Introduction
destruição colateral dos tecidos saudáveis é responsável por uma série de efeitos colaterais deletérios dos tratamentos de câncer. Uma parte ou a totalidade das glândulas salivares maiores que se encontram com os campos de radiação são inevitavelmente destruídos. Portanto, a maioria dos pacientes submetidos à radioterapia para câncer de cabeça e pescoço, linfoma do colo do útero, ou a radiação de corpo inteiro antes do transplante de medula óssea sofrem um dos efeitos adversos mais comuns e persistentes de radiação, glândula salivar hipofunção 2-6.
As células acinares produtoras de fluido das glândulas salivares são extremamente sensíveis à radiação. Os danos para as glândulas salivares provoca uma diminuição drástica do fluxo salivar, uma condição referida como hipofunção salivar. A redução crônica do fluxo salivar prejudica principais atividades orais, tais como mastigação, deglutição, fala e gosto, mas as sequelas mórbido de intensa dor, as lágrimas das mucosas, disfagia, infecções oportunistas e cárie dentária piora abem-estar e função de 2,3 paciente de.
Uma vez que a perda de células salivar associada a radioterapia é irreversível, não há nenhum tratamento correctivo de xerostomia. O tratamento actual que incide sobre assuaging sintomas com substitutos salivares artificiais e drogas prosecretory é ineficaz para alívio de longo prazo 6. Embora a melhoria das técnicas de aplicação de radiação ter ajudado a diminuir a gravidade da condição, a toxicidade do tecido normal e as suas complicações continuam a ser um factor limitante no tratamento de cancro 6,7. medidas preventivas para evitar complicações associadas à radioterapia são, portanto, tornando-se a norma. Agentes radioprotetores que limpam espécies de oxigênio de radicais livres, repovoamento celular adotiva, ou melhorar o reparo do DNA estão sendo exploradas para evitar a hipofunção salivar 8-11.
Secreções das glândulas salivares exócrinas escorrer para dentro da boca através dos principais ductos excretores. punção intra-oral de the ductos excretores para injeção de agentes de contraste é feito rotineiramente como um procedimento ambulatorial. Utilizando uma abordagem similar, glândulas salivares podem ser directamente alvo de tratamento localizado 12. Além de reduzir o risco de efeitos colaterais sistêmicos, retroductal instilação glândula adicionou benefícios. O arranjo de monocamada de células salivares em torno da árvore ductal permite a segmentação de todas as células epiteliais salivares, e a encapsulação fibrosa dos actos de glândula como uma barreira para reduzir a propagação indesejada terapêutico. Em essência, as glândulas salivares são perfeitamente adaptados para o tratamento alvo de aflições da glândula, como a hipofunção salivar induzida por radiação.
radiação convencional para o tratamento do câncer é entregue em pequenas doses (1,8-2,5 Gy / fração / dia, cinco dias por semana) por um período de semanas. Portanto, uma terapêutica de rádio-protetora que mostra eficácia contra um esquema de radiação prolongada em modelos experimentais tem maior rolamento clínica. Comprofunção salivar mised após a radiação fracionada foi gravada em pequenos animais, mas fonte de radiação, a fração de dose e protocolos utilizados são variados 9,10,13.
Este relatório estabelece métodos para a entrega retroductal para e radiação localizada do rato glândula submandibular usando fonte de radiação no paciente relevante e fração dose.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pela Saúde LSU, Shreveport, Animal Care e do Comitê Use e estavam em conformidade com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. A canulação do Rat Submandibular glândulas salivares
- Preparação da Seringa-Tubing Assembléia
- Cortar um comprimento de 10 cm de tubagem de polietileno PE10 com um bisturi. Segurar as duas extremidades da tubagem entre o dedo indicador e o polegar. Aqueça a parte do meio da tubulação acima de uma chama suave e delicadamente esticar o tubo amolecida para dobrar seu comprimento puxando ambos os lados.
- Cortar o tubo no meio com um bisturi, num ângulo de 45 ° para obter duas cânulas - cada um com uma extremidade afilada. Expandir a extremidade não-cónica da cânula de encaixe ao longo de uma agulha 29 G de 0,5 cc seringa de insulina.
- Remover a cânula, e chamar a 220 ul de solução salina para dentro da seringa. Toque para desalojar bolhas de ar. Montar o cannulum sobre a agulha e empurre o êmbolo da seringa para expelir ar e assegurar um fluxo livre de solução através da cânula. Ajustar o volume para 200 ul.
