать самодельный спирометра путем удаления и отбрасывая поршень из трех 1 мл шприцы, и осаждение 60 мкл PBS в верхней части каждого ствола, чтобы сформировать герметичное уплотнение. Зафиксировать ступицу катетера неплотно к одному из шприцов и поместить его в одну сторону доски.
- Аспирируйте 300 мкл воздуха в 1 мл шприц и поместите его в одну сторону доски.
- Вырезать дополнительный кусок ленты около 6 дюймов в длину и отложить в сторону. Эта информация будет использоваться для обеспечения животное к доске на этапе 2.4.
- Настройка ИФ камеру. Приложить О 2, изофлуран и вакуум к соответствующим портам на обоих экспозиционной камере и вакуума зазором. В качестве альтернативы, управлять анестетик в ИФ-совместимый биологическаяБезопасность шкафа.
2. интубации
- Обезболить мышь с изофлуран в камере, пока он не теряет сознание и дыхание замедляется до соответствующей скоростью. Типичная экспозиция включает в себя 4% изофлуран и 2% O 2 от 3 до 4 мин, а идеальный результат составляет от 2 до 2,5 мин седации. Это соответствует частоте дыхания 1 вдох каждые 2 сек.
- В ожидании седации, чтобы привести в, аспирация от 30 до 45 мкл BLM в пипетки и отложить в сторону.
- Когда все будет готово, приостановить седативные мышь по его верхних резцов с резьбы, прикрепленной к позиционирующих винтов процедуры платформы. Убедитесь, что спинки животного лежит вплотную прилегает к поверхности платформы.
- Соблюдая осторожность, чтобы не ограничивать вентиляцию, поместите кусок ленты свободно поперек нижней (хвостовой) части грудной полости, чуть выше диафрагмы. Размещение должно быть достаточно жесткой, чтобы поддерживать надлежащее выравнивание во время прокаedure, но не настолько плотно, что он ограничивает дыхание.
- Включите осветитель, чтобы между 80% и 100% интенсивности и ориентировать на шток так, чтобы он составляет от 1 до 2 см от поверхности кожи, около солнечного сплетения. Периодически проверяйте наконечник гузнеке за тепло для того, чтобы она не травмировать мышь.
- Стоя позади платформы, использовать стерильные тупым концом щипцов, чтобы найти язык. Соблюдая осторожность, чтобы избежать нижних резцов, мягко сцепление и сделать язык из полости рта.
- Используя оставшуюся руку, вставьте Депрессор и использовать его, чтобы сгладить язык к полу полости рта. Отпустите щипцы, но оставить Депрессор на месте в течение следующих двух шагах.
- Направление освещения таким образом, чтобы трахеи видна, направляя на шток проксимально от уровня солнечного сплетения, пока не достигнет уровня mainstem бронхов.
Примечание: трахеи можно легко отличить под действием дыхания, беч вызывает испускаемый свет будет колебаться в интенсивности. При правильном положении, эта структура будет заметной в осевой плоскости в качестве центрально расположенным штифтом света с минимальным окружающим светом в самой ротовой полости. - Угол шприц так, чтобы она вытекает естественный путь трахеи, и понизить наконечник катетера 22-G, с присоединенным шприцем, содержащим каплю, прямо в просвет. Пузырь PBS начнет подниматься и опускаться с каждым вдохом после успешного размещения.
Примечание: Это действие может быть отложено на несколько секунд в результате глубокой седации. - Поток катетер в дополнительных 5 мм. Удалить язык депрессорных.
- Сдвиг шприц в противоположную стороны, и захватывающий ступицу, аккуратно удалите шприц.
- Депозит от 30 до 45 мкл BLM в центре внутренней части втулки катетера, закрепления второго шприц и обойтись 300 мкл воздуха в ступицу.
- Заменить второеШприц с первым содержащий пузырь PBS. Пузырь будет продолжать расти и падать, если процедура была выполнена успешно.
