唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

Introduction

健康な組織の担保破壊は、癌治療の有害な副作用の数を占めています。放射線分野でうそをつく大唾液腺の一部または全部は、必然的に破壊されます。従って、骨髄移植の前頭部および頸部癌、子宮頸癌、リンパ腫、または全身照射のための放射線治療を受けている多くの患者は、放射線、唾液腺機能低下^2-6の最も一般的かつ永続的な副作用の一つを被ります。

唾液腺の流体生産腺房細胞は、放射線への急性敏感です。唾液腺の損傷は、唾液機能低下と呼ばれる状態を唾液の流れの大幅な逓減を引き起こします。唾液の流れにおける慢性の減少は、咀嚼、嚥下、スピーチ、そして味が、激しい痛み、粘膜涙、嚥下障害、日和見感染症の病的後遺症などの重要経口活動を阻害し、虫歯が悪化します患者の幸福と機能^2,3。

放射線治療関連の唾液細胞の損失は不可逆的であるため、口腔乾燥症のない矯正治療はありません。人工唾液代用とprosecretory薬で症状を和らげに焦点を当て現在の治療は長期の救済⁶には無効です。改良された放射線送達技術は、症状の重症度を減少させる助けているが、正常組織毒性とその合併症は、がん治療^6,7の制限要因のまま。放射線治療に関連する合併症を予防するための先制措置は、従って、標準になりつつあります。フリーラジカル酸素種を除去ラジオ保護剤、里親細胞再増殖、またはDNA修復を高めるためには、唾液機能低下^8-11を回避するために探索されています。

外分泌唾液腺の分泌物は、主排泄ダクトを介して口の中に排出します。目の口腔内挿管造影剤の注入のための電子排泄ダクトは外来処置として日常的に行われます。同様のアプローチを利用して、唾液腺に直接局所治療¹²の対象とすることができます。別に全身副作用のリスクを減少させるから、retroductal腺点滴は利益を追加しました。乳管ツリーの周りの唾液細胞の単層の配置は、すべての唾液腺上皮細胞をターゲットにすることを可能にし、不要な治療拡散を低減するための障壁として腺行為の繊維状のカプセル化。本質的には、唾液腺は、このような放射線誘発唾液機能低下などの腺苦痛の標的治療のために最適に適しています。

週間の期間のための - （2.5 Gyの/分数/日、5日の週1.8）癌治療のための従来の放射線が少量で提供されています。したがって、実験モデルにおいて長引く放射スキームに対する有効性を示している放射線防護の治療は、より大きな臨床ベアリングを持っています。 COMPRO分別放射線は小動物に記録されたが、放射線源、用量分画、および使用されるプロトコルは^9,10,13変化された後、唾液機能mised。

このレポートでは、患者関連の放射線源と線量分画を用いてラット顎下腺の放射線へのローカライズさretroductal送達のための方法を確立します。

Protocol

すべての手順はLSU健康、シュリーブポート、動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理と使用のためのNIHガイドラインに従ってありました。