- Canulação Intra-Oral de Submandibular Gland Duct
NOTA: instrumentos Autoclave antes do procedimento, e esterilizar in-between procedimentos em um esterilizador quente talão.- Pesa-se o rato Sprague Dawley, e dispensar o volume calculado de cetamina (42 mg / kg) / xilazina (8 mg / kg) / acepromazina (1,4 mg / kg) mistura de uma seringa hipodérmica.
- Conter o animal segurando-o pela base da cauda entre o dedo indicador eo polegar de uma mão e deslizando a outra mão sobre o corpo para segurá-lo. Coloque o dedo indicador e médio ao longo dos lados da cabeça, enquanto segurar o torso com o polegar e os dedos restantes.
- Injetar o anestésico na musculatura dos membros posteriores. Confirmar profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e do reflexo palpebral. Aplique lubrificante olho para evitar a secura enquantoanimal está sob anestesia.
- Colocar o animal sobre uma plataforma especialmente concebido (Figura 1), e acoplar os dentes incisivos superiores na barra transversal. Puxar o maxilar inferior para baixo passando uma faixa de borracha em torno dos incisivos inferiores e ancorando-lo para a plataforma.
- Passe uma sutura estéril através da língua e levante-o para levantar o assoalho da boca. Prenda as suturas com uma pinça hemostática, e passá-lo por cima da barra transversal.
- Expandir as bochechas com um mordente espalhador feito sob medida (Figura 1), e sob um microscópio de dissecação localizar as papilas sublingual no chão da boca.
- Agarrar a extremidade cónica do tubo PE10 pré-formada usando uma delicada fórceps. Suavemente manipular a ponta da cânula dentro do orifício ductal nas papilas sublingual. Confirmar a colocação da cânula enfiando-o 3-5 mm dentro da conduta; garantir que ele passa sem qualquer obstrução.
- Submandibular Glândula Instillation
- Injectar atropina (0,5 mg / kg) por via subcutânea na nuca do pescoço, e esperar 10 minutos para a redução das secreções salivares.
- Segurar a cânula ao orifício de conduta com uma gota de cianoacrilato (cola), e deixa-se secar. Instilar a solução na glândula (200 ul / glândula) pressionando-se lentamente o êmbolo da seringa a uma taxa de ~ 50 mL / min.
- Esmagar o tubo com uma pinça hemostática, e remova cuidadosamente a seringa. Manter o tubo no duto de 30 - 60 min até que o animal recupere a consciência. Remover o fio de sutura que mantém a lingueta.
- Transferir o animal para uma gaiola separada, e usar uma lâmpada de calor para mantê-lo aquecido durante a recuperação. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência para manter decúbito esternal.
- Depois que o animal é totalmente ambulatorial, abrigá-lo no biotério, com livre acesso a comida e água.
2. Localizada fracionado Irradiaçãoda glândula submandibular
- Conter o animal, tal como descrito antes, e anestesiar com a administração intramuscular de cetamina (33 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) / acepromazina (1 mg / kg) mistura no membro posterior. Confirmar profundidade da anestesia, e aplicar lubrificante para os olhos.
- Coloque o supino animal na mesa acelerador linear, e estender o pescoço inclinando a cabeça. Colimar o campo de radiação (3 cm de largura de fenda) para abranger a área do bordo inferior da mandíbula para a parte superior do esterno.
- Coloque um bolus de tecido equivalente 1 cm sobre a região, e ajustar a distância entre a origem eo topo do bolo para 100 cm de radiação.
- Irradiar o animal (2,5 Gy), utilizando um feixe de 6 MV fotões de um acelerador linear. Taxa de dose, tamanho do campo e distância da fonte de radiação para bolus superfície vai ditar o tempo de exposição. No actual definido acima, os animais foram irradiados a uma taxa de dose de ~ 1 Gy / min.
- Repita a exposição; 2,5 Gy / dia durante um total de oitodias; 4 dias / semana, com um intervalo de 2 dias no meio. Manter o animal aquecido durante a recuperação. Transferir o animal para biotério após ele é totalmente ambulatorial.
- Recolha estimulada submandibular da glândula salivar 8 semanas após a radiação para medir a função da glândula 14. Euthanize animais sob anestesia por perfusão cardíaca de frio paraformaldeído a 4% / tampão fosfato pH 7,2. Extirpar a glândula submandibular para histológica e imuno-histoquímica 14.