3. постабортных Уход
- Удалите катетер и ленту, и поместите животное в сухом теплом месте, пока он не приходит в сознание - как правило, в течение нескольких минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Интубированы мышей контролировали ежедневно для потери веса и тесноты, и умерщвляли 4, 10 или 17 дней спустя с помощью внутрибрюшинного введения 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Бронхоальвеолярный лаважа (БАЛ) было собрано в три моет PBS, как описано в другом месте 21 и правое легкое была зафиксирована в 10% формалине, парафин и окрашивали Trichrome Массона по Вашингтонского университета гистологии и изображений Ядра 22.
В соответствии с установленными данными, BLM-обработанных мышей испытали пиковую потерю веса между 7-й и 10 постэкспозиционной 23 (рис 2а). Кроме того, повышенные уровни IgM в БАЛ жертвенных BLM-обработанных мышей показали значительное, зависимое от времени увеличение проницаемости легких, указывает эпителиальные и / или эндотелиальные дисфункции барьера (рис 2В).
= "jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "1"> фиброгенную ответ измеряли с помощью Массона трехцветный краситель - устоявшийся маркер общего содержания коллагена 24. Правые легкие окрашивали, а средний Общая площадь окрашивании трихромом за правой секции легких была количественно (фиг.3А). Представительные разделах полученного лечения зависящих утолщение легочной интерстиции и возрастает в фиброзных повреждений (фигура 3В).
Рисунок 1. Общие параметры для получения рабочей процедуры доска. Длины представленные указывают приблизительные размеры, необходимые для создания процедуры аппарат работает. В этих экспериментах, стандарт алюминиевый лист металла был вырезан в соответствующие размеры, затем усиленный с кронштейном "Т".ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок потеря 2. Вес и барьером дисфункция после введения блеомицина. Мышам 2,0 Ед / кг BLM или равным объемом PBS. Потеря (А) Вес выражали в процентах от 0-й день массы (BLM: п = 21; PBS: 5). (B) Мышей умерщвляли на 4 или 10 дней после контакта, и IgM белка в БАЛ из собранных легких измеряли с помощью ELISA. (PBS: п = 5; 4-й день: п = 3; день 10: п = 5). Данные представлены в виде среднего ± SEM. * P <0,05 по сравнению с контролем PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Пневмосклероз после введения блеомицин. (A) Всего коллаген, количественно, как окрашивании трихромом полное изменение раза Массона от управления WT. (B) Типичные изображения трехцветный окрашенных срезов легких, принятых на 5-кратным увеличением. Контроль PBS состоит из животных, принятых от 5 до 14 дней лечения после PBS (PBS: п = 5; день 10: п = 5; 17 день: п = 3). Данные представлены в виде среднего ± SEM. * P <0,05 по сравнению с контролем PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В случаях, когда аэрозолизации непрактично из-за ограниченной доступности реагентов, безопасности или стоимости, непосредственное введение трахеи является превосходным способом доставки экзогенных агентов в легкие 16 транстрахеальная закапывания широко используется для достижения этой цели. Однако, как и со всеми хирургического вмешательства, он также несет с собой потенциал для осложнений, вызванных самой процедуры, а не обязательно агент будучи привили. 13 По этим причинам, он становится все более распространенным для введения вещества непосредственно в трахею с помощью интубации 16,17,18,19,20. Тем не менее, эти методы также страдают от ограничений, в том числе расширенные время восстановления благодаря использованию мощных седативных как кетамин / ксилазином неопределенность относительно установки катетера (т.е.., В пищевод, а не трахеи), ненужные манипуляции тканей в ротовая полость, и расходы, связанныес покупкой специализированные инструменты, такие как отоскопы / ларингоскопов.