ラット顎下唾液腺の1カニューレ挿入

1. シリンジ-チューブアセンブリの調製
   1. メスでPE10ポリエチレンチューブの10cmの長さをカットします。人差し指と親指の間のチューブの両端を持ちます。穏やかな炎上記チューブの中央部分を熱し、ゆっくり両側を引っ張ることにより、その長さを倍増させる軟化チューブを伸ばします。
   2. 先細端部と各- 2カニューレを取得するために45 ^Oの角度でメスで途中でチューブをカットします。 0.5ccのインスリン注射器の29 Gの針の上にフィットさせることによって、カニューレの非テーパ状の端部を展開します。
   3. カニューレを外し、シリンジに生理食塩水の220μLを描きます。気泡を取り除くために、タップします。 cannulを取り付け針の上に、そして空気を排出し、カニューレを介して、溶液の自由な流れを確保するために、シリンジのプランジャーを押してください。 200μlに音量を調整します。
2. 顎下腺ダクトの口腔内カニューレ挿入
   注：オートクレーブ楽器は手続きの前に、ホットビーズ滅菌器の手順の間に、滅菌します。
   1. スプラーグドーリーラットを計量し、皮下注射器で計算されたケタミンの量（42 mgの/キログラム）/キシラジン（8mg / kg）/アセプロマジン（1.4ミリグラム/キログラム）のミックスを分注します。
   2. 人差し指の間尾と片手の親指の付け根を把握し、それを把握するために身体の上にもう一方の手をスライドさせることにより、動物を拘束。親指と残りの指で胴体を保持しながら、頭部の側面に沿って人差し指と中指を立てます。
   3. 後肢の筋肉組織に麻酔薬を注入します。つま先のピンチと眼瞼反射によって麻酔の深さを確認してください。乾きしばらくのを防ぐために目の潤滑剤を塗布動物は麻酔下です。
   4. 特別に設計されたプラットフォーム（ 図1）に動物を置き、横バーの上側切歯に係合します。下の切歯の周りにゴムバンドをループし、プラットフォームにそれを固定することにより、下顎をプルダウン。
   5. 舌を通して滅菌縫合糸を渡し、口の床を上げるためにそれを持ち上げます。止血鉗子で縫合糸をクランプ、および横方向のバーの上にそれを渡します。
   6. カスタムビルドの頬スプレッダー（ 図1）と頬を展開し、解剖顕微鏡下で、口の床の上に舌下乳頭を探します。
   7. 繊細な鉗子を用いて行うPE10チューブのテーパ状の端部をつかみます。そっと舌下乳頭上の腺管開口部にカニューレの先端を操作します。それは3ねじ込むことによって、カニューレの配置を確認してください - ダクトに5ミリメートルを。それは、任意の障害物なしに通過することを確認してください。
3. 顎下腺Instillation
   1. 首筋に皮下アトロピン（0.5ミリグラム/キログラム）を注入し、唾液分泌の減少のために10分を待ちます。
   2. シアノアクリレート（接着剤）の低下にダクト開口部にカニューレを固定し、乾燥させます。ゆっくり〜50マイクロリットル/分の速度でシリンジプランジャを押して腺（200μL/腺）溶液を植え付けます。
   3. 止血鉗子でチューブをつぶす、と慎重に注射器を取り外します。動物が意識を取り戻すまで60分 - 30用のダクト内チューブを保持します。舌を保持している縫合糸を外します。
   4. 別々のケージに動物を移し、リカバリ中にそれを暖かく保つために加熱ランプを使用しています。それは胸骨横臥を維持するために意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
   5. 動物が完全に歩行した後、食物および水に無制限にアクセスできるビバリウムでそれを収容します。

2.ローカライズ分割照射顎下腺の

1. 前述したように動物を拘束し、後肢でケタミン（33 mgの/キログラム）/キシラジン（6ミリグラム/キログラム）/アセプロマジン（1ミリグラム/キログラム）ミックスの筋肉内投与で麻酔。麻酔の深さを確認し、目に潤滑剤を塗布。
2. 線形加速器卓上に動物仰向けに置き、頭を傾けることによって、その首を拡張します。胸骨の上部に下顎骨の下縁からの領域を包含するように照射野（3センチスリット幅）をコリメートします。
3. 領域の上に1cmの組織等価ボーラスを配置し、放射線源100センチボーラスの頂部との間の距離を調整します。
4. 線形加速器の6 MV光子ビームを用いて動物（2.5 Gyの）を照射します。線量率、視野サイズ、及び放射線源からのボーラスの表面までの距離は、露光時間を決定するであろう。現在のセットアップでは、動物は約1グレイ/分の線量率で照射しました。
5. 露出を繰り返します。 2.5 Gyの/ 8日目の合計日々;間で2日間隔で4日/週。リカバリ中に動物を暖かく保ちます。それは完全に歩行した後に飼育箱に動物を転送します。
6. 腺機能^14を測定するために、8週間照射後刺激顎下腺の唾液を収集します。冷たい4％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水のpHが7.2の心臓灌流によって麻酔下で動物を安楽死させます。組織学的および免疫組織化学^14を分析するための顎下腺を摘出。