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Representative Results
Adaptar uma técnica sialografia minimamente invasivo, o tratamento local das glândulas salivares maiores é viável. Retroductal administração em ratos glândulas salivares submandibulares foi tentada por punção intra-oral de condutas de Wharton (Figura 2). Os canais salivares de Wharton abertos nas papilas sub-lingual, localizado no chão da boca, mas os orifícios não são facilmente visíveis. A inserção da cânula foi, por conseguinte, feito por sondagem suave. Para evitar sangramento nociva ou perfuração do duto, nenhuma força foi usada ao colocar a cânula. passagem livre de resistência lisa da cânula no ducto foi confirmada por trás e para a frente suave movimento do tubo.
A canulação durante as experiências iniciais foi confirmada por infusão da glândula com hematoxilina ou solução de azul de tripano, e avaliar a coloração glândula em animais sacrificados (Figura 3). Gle volume de enchimento foi verificada por meio da visualização coloração da árvore ductal in glândulas extirpados. Para os animais pesando 150 - 250 g, o enchimento completo da glândula foi conseguida com 200 - 250 ml de solução. infusão rápida pode aumentar a pressão glândula e aumentar o risco de lesões e biospread. Para evitar a destruição do tecido, a solução foi gradualmente administrada a uma taxa de ~ 50 mL / min
As glândulas de rato submandibular são comparáveis às glândulas parótidas em sua sensibilidade à radiação 15. Glândulas submandibulares foram estudados, pois eles podem ser irradiados selectivamente sem incorrer em graves efeitos fora do alvo (Figura 4). Poupadores da cavidade oral e um grande volume das glândulas parótidas minimizou a influência da mucosite oral e xerostomia aguda sobre a saúde animal e o resultado experimental. Nossos estudos anteriores em ratos foram realizadas com grandes doses individuais, de radiação 11,16, mas fracdosagem tionated é mais pertinente para a prática clínica. A região do pescoço do animal foi, por conseguinte, expostos diariamente a pequenas doses de radiação. Para atingir uma acumulação de dose de radiação uniforme dentro das glândulas submandibulares localizados perto da superfície da pele, um bolus de tecido mole-equivalente feita a partir de um gel homogéneo com uma densidade de 1,03 g / cc foi colocada sobre o gargalo durante a radiação.
O efeito do esquema de radiação fracionada no fluxo salivar, determinada a 8 semanas programa de pós-radiação que a exposição diária a incrementos de 2,5 Gy redução do fluxo salivar vertiginosamente. Uma redução de perto de 10 vezes na saída de saliva foi gravado em animais irradiados em contraste com animais não irradiadas (teste t de Student 2-sided, p <0,01; Figura 5) 14. Os resultados confirmaram o estabelecimento de hipofunção salivar radiação induzida em animais.
Figura 1. Construção de uma plataforma personalizado e Cheek-espalhamento. Um fio rígido 4 mm foi dobrado em um retângulo de 3 lados (11 cm de altura X 13 cm de largura), como mostrado, ea barra transversal andava curvada no centro. As extremidades do fio foram dobrados em laços, e os parafusos foram passados através deles para fixar o conjunto a uma placa de plástico (25 cm de comprimento x 15 cm de largura x 0,8 cm de profundidade). Um parafuso central foi inserido cinco centímetros posterior à montagem de arame. Serviu para ancorar o elástico que abriu a mandíbula inferior Detalhe:. A custom-built bochecha espalhador feito de um descartáveis 1 mm de espessura arame dobrado em uma "forma de U" com as extremidades alargadas. Tubos de plástico foram passados sobre as extremidades dos fios para evitar danos à mucosa bucal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. A canulação do rato das glândulas submandibulares Excretores dutos. A língua é levantada para elevar o assoalho da boca, e polietileno cânulas foram inseridos nos orifícios do duto submandibular localizados no assoalho da boca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Figura 3. infusão de solução de hematoxilina na glândula submandibular para confirmar a técnica. Glândula coloração atesta a administração bem sucedida da solução na glândula submandibular. Note-se que a glândula sublingual no canto superior esquerdo não está manchada. Uma glândula controlo não-infusa é mostrado à esquerda.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Colocação do animal por irradiação. O animal é colocado em decúbito dorsal sobre a mesa acelerador linear, e a cabeça intitulado volta para estender o pescoço. A largura da fenda colimado foi de 3 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Efeito da radiação no fracionado submandibular Glândula Function. Saline foi instilada nas glândulas submandibular antes de radiação. O pescoço do animal foi irradiada em fracções de 2,5 Gy / dia durante 8 dias. o datum mostrados são a média ± SEM de taxa de fluxo salivar estimulada submandibular 8 semanas depois da conclusão do regime de radiação. A figura é reproduzido com permissão de direitos autorais de Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. publisher 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
glândulas salivares muitas vezes recebem doses de radiação além do limiar da recuperação do tecido em pacientes submetidos à radioterapia para cancro do pescoço, ablação eletiva de linfonodos cervicais, ou malignidades hematológicas regionais. Embora as células acinares secretoras de fluido da glândula são terminalmente diferenciado, elas são paradoxalmente sensível à radiação. A função secretora cai dentro das primeiras semanas de radiação, e irreversíveis glândula dano resultou em uma produção crônica de baixo saliva. Para combater a má função da glândula e secura da boca que se segue, a preservação ou restauração da função secretora é crucial. Os novos tratamentos para proteger contra ou reparar os danos da radiação estão sendo investigados 1, 8-11, 16-20.