После создания подход, изложенный здесь предусмотрено несколько значимых преимуществ по сравнению с другими протоколами интубации. Во-первых, использование изофлуран позволяет уменьшить в общем времени, затраченного на мышь. Это в первую очередь из-за сокращения времени, необходимого для животных очнуться следующие изофлурановым седации по сравнению с контролируемых веществ, таких как кетамин (около 5 мин против иногда больше, чем 3 часа). 14 Кроме того, времянки спирометр обеспечивает уверенность в успехе, позволяя исследователю визуализировать колебательное PBS пузырь, который указывает правильное размещение вводимого вещества до и после закапывания. Наконец, путем использования внешнего источника света вместо громоздкой отоскопа или ларингоскопа и направляющей проволоки, исследователь способен уменьшить количество оборудования в своих руках, при одновременном повышении их мнению Oе полости рта и снижает их шансы повреждения мягких тканей, окружающих трахеи.
Конкретные проблемы, связанные с этим протоколом мало, но серьезно. Например, в то время как использование изофлуран сокращает время, связанное с индукцией и восстановления от седативного, она также требует строгого наблюдения состояния седации животного. Отказ от удаления животного из изофлурановым камере своевременно может привести к смерти, особенно у животных уже восстанавливается после предыдущего выступления. И наоборот, недостаточное ИФ дозировка и расширенные процедурные раз может привести к животным приходя в сознание во время самой процедуры, которые также могут привести к травмам. Поэтому крайне важно как для безопасности животного и целостности эксперимента, что животное возвращается к изофлурановым камере при первых признаках сознания. Так как это может быть общим, когда изучение этого метода, рекомендуется вопытные исследователи подтверждают успешное введение каждого животного, прежде чем обезболивающее следующий. Кроме того, исследователи, имеющие трудности могут также выбрать, чтобы расширить ИФ экспозицию для увеличения доступной процедурный время, при условии, что они внимательно следить за животными для moribundity.
Дополнительной проблемой этого метода является то, что из повреждений, связанных с обработкой. Это особенно вероятно в течение трех этапов: при снятии язык изо рта, при вставке катетер, и когда выбивании шприцы со ступицей после лечения. Размещение катетера на сегодняшний день наиболее опасным из этих шагов. Важно отметить, что катетер не должен входить в полость рта, пока вид трахеи не является идеальным. Если трахея не может быть приведен в целях посредством манипулирования либо источника света или депрессором, исследователь должен освободить язык и повторить попытку процедуру. Манипуляции с мягкими тканями, окружающими трахеи IS не требуется и не рекомендуется. Однако, как только катетер был правильно установлен, следует также принимать меры для сохранения ступицу от продвижения слишком далеко в трахею и перфорации основного стебля бронхов. Это может правило, следует избегать, гарантируя, что катетер только слегка прикреплен к цилиндра шприца, и подпирая рукой, содержащий катетер против процедурной платы таким образом, чтобы оно остается неизменным. Эти нюансы, вместе с необходимостью своевременности и точности, подчеркивают важность подготовки и практики в совершенствовании этой процедуры. Тем не менее, с обучением должна быть возможность для начинающий исследователь для лечения 20 или больше животных в течение часа, а для опытных исследователей, чтобы завершить в два раза больше и больше.
Консистенция сообщаемая прямого осаждения трахеи сделала его предпочтительным путем введения в последние годы. На самом деле, подобные методы уже сообщалось для множества разрозненных матриалов таким образом 19,25. В соответствии с такими протоколами, доставка блеомицин в порядке, изложенной здесь привело к мощному фиброзной реакции в обоих легких, и во всех долях, предлагая аналогичный уровень глубины и равномерности в распределении. Исходя из этого, вполне вероятно, что этот протокол обеспечивает сопоставимые экспериментальные преимущества для целого ряда других материалов, которые полагаются на контакт с посредником их последствий (например., Фармацевтические препараты, антитела, бактериальные агенты, а также в системах модификации естественных белков, таких как лентивирусов векторов) , и что, как блеомицин, это позволит такие эксперименты также проводиться с уверенностью, небольшой расход, и минимальным послеоперационного ухода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят Брайан Джонсон из гистологии и визуализации керн при Университете штата Вашингтон за помощь в окрашивании трихромом и анализа. Эта работа была поддержана NIH гранты HL098067 и HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