Representative Results

低侵襲性唾液腺撮影技術、大唾液腺の局所治療を適応させることが可能です。ラット顎下唾液腺におけるRetroductal投与はウォートンのダクトの口腔内挿管（ 図2）により実行しようとしました。ウォートンの唾液管は、口の階にある舌乳頭に開くが、オリフィスは容易には見えません。カニューレの挿入は、従って、穏やかなプロービングすることによって行いました。カニューレを配置しながら厄介な出血やダクトの穿孔を避けるために、何の力は使用しませんでした。ダクト内のカニューレの滑らかな抵抗無通路は、チューブを穏やかに前後に移動することにより確認しました。

最初の実験の間にカニューレ挿入は（図3）、ヘマトキシリンまたはトリパンブルー溶液を用いて腺を注入し、安楽死させた動物において腺染色を評価することにより確認しました。 GLそしてボリュームが摘出腺における乳管ツリーの染色を可視化することにより確認した埋めます。 150計量動物について - 液の250μlの - 250グラムを、腺の完全な充填は200で達成されました。急速注入は、腺の圧力を高め、怪我やbiospreadのリスクを高めることができます。組織破壊を回避するために、溶液を約50μL/分の速度で徐々に投与しました。

ラット顎下腺は放射線¹⁵に対する感度の耳下腺に匹敵します。彼らは選択的に深刻なオフターゲット効果（ 図4）を発生させずに照射できるので、顎下腺を検討しました。口腔および動物の健康および実験結果に口腔粘膜炎や急性口腔乾燥の影響を最小限に耳下腺の大容量のスペアリング。ラットでの私たちの以前の研究は、放射線^11,16が、FRACのシングル、大用量を用いて実施しましたtionated投薬は、臨床診療へのより適切です。動物の頸部は、したがって、放射線の少量に毎日曝露しました。皮膚表面の近くに位置する顎下腺内の放射線量の均一な蓄積を達成するために1.03グラム/ ccの密度を有する均質なゲルから作られた軟組織等価ボーラスは、放射線の間の首の上に置きました。

8週で2.5 Gyの刻みに毎日の暴露が急激に唾液の分泌を低下させた後の放射線ショーを決定した唾液の流れに分割放射線スキームの効果。 （; 図5両面スチューデントt検定、p ^<0.01）14唾液出力の近くに10倍の減少は、非照射動物とは対照的に照射された動物で記録しました。結果は、動物における放射線誘発唾液機能低下の確立を確認しました。

図カスタマイズされたプラットフォームの1構築とチーク・スプレッダー。硬い4ミリメートルのワイヤが示すように、3辺の長方形（11センチメートル高さX 13センチ幅）に折り曲げた後、横バーが中央に頭を下げました。ワイヤの端部は、ループに曲げられ、ネジは、プラスチック基板（24センチメートル長×15センチメートル幅×0.8センチメートルの深さ）にアセンブリを固定するためにそれらを通過させました。中央ねじは、ワイヤアセンブリに5cmの後方に挿入しました。これは、下顎を開いて引っ張っゴムバンドを固定するのに役立っ挿入図：フレア端部を有する「U字型」の使い捨て厚さ1mmの針金を曲げで作られた、特注の頬スプレッダー。プラスチック製のチューブは、ワイヤが頬粘膜への損傷を防ぐために、終了を介して通過させた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図2.ラット顎下腺排泄ダクトのカニューレ挿入。舌は口の床を上昇させる上昇させ、およびポリエチレンカニューレは、口の階にある顎下ダクト開口部に挿入した。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

テクニックを確認するために、顎下腺におけるヘマトキシリンソリューションの図3.注入。グランド染色は、顎下腺内の溶液の投与が成功を証明します。左上隅の舌下腺が染色されていないことに注意してください。非注入制御腺が左側に表示されます。e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

照射のための動物の図4.配置。動物は、線形加速器のテーブルの上に仰向け敷設されており、頭は首を拡張するために戻ってというタイトル。コリメートされたスリット幅3 cmであった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