A administração sistémica de uma terapêutica acarreta o risco inerente de efeitos indesejados nos tecidos não-alvo. entrega destinada às glândulas salivares diminui este risco. terapia genética Retroductal é eficaz na prevenção ouremediar associadas à radiação da glândula salivar aflição 1, 9, 11, 16,17,20. No entanto, utilizando a mesma técnica, glândulas salivares pode também ser redesenhado para expressar e segregar proteínas, ectopicamente. A exploração da via secretora endócrino basolateral em células salivares, a expressão do transgene e a secreção da hormona no sangue pode ser atingido 21. A transferência de genes para as glândulas salivares pode, portanto, ser efectivamente estendida à correcção de certos distúrbios do sistema endócrino.
Embora canulação dos ductos das glândulas salivares em pequenos animais pode ser complicado, a prática é fundamental para aperfeiçoar a técnica. A extremidade cónica da cânula pode dobrar facilmente durante a inserção, e fazer a infusão difícil. O aumento da contra-pressão durante a expelir a solução deve precaver de uma curva do tubo, e a necessidade de re-canular a conduta. As variações anatômicas, como orifício de conduta aberrante ou aumento da tortuosidade duto, juntamente com patologias que limitam a bocaabertura, como trismo ou fibrose submucosa pode fazer a entrega da glândula submandibular um desafio. A infusão de um corante impermeabilizante quando se pratica a técnica pode ser um indicador útil de entrega precisas. colocação adequada das cânulas e infusão suave, livre de resistência são fatores importantes para o sucesso do procedimento.
Os pacientes com câncer são tratados frequentemente com fótons megavoltagem gerados por um acelerador linear. A radiação é entregue diariamente em doses pequenas ao longo de um curso de semanas. Dose fracionamento prevê períodos de recuperação entre as radiações para reduzir a toxicidade nos tecidos saudáveis e sensibilizar tumores. Altamente penetrantes feixes de energia de um acelerador linear são úteis para o tratamento de tumores profundos. E, para o tratamento de tumores mais perto da pele, um bólus de tecido equivalente é utilizado para reduzir a profundidade de penetração de fotões. Semelhante a prática clínica, uma radiação fraccionado acelerador linear entregue pode ser utilizada localmente para irradiar Submaglândulas ndibular de pequenos animais. No entanto, a posição das glândulas imediatamente sob a pele necessita da colocação de um bolus para alcançar> dose de radiação de 90% dentro das glândulas. A espessura do bolo é calculado em função da energia de fotões e a profundidade desejada de penetração nos tecidos.
Neste artigo, nós fornecemos orientações experimentais para a realização de retroductal instilação glândula submandibular e irradiação fracionada local do glândula submandibular de ratos. É nossa esperança que os métodos realçados ajudará configuração experimental para os investigadores se aventurar no campo da radiotoxicidade glândula salivar.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic Polyethylene tubing (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Insulin Syringe U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Artificial Tears | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand silk suture | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcep | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolus - Skinless | Civco | MTCB410 | |
| Heat Lamp | Braintree Scientific | HL-1 110V |
References
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