顎下腺機能。生理食塩水に分割放射線の図5.影響は、放射線の前に顎下腺に点眼しました。動物の首を8日間2.5 Gyで/日の分画に照射しました。ダット示した8週間の放射スキームの完了後に刺激された顎下唾液流量の平均±SEMです。図は、ヒト遺伝子治療、メアリー・アンLiebertの社の出版社¹⁵から著作権の許可を得て複製されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

唾液腺は、多くの場合、頭頸部癌、首ノードの選択科目切除、または地域の血液悪性腫瘍に対する放射線治療を受けた患者における組織回復のしきい値を超えた放射線量を受けます。腺の流体を分泌する腺房細胞が最終的に分化しているが、それらは逆説的に放射線に敏感です。分泌機能は、放射線の最初の数週間以内に低下し、慢性低唾液出力の不可逆的な腺の損傷をもたらします。貧しい腺機能とすさまじい口腔乾燥に対抗するために、保存または分泌機能の回復は非常に重要です。小説から保護または放射線損傷を修復する治療法が^1を検討されている^{、8-11、16-20。}

治療の全身投与は、非標的組織における望ましくない影響の固有のリスクを運びます。唾液腺へ向けた配信は、このリスクを減少させます。 Retroductal遺伝子治療は、予防またはに有効です放射線関連唾液腺苦悩^{​​1、9-、11、16,17,20を}改善。しかし、同じ技術を使用して、唾液腺はまた、異所性、タンパク質を発現および分泌するように再設計することができます。唾液腺細胞における基底内分泌分泌経路を利用し、血液中への導入遺伝子の発現とホルモンの分泌は^、21を達成することができます。唾液腺への遺伝子導入は、従って、効果的に特定の内分泌障害の補正に拡張することができます。

小動物における唾液腺管のカニューレ挿入が難しいことができますが、実際には、技術を磨きの中心です。カニューレのテーパ状の端部は、挿入時に簡単によじれ、および注入が困難になることができます。解決策を排出しながら、背圧の増加は、チューブで曲げ、および再カニュレーションダクトに必然的にあらかじめ警告すべきです。口を制限する病理とともに、このような異常なダクトオリフィス又は増加したダクトの蛇行などの解剖学的変動、開口障害や粘膜下線維症のような開口部は、顎下腺の配信挑戦することができます。非透過性色素の注入は、技術を実施する場合は、正確な配達の有用な指標とすることができます。カニューレの適切な配置と穏やかな、抵抗のない注入は、手順の成功のための重要な要素です。

癌患者は、しばしば、線形加速器で生成された超高圧光子で処理されます。放射線は、数週間にわたって少量で毎日配信されます。線量分割は、健康な組織上の毒性を低減し、腫瘍を感作させるために放射線の間の回復の期間を提供します。線形加速器の高度に貫通するエネルギービームは、深部腫瘍の治療に有用です。そして、肌に近い腫瘍の治療のために、組織相当ボーラスは、光子侵入深さを低減するために使用されます。ローカルsubmaを照射するための臨床実践と同様に、線形加速器送達分別放射線を使用することができます小動物のndibular腺。しかし、すぐに皮膚の下腺の位置は、腺内、> 90％の放射線量を達成するためにボーラスの配置を必要とします。ボーラスの厚さは、光子のエネルギーと組織浸透の所望の深さに応じて算出されます。

この記事では、我々はretroductal顎下腺の点滴注入およびラット顎下腺のローカル分割照射を行うための実験的なガイドラインを提供しています。強調表示された方法は唾液腺放射能毒性の分野に進出研究者のための実験のセットアップを支援することが私たちの希望です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic Polyethylene tubing (PE10)	Becton Dickson	427401
1/2 cc Insulin Syringe U-100	Becton Dickson	309306
Artificial Tears	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand silk suture	Ethicon	K833H
Graefe forcep	Fine Science Tools	11051-10
Olympus SZX16 Stereo Microscope	Hunt Optics and Imaging
6 MV Linear Accelerator	Elekta
Bolus - Skinless	Civco	MTCB410
Heat Lamp	Braintree Scientific	HL-1 110